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四 蛋白质的四级结构 (quaternary structure) 是指亚基间的空间排布、亚基间相互 作用与接触部位的布局,不包括亚基本 身的空间结构。亚基间以次级键相连, 绝无共价键 1. 概念.

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1 四 蛋白质的四级结构 (quaternary structure) 是指亚基间的空间排布、亚基间相互 作用与接触部位的布局,不包括亚基本 身的空间结构。亚基间以次级键相连, 绝无共价键 1. 概念

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3 蛋白质分子由两条或两条以上肽链组 成,每条肽链各自形成了独立的三级 结构,分子中的每一个具有独立三级 结构肽链, 称为亚基 亚基 (subunit) 2. 维持蛋白质四级结构的作用力 主要是疏水作用 次级键 盐键、氢键

4 第三节 蛋白质结构与功能的关系 (一) 一级结构是空间构象的基础 一、蛋白质一级结构与功能的关系 以 124 个氨基酸残基组成的牛胰核糖 核酸酶( 4 对二硫键)为例说明

5 牛胰核糖核酸酶的变性与复性 β- 巯基乙醇 尿素或盐酸胍 透析 有活性 无活性

6 1. 一级结构相似的蛋白质功能相似 一级结构不同的蛋白质功能不同 胰岛素的一级结构及种属差异 (二)一级结构与功能的关系

7 ACTH 促肾上腺素皮质激素 MSH 促黑激素 一级结构不同的蛋白质功能不同

8 HbS 与 HbA 的区别 Β- 亚基第 6 位氨基酸 正常人: Glu 患者: Val

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10 由 4 个亚基组成 血红蛋白 功能 : 运输 O 2

11 二、蛋白质空间结构与功能的关系 (一)肌红蛋白 Mb 与血红蛋白 Hb 蛋白质的空间结构决定生物学功能 肌红蛋白( 1 个亚基)与血红蛋白( 4 个亚基) 且一级结构有较大差异,但均具有与氧可逆地 结合的能力 其结构特点是,都与血红素(辅基)共价结合

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13 O2O2

14 O2O2 (二)血红蛋白构象变化与结合氧的能力

15 变构效应 蛋白质分子与它的配体结合后构象发生变化, 其功能也随之变化的现象, 称为变构效应 协同效应 蛋白质分子中的 1 个亚基与其的配体结合后, 能影响其它亚基与配体的结合, 称为协同效应 促进正协同效应 抑制负协同效应

16 血红蛋白与氧结合的正协同效应 氧饱和度氧饱和度 静脉血动脉血 氧分压 P 50 100% - Hb Mb

17 第四节 蛋白质的理化性质 一 、蛋白质的理化性质 (一)两性解离和等电点

18 蛋白质是两性电解质。在溶液中的带电状况 主要取决于溶液的 pH 值 Pr COOH NH 3 + Pr COO - NH 3 + Pr COO - NH 2 +OH - +H + +OH - +H + pH=pIpH<pIpH>pI 此时溶液的 pH 值称为蛋白质的等电点 (pI) 等电点( pI ):在某一 pH 值溶液中, 蛋白质酸性基团和碱性基团的解离程度相当 蛋白质分子所带正负电荷相等,净电荷为零

19 蛋白质分子颗粒大小 1-100nm 之间, 属胶体颗粒范围, 在溶液中能形成稳定的胶体 蛋白质的胶体原因: 表面形成水化层 表面同种电荷的斥力 (二)蛋白质的胶体性质

20 蛋白质的聚沉

21 (三)蛋白质的变性、沉淀与凝固 变性后的蛋白称为变性蛋白质 1. 蛋白质的变性作用 在某些理化因素作用下. 蛋白质的构象被破坏,失 去其原有的性质和生物活性,称为蛋白质的变性作 用 (denaturation) 概念 :

22 常见的变性因素: 强酸、 强碱、 有机溶剂、 尿素、胍、 重金属 生物碱、 化学因素 物理因素 剧烈振荡热、紫外线、超声波、

23 变性蛋白质的主要特征 : ( 2 ) 生物活性丧失 ( 4 ) 变性蛋白质容易消化 ( 1 )蛋白质分子中的次级键断裂, 构象破坏,但不 涉及共价键的破坏, 一级结构不变 ( 3 ) 变性蛋白质的溶解度常降低、粘度增加、 扩散系数减小

24 除去变性因素后,有的变性蛋白质又可 恢复其天然构象和生物活性,这一现象 称为蛋白质的复性 蛋白质的复性 (renaturation)

25 当破坏了维持蛋白质胶体稳定的因素甚至 蛋白质的构象时,蛋白质就会从溶液中析 出,这种现象称为蛋白质的沉淀。 蛋白质的沉淀 (pre-cipitation) 概念 : 应用 : (1) 蛋白质分离纯化 (2) 解毒 (3) 临床检验

26 (1) 盐析法 ( salting out) 向蛋白质溶液中加入大量中性盐使 蛋白质沉淀称为盐析 常用的中性盐: 不破坏蛋白质的构象,蛋白质不发生 变性 硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等 使蛋白质沉淀的方法 概念: 特点: 作用原理 : 盐离子与水亲和力极强, 夺去蛋白质的水化层,减少分子间静电斥力

27 (2) 有机溶剂沉淀法 使蛋白质脱去水化层, 又能降低溶 液的介电常数使蛋白质表面电荷减 少,导致蛋白质分子聚集而沉淀 必须在低温下操作 注意事项 : 尽量缩短处理的时间 及时将蛋白质中残存的有机溶剂除去 甲醇、乙醇、丙酮 缺点: 原理 : 常用有机溶剂 : 常会使蛋白质变性

28 重金属离子如 Cu 2+ 、 Hg 2+ 、 Ag 2+ 、 Pb 2+ 等带有正电荷,能与蛋白质分 子中带负电的基团结合,生成不溶 性的重金属蛋白盐而沉淀 (3) 重金属盐沉淀法 此法常使蛋白质变性失活 若溶液 pH 大于蛋白质的 pI ,沉淀更易发生 缺点: 原理 :

29 生物碱试剂 ( 如鞣酸、苦味酸、 钨酸等 ) ,某些酸类 ( 主要是指 三氯醋酸、磺酰水杨酸和硝酸 等 ) ,与带正电的蛋白质 结合 生成不溶性的盐而沉淀 (4) 生物碱试剂和某些酸类沉淀法 反应溶液的 pH<pI ,确保蛋 白质以阳离子形式存在 缺点: 原理 : 常引起蛋白质变性 注意事项 :

30 3. 蛋白质的凝固作用 蛋白质的凝固作用实际上是蛋白质变 性后进一步发展的不可逆结果 如加热可使蛋白质变为不容再溶 解的凝块

31 二、 蛋白质的分离纯化 ( 一 ) 盐析和有机溶剂沉淀 ( 二 ) 电泳 ( 三 ) 透析和超滤 ( 四 ) 层析 ( 五 ) 超速离心

32 分类:根据支持物的不同,电泳电泳可分为: 薄膜电泳、凝胶电泳 …… (二)电 泳 概念:带电颗粒在电场中向着所带电荷相反 方向移动称为电泳。 原理 : 不同的蛋白质的因结构、形状和带电 量的不同而有不同的泳动速度,从而 达到分析和分离蛋白质的目的 应用:电泳技术是生化常用分析技术之一

33 利用压力或离心力强行使水和小分子杂质 通过超滤膜 ( 一种半透膜 ) 除去,而蛋白质 留在膜上,称为超过滤 将蛋白质溶液放在半透膜的袋内,置于 流动的适当的缓冲液(如纯水)中,小 分子杂质(如硫酸铵、氧化钠等)从袋 中透出,而蛋白质保留于袋中从而将蛋 白质纯化,这种方法称为透析 (三)透析

34 透析工作图 半透膜原理

35 层析种类: – 凝胶过(分子筛) – 离子交换层析(阴离子和阳离子) – 亲和层析 ( 四 ) 层析

36 带正电荷多蛋 白紧密结合 带负电荷多蛋 白流过层析柱

37 分子筛层析

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39 蛋白质 载体介质 配体 结合 洗脱 洗脱介质

40 ( 六 ) 超速离心

41 三、多肽链中氨基酸的顺序分析 第一步: 分离提纯蛋白质 ,测定 NH 2 末端的数 目,确定蛋白质分子是 由几条肽链构成的,并分 离出 每条肽链。测定肽链的分子量, 计算组成该 肽链的氨基酸残基数。及每种 aa 的百分组成。 一般过程: 肽链分子中氨基酸残基数 = 肽链的分子量 ÷120 (各种的氨基酸残基的平均分子量为 120 ) 再将肽链彻底水解,用离子交换层析法将各种 的氨基酸分离

42 a. 丹磺酰氯法 丹磺酰氯是一种强荧光剂,它能专一 地与链 N- 端 α- 氨基反应生成丹磺酰 - 肽, 后者水解生成的丹磺酰 - 氨基酸具有很强 的荧光,可直接用电泳法或层析法鉴定 出 N- 端是何种氨基酸。 第二步 测定肽链的氨基末端和羧基末端 1.N 末端的测定 b. 二硝基苯氟法 : 过时

43 2.C 末端的测定 常用羧基肽酶法 羧基肽酶专一地将肽链水解成片断, 分别进行顺序分析

44 第三步 肽链的局部水解 胰蛋白酶的作用原理 1. 酶解法

45 CNBr 与 Met 反应测定 Pr 的一级结构 2. 化学法

46 层析鉴定就可 N- 端开始确定被测肽段的氨基酸排列顺序 第四步 肽段氨基酸顺序分析 一般采用 Edman 降解法 弱碱条件 异硫氰酸苯酯 + N 端 α- 氨基 苯氨基硫甲酰肽 (PTC- 肽) 酸性条件 环化水解 苯乙内酰硫氨基酸 (PTH-aa) 失去原 N- 端氨基酸的肽 剩下的肽可反复进行上述处理,依次生成各种 PTH-aa ,

47 Edman 降解法的示意图

48 一般常用多种方法使肽链断裂,并 分析出各肽段中的氨基酸顺序。由于 在不同部位断链,只要找出多套肽段 的重叠部位,然后组合排列对比,即 可推断肽段的排列顺序,从而得出完 整肽链中氨基酸的顺序 第五步 肽链一级结构的确定

49 则其氨基酸排列顺序为: Thr-Asn-Val-Lys-Ala-Trp-Gly-lys 如测一个九肽 测得 N 端氨基酸残基为 Thr 又分别测得片段 : Ala-Ala-Trp-Gly-Lys Val-Lys-Ala-Ala-Trp Thr-Asn-Val-Lys 另外,亦可以通过基因中核苷酸顺序推测蛋白 质的氨基酸顺序

50 四、蛋白质空间结构的测定 1. X 射线晶体衍射法 X- 衍射图代表射线穿过(蛋白质)晶体的一 系列平行剖面的各原子的电子密度,然后再借 助计算机绘制出三维的电子密度图 2. 二维磁共振技术 3. 蛋白质空间结构的预测 ( 1 )根据分子力学、分子动力学、物理化学 原理,从理论上计算推测蛋白质的空间结构 ( 2 )从已知蛋白空间结构规律,从一级结 构推测空间结构

51 Part 1 练习 1. 组成蛋白质的基本单位是什么? 2. 什么是等电点?

52 Part 2 练习 分子筛层析时,先流出的是较大 的蛋白还是较小的蛋白?


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