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酶免疫测试( EIA )技术 翁 锡 全翁 锡 全 广州体育学院. 酶免疫分析技术( enzyme immunoassay,EIA ) 是继荧光免疫技术和放射免疫技术之后建立的一 种非放射性免疫技术,是将抗原抗体反应的高度 特异性和酶的高效催化作用相结合,发展建立的 一种非放射性标记的免疫性标记分析方法。酶免.

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1 酶免疫测试( EIA )技术 翁 锡 全翁 锡 全 广州体育学院

2 酶免疫分析技术( enzyme immunoassay,EIA ) 是继荧光免疫技术和放射免疫技术之后建立的一 种非放射性免疫技术,是将抗原抗体反应的高度 特异性和酶的高效催化作用相结合,发展建立的 一种非放射性标记的免疫性标记分析方法。酶免 疫分析系统则属于开放式的,符合标准的各种品 牌的 ELISA 试剂盒均可应用,且有灵敏度高、特异 性强、酶免疫试剂的性质比较稳定、操作方法简 便、快速、无放射性污染以及应用范围广等很多 优点。

3 酶免疫分析技术 非均相酶免疫分析均相酶免疫分析 非均相液相酶免疫分析 非均相固相酶免疫分析 以聚苯乙烯制品作为载体的酶 联免疫吸附实验 ---ELISA 一、酶免疫测试( EIA )技术分类

4 二、 ELISA 技术方法与原理 ( 1 ) ELISA 特点:在固相表面组装免疫活性物质 形成 " 免疫吸附剂 " ;酶标记免疫活性物质,进 行信号放大;有二步温育反应二次洗涤过程; 灵敏度特异性相对较高。 ( 2 ) ELISA 局限性:只能检测到 ng 水平,精密度 差(批内 CV15-20% );线性范围窄(一个数 量级)。 ( 3 )根据检测目的和操作步骤不同有三种基本方 法:双抗体(原)夹心法 ;间接法;竞争法

5 ELISA 测试原理 1 )将链霉亲合素包被的聚苯乙烯塑料试管安置固定。 2 )将生物素标记的特异性抗体和待测抗原加入链霉亲 合素包被小管内,经温育,生物素和亲和素发生连接, 待测抗原和特异性抗体发生结合,形成固相包被亲合素 - 生物素 - 特异性抗体 - 待测抗原复合物,然后进行洗涤, 除去未结合的抗原和生物素标记抗体。 3 )加入辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的特异性抗体 ( 酶标 抗体 ) ,经温育形成固相包被链酶亲合素 - 生物素 - 特异性 抗体 - 待测抗原 - 酶标抗体复合物,再次进行洗涤,除去 多余的酶标抗体。 4 )加入底物 ABTS 和 H 2 O 2 ,经温育, ABTS 在辣根过氧 化物酶的作用下显色,然后经波长 450nm 的光度计测定 获得 A 值,从标准曲线上计算出待测抗原的含量。

6 三、自动化酶标仪基本工作原理 光源 光路 微孔板 触摸屏电源 单 A/D 转换 程控放大器 多路开关 光电检测 显示器 片 打印机 步进电机驱动 步进电机 送样机构 电源 机 图 2 工作原理方框图 电源

7 四、 ELISA 操作步 ( 1 )试剂的准备 ( 2 )加样 ( 3 )保温 使用恒温水箱 使用保温箱 ( 4 )洗涤 ( 5 )比色

8 五、 ELISA 质量控制 (一)的测试前标本的采集和保存 ( 1 )可作标本广泛,体液(如血清,血浆,各种积液),分 泌物(如唾液)和排泻物(如粪便,尿液)均可。 ( 2 )标本采集时应尽量避免溶血,否则造成假阳性;长菌的 标本同样的道理易产生假阳性。 ( 3 )抗凝不完全的标本因纤维蛋白元的干扰而造成假阳性, 建议尽量不用抗凝血尤其是用肝素抗凝剂。 ( 4 )标本保存:血清置 4 ℃冰箱 5 天内完成测试;一周以上则 要 -20 ℃冰冻保存,融解时应上下颠倒充分混匀。 ( 5 ) ELISA 的灵敏度 >1ng/ml 水平上, 标本间的污染要尽量避 免,尤其不应与生化试验用同一管标本,最起码应先做免疫 后做生化 。

9 (二)仪器质控 ( 1 )移液器: ELISA 加样量小( 5-100 u l ),其准确性直 接影响实验结果,利用称重法检查,一般应在 ±10% 以内; ( 2 )水浴箱:经常检查水浴箱温度计所示的温度和水中 (或温箱内)实测温度是否一致,允许有 ±1 ℃的误差; ( 3 )洗板机:每个厂家设置洗板后的残留液有各自的规 定一般不超过 2ul ,人工扣板时,垫纸不湿,定期检查管 孔是否堵塞; ( 4 )酶标仪:经常维护其光学部分,防止滤光片霉变, 定期检测校正,使其保持良好的工作性能。

10 (三)分析中质控 ( 1 )加样 ( 2 )温育 ( 3 )洗涤 ( 4 )显色 ( 5 )酶标仪判读结果

11 六、 ELISA 操作注意事项 ( 1 )测试之前,冰箱内试剂一定要复温(至室温),并 检查是否已经变质,同时用双蒸水稀释浓缩的洗涤液和稀 释液,若用不合格的蒸馏水则可使空白值增高。 ( 2 )微量加液器应注意保养并定期校正,否则结果误差 较大,同时加样时不可出现气泡,以免反应物间不能充分 混匀反应。 ( 3 )温育时要力求受热均匀,同时避免液体蒸发。 ( 4 )洗涤时力求次数足够,且避免形成气泡,否则洗涤 不完全。 ( 5 )比色时反应管内不能留有气泡,管底不能存有水滴, 否则出现较大误差。

12 七、影响 ELLSA 测试结果常见问 题原因及解决方法 1. 选择试剂 2. 加样 3. 孵育 4. 洗板 5. 显色 6. 终止 7. 读板

13 八、、 RT-2100C 型多功能酶标仪仪 器特点: 1 、 RT-2100C 可广泛应用于传染病、肿瘤标志物、血液病、 艾滋病、内分泌障碍测定等临床论断领域。 2 、大屏幕汉化界面,利用触摸屏和笔作为输入方式,极大 地方便了用户的操作输入。 3 、 100 个可编程的检验项目。 4 、多种定量、定性计算方法 5 、 96 孔可视化布板,空白位、对照位、样本位、标准品位 任意设置,同一板上可同时进行最多 12 个项目的测试。 6 、 8 通道检测迅速准确 (<5 秒 / 板 ) ,测试前的震动混匀功能。

14 7 、大容量历史数据保存,最多可保存 500 个项目, 1000 个 病人, 10000 条样本记录。 8 、形式多样的综合中文报告输出,支持多种品牌系列的外 置打印机。 9 、强大的网络功能:可与医院内部计算机网络、质量监测 中心及雷杜用户服务中心联网,为工作带来极大的便捷。 10 、配合使用雷杜酶标实验室管理系统,可以在联网计算 机上进行数据管理和分析。 11 、辅助管理功能:内置科室数据库、医生数据库和系统 日志数据库。

15 九、 RT-2100C 型多功能酶标仪常用 测试项目 ( 1 ) 肝炎类:甲肝抗体 IgM 、乙肝两对半、丙、丁、戊、庚性肝炎 抗体等 ( 2 )传染病类:爱滋病、衣原体、肺炎支原体、腺病毒、幽门螺旋杆 菌、腮腺炎、麻疹、水痘、百日咳杆菌、流行性出血热、狂犬病等。 ( 3 )肿瘤标志物类:卵巢癌、乳腺癌、胃肠道癌、癌胚抗原、甲胎蛋 白、膀胱癌、铁蛋白等。 ( 4 )内分泌类: T 3 、 T 4 、促卵泡生成素 (FSH) 、黄体生成素 (LH) 、泌 乳素 (PRL) 、人绒毛促性腺激素 (HCG) 、睾酮 (TESTO) 、孕酮 (PROG) 、雌二醇 (E 2 ) 、雌三醇 (E 3 ) 、生长素 (HGH) 、促甲状腺素 (TSH) 、皮质醇或皮质酮 (C) 、促红细胞生成素 (EPO) 等。 ( 5 )自身抗体类: ENA 全套 6 项筛选、抗核抗体、抗 Sm 抗体、抗精子 抗体、抗双链 / 单链 DNA 、红斑狼疮筛选等。 ( 6 ) Torch 类、病毒感染类:弓形虫、巨细胞病毒、风疹病毒、单纯 疱疹病毒等。 ( 7 )细胞因子类:白细胞介素、可溶性 CD 抗原。

16 十、 RT-2100C 型酶标仪基本操 作步骤 ( 1 )开机,待机器自行检测稳定 ( 2 )项目设置: RT-2100C 所有项目均由用户 自行定义,最多允许设置 100 个项目。用户已 经设置的项目均在窗口中列表显示,关机时自 动保存。 ( 3 )样品测试 ( 4 )综合报告

17 实验操作项目: 血清睾酮的定量测定


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