南京医科大学第一附属医院 临床检验中心 童明庆

Presentation on theme: "南京医科大学第一附属医院 临床检验中心 童明庆"— Presentation transcript:

1 南京医科大学第一附属医院 临床检验中心 童明庆
生物芯片技术及其应用 南京医科大学第一附属医院 临床检验中心 童明庆

2 1.What is a microarray Microarray 或 Biochip （生物芯片）是一种微型多参数生物传感器。它通过在一微小的基片表面固定大量的分子识别探针，或构建微分析单元和系统，实现对化合物、蛋白质、核酸、细胞或其它生物组分准确、快速、大信息量的筛选或检测。 A microarray is an ordered array of microscopic elements on a planar substrate that allows the specific binding of genes or gene products.

3 1.What is a microarray Four distinct characteristics of microarray :
Microscopic target elements or spots; Planar substrates; Rows and columns of elements; Specific binding between microarray target element on the substrate and probe molecules in solution.

4 1.What is a microarray Which is the probe?and which is the target?
There are some differences between China and United States of America. In U.S.A. the probe are usually in solution. In China the probe is a reagent to detect target from sample.

5 Biochips的主要类别 蛋白芯片 Protein chips(protein microarray)： 肽芯片，蛋白芯片
基因芯片 Gene chips（Gene microarray）： 靶DNA芯片，多探针芯片 ③芯片实验室Laboratory-on-a-chip or Microfluidics-based chip

6 2.Microarray manufacturing
The three main manufacturing methods: Contact printing:uses direct contact between the printing implement or the sample contained in the implement and the microarray substrate; Noncontact printing:on-the-fly printing including ink-jet tech.,microsolenoid tech.,and thermal bubble jet dispenser; Semiconductor tech: photolithographic masks and micromirrors.

7 Microscopic elements:
①Semiconductor tech produce 15~30μm features ② Printed spot size is 50~350 μm ③ Tissue spot is 200~600 μm Macroarrays contain sample spot sizes of about 300 microns or larger microarray are typically less than 200 microns in diameter

8 Gene chips的制备  在片原位光刻合成 O d NTP- 5´-光敏保护基因 光照
O dNTP-OH dNTP -5´-保护基因

9 在片原位喷印合成

10 Gene chips的制备 cDNA点样法 醛基修饰玻片 Silanized slide（与DNA上氨基反应）
Silane slide 氨基修饰玻片 Silylated slide（UV照射与DNA交联） Polylysine slide 玻片氨基化举例：

11 Nytran尼龍膜 点样前变性 變性的終濃度1×0.4N NaOH/10mM EDTA， 變性的擴增産物被點樣到Nytran尼龍膜上，
用120mj/cm2UV交聯固定(Stratalinker 1800, Stratagene) 点样后变性 PCR擴增産物被點入(或布陣)至Nytran尼龍膜 上之後,在0.4N NaOH/3M NaCl中浸濕5分鐘變 性DNA,隨後放在用6×SSC浸濕5分鐘中和，再 用120mj/cm2UV交聯固定。

12 我們有世界第一部量產的點樣機及相關的配套生產線

13 核酸的杂交

14 核酸的杂交 常用的双色荧光标记试剂有Cy3-dNTP和Cy5-dNTP。它们在反转录过程中在DNA中的结合性好，激发和发射谱的间距大，以及光量子产率高。亦可标记酶和生物素。

15 基因芯片实验程序

16 基因芯片实验程序

17 Gene chips的应用  病原体的检出  肿瘤相关基因表达谱  位点突变  遗传性疾病  测序  耐药基因检测
 病原体的检出  肿瘤相关基因表达谱  位点突变  遗传性疾病  测序  耐药基因检测  疾病的分子分型  HLA分型

18

19 由杂交位置确定的一组核酸探针序列 ATACGTTA TACGTTAG ATACGTTA TACGTTAG 杂交探针组 ACGTTAGA
由杂交位置确定的一组核酸探针序列 ATACGTTA TACGTTAG ATACGTTA TACGTTAG 杂交探针组 ACGTTAGA CGTTAGAT GTTAGATC ACGTTAGA CGTTAGAT ATACGTTAGATC 重组的互补序列 GTTAGATC p P —TATGCAATCTAG TATGCAATCTAG 靶序列 基因芯片的测序原理图

20 蛋白芯片的原理 1.将抗原或抗体交联（UV）或吸附在膜上

21

22 2. 抗体或抗抗体标记示踪 ①酶：HRPO、AKP ②胶体金 ③荧光素：Cy3、Cy5、FITC、RB200、藻胆蛋白等

23 3.检测标本中的抗体或抗原 點抗原測抗體 POTOMAC

24 點抗原測抗體 POTOMAC

25 點抗體測抗體－捕获法 POTOMAC

26 點抗體測抗原 POTOMAC

27 滲濾式蛋白芯片的設計 POTOMAC

28 检测实例 將應用物品先準備好。

29 在晶片盒視窗內滴加3滴試劑A，必要時用手輕晃晶片，使膜表面完全浸濕。

30 待完全滲入後，室溫放置1分鐘，加待檢血清100μl。

31 待血清完全滲入後，再滴加6滴試劑B。

32 待試劑B完全滲入後，滴加10滴試劑C。

33 待試劑C完全滲入後，最後滴加6滴試劑D。

34 反應完畢後0.5小時內，將晶片放入晶片閱讀系統進行閱讀分析。

35 大淵的PBT-X2-02型生物芯片識別儀器組成。

36 Protein chip的应用 微生物感染－病原体抗原、抗体的检测自身抗体的检测 特定蛋白的检测  HLA分型  过敏原检测
 过敏原检测 ⑥肿瘤标志的检出

37 大渊结核菌多种抗原的 抗体检测蛋白芯片系统 其综合檢出率可以達到93% 特异性抗原：LAM、16KDa和38KDa蛋白
16KDa蛋白：存在于结核分枝杆菌复合群(人型、牛型、非洲型)中，其它分枝杆菌（MOTT）不存在。 其综合檢出率可以達到93%

38 结核分枝杆菌脂阿拉伯甘露糖（以下简称LAM）
结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）的脂阿拉伯甘露糖（LAM）是细胞壁重要组成成分。结核菌的LAM含量比其他分枝杆菌的含量高许多，因此许多研究都认为检测病人血清中的抗LAM抗体是诊断结核病的重要标志之一。 LAM要分布于细胞壁表面，组成成份为碳水化合物。 主要生物学活性 1)   抗原性 2)   抑制T淋巴细胞增殖 3)   破坏巨噬细胞的干扰素活化 4)   清除有毒的自由基 5)   抑制蛋白激酶等的活性 目前，LAM的主要用途是将其作为主要的包被或者点样抗原，以检测结核患者血清中的相应抗体，用于结核病的诊断。

39 结核分枝杆菌MPT63抗原（16KDa） 结核菌MPT63主要存在于培养滤液中，分子量达16kDa，其基因为MPT63，表达159氨基酸（aa）的蛋白质，29aa为信号肽，130aa为成熟蛋白。MPT63可在感染结核菌的豚鼠诱发体液免疫。MPT63基因仅发现于结核菌复合群（M tuberculosis complex, MTC）。MPT63与常见的鸟分枝杆菌（M avium）的蛋白没有血清交叉反应。 MPT63抗原的种特异性：非MTC分枝杆菌缺乏MPT63，表明MPT63是一个MTC特异性抗原。证据有二：抗MPT63抗体与纯化的MPT63，结核菌培养滤液，牛分枝杆菌PPD反应，而不与鸟分枝杆菌PPD反应。另一方面，采用竞争性ELISA，MPT63与抗MPT63的抗体的反应可被牛分枝杆菌PPD显著抑制，而不被鸟分枝杆菌PPD和BSA（无关蛋白）抑制，因此，MPT63没有环境中常见的分枝杆菌抗原表位，其可作为非常有潜力的免疫诊断用抗原。

40 结核分枝杆菌的38kDa蛋白 它有不同的名称，在美、日被称为抗原5（Antigen 5）,挪威将其称之为抗原78（Antigen 78）。Coates等人利用免疫电泳技术测得其分子量为38kDa，故称之为38kDa蛋白 38kDa 蛋白为脂蛋白，存在于细胞外 ，含25%碳水化合物，是从细胞分泌的，理论分子量是为38200Da（含信号肽），其与细胞膜或者菌体表面的脂肪结构相连 。 38kDa的反应性：交叉免疫电泳技术（crossed immunoeleltrephoresis,CIE）证实结核菌和卡介苗均产生38kDa蛋白，但前者的浓度显著较后者高。 分枝杆菌中只在结核菌和牛分枝杆菌（M boris）发现38kDa蛋白，而且结核菌的反应强度较牛分枝杆菌强10倍 。 抗-BCG多价抗体也能与38kDa蛋白反应 ，但BCG表达38-kDa蛋白的量很低 。 结核分枝杆菌38kd抗原特异性100%，与正常健康人、MOTT感染和麻风分枝杆菌感染无交叉。

41 TB蛋白芯片点阵排布 LAM 16KDa 识别色点 38KDa 质控点 H2O 2 4 2 2 4 3 3 3 2 3 1 4 1 1 1

42 大渊结核芯片系统与DIGFA试剂（上海奥普）检测的总符合率
两法检测结核病人和对照组共1285份标本，均阳性326例，均阴性769例，相符总数为1095例。总符合率为85.21%。  武汉钢铁公司总医院、哈尔滨市胸科医院检验科、海南省农垦总局医院、 江苏省人民医院检验中心 （组长单位）

43 检测抗结核分支杆菌LAM、16和38kD抗原的抗体意义：
·鉴别痰涂片阳性者是否属于结核杆菌感染。 ·提高痰涂片阴性患者的检出率。 ·肺外结核的检测。 ·痰涂阴性者的早期诊断。 ·可作为判断对治疗是否有效的指标。

44 大淵心肌梗塞AMI檢測芯片 肌紅蛋白（Myoglobin）是早期診斷最重要的指標
1-2小時值升高 小時達到高峰 小時回到正常 肌酸激酶同工酶（CK-MB）是診斷AMI最信賴的心肌酶 3-8小時值升高 小時達到高峰 3天回到正常 肌鈣蛋白I（Troponin I）是診斷心肌損傷最主要的指標 4-8小時值升高 小時達到高峰 天回到正常 高敏C反應蛋白（hs-CRP）

45 大渊蛋白芯片(AMI)对照检测 江苏省人民医院临床检验中心 上海瑞金医院检验科 湖北省人民医院检验科
项 目 对照试剂 和仪器 例数 一致性相关 系数rc分析 CK-MB 罗氏ECL2010 524 0.852 MB Bayer公司ACS 180plus 0.915 cTnI hs-CRP 贝克曼 Immage 0.89

46 大渊STD芯片检测系统 本晶片含有UU第一群（含1，3，6，14等四個血清型）和第二群（含2，4，5，7，8，9，10，11，12，13等十個血清型）多種抗原，對兩群十四個血清型都能檢出。 本晶片含有CT的沙眼生物变种（D~K型）和性病淋巴肉芽肿 （ LGV）生物变种 可检出UU/CT感染的85％以上。 泌尿道感染中UU/CT感染占1/3。

47 大渊STD芯片对比检测结果 1. 江苏省人民医院（组长医院）， 2. 安徽医学院附属医院， 3. 南京皮肤病研究所， 4
项目 试 剂 例数 敏感性(%) 特异性(%) CT 英国立明 955 88.1 80.7 UU 法国梅里埃 86.1 81.2

48 大渊TORCH生物芯片 大渊TORCH芯片（IgM和IgG） ： 检测：弓形体、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒（Ⅰ、Ⅱ）的抗体
用于优生优育，孕前和孕早期检测 IgM抗体阳性提示现症感染，IgG抗体阳性提示有免疫力。

49 TORCH检查的临床意义 约有30%-46%其弓形体可通过胎盘传给胎儿，直接影响胎儿的发育，导致畸形，甚至死亡。也可使孕妇流产，早产，死产或增加妊娠并发症。 孕妇感染风疹病毒后，胎儿出生后多患有白内障等眼疾、耳聋、心血管系统缺损、精神运动性障碍、紫癜等症状，重者可发生死亡和流产。

50 TORCH检查的临床意义 胎儿CMV感染后严重者则引起流产、死产，轻则造成出生体重偏低或畸形。婴儿先天性感染常带有明显的遗留损害危险，特别是对中枢神经系统影响较多。新生儿感染后死亡率高，存活者也大都发生智力降低，神经性运动障碍等。 成人感染HSV的临床表现往往是局部的，新生儿由于免疫力底下，往往是全身散播性的，其病情较重，病死率高，幸存者往往有终身残疾。

51 幽门螺旋杆菌（HP）IgG抗体蛋白芯片 大渊Hp抗体芯片检测：细胞毒素相关蛋白A(CagA) 、尿素酶(Ure)和热休克蛋白（HSP）
临床意义： 根据HP菌株有无细胞毒素相关蛋白A(CagA)蛋白表达将其分为两型：Ⅰ型是高毒力株，含CagA基因，表达CagA蛋白；这类菌株与胃、十二指肠溃疡及诱发癌变密切相关。 几乎所有的野生型HP都产生尿素酶(Ure)，Urc抗体的产生是Hp感染的标志。 HSP是一种应激蛋白， HP与HSP检测结果同为阳性，表示HP正在发挥致病作用，需要及时治疗。另外，研究发现HSP60与胃癌的发生有密切的关连。

52 大渊自身抗体生物芯片 大渊自身抗体芯片： 检测：dsDNA,Histone,SSA/Ro,SSB/La,Sm,RNP,Jo-1,Scl-70,Rib-P的自身抗体 用于自身免疫病的诊断检查：系统性红斑狼疮、药物性狼疮、混合性结缔组织病、类风湿性关节炎、系统性硬化症、多发性肌炎、干燥综合征等。

53 中國生物芯片申報現況之一 20031128 已批准部份 C12腫瘤蛋白芯片 湖州數康 丙型肝炎病毒抗體芯片 深圳益生堂 HP蛋白芯片 大渊
中國生物芯片申報現況之一 已批准部份 C12腫瘤蛋白芯片 湖州數康 丙型肝炎病毒抗體芯片 深圳益生堂 HP蛋白芯片 大渊 UU CT HPV抗體芯片 大渊 地中海貧血基因芯片 POTOMAC

54 AMI四項定量蛋白芯片（经检定全部合格） 大淵 UU CT抗體芯片 （经检定全部合格） 大淵
中國生物芯片申報現況之二 已受理部份 乙型肝炎病毒基因多態性檢測芯片 丙型肝炎病毒抗體芯片 AMI四項定量蛋白芯片（经检定全部合格） 大淵 UU CT抗體芯片 （经检定全部合格） 大淵 TB抗體檢測芯片 （经检定全部合格，即将拿到证书） 大淵 SARS基因芯片 TORCH蛋白芯片 （经检定全部合格） 大淵 自身抗體九項檢測蛋白芯片 （经检定全部合格） 大淵 POTOMAC

55 中國生物芯片申報現況之三 20031128 檢定中部份 HLA-DR分型基因芯片 HLA-AB分型基因芯片 SARS流感腸道核酸螢光芯片
中國生物芯片申報現況之三 檢定中部份 HLA-DR分型基因芯片 HLA-AB分型基因芯片 SARS流感腸道核酸螢光芯片 乙丙型肝炎基因芯片 SARS基因芯片 TB耐药基因芯片 大渊 食品药物残留芯片 大渊 POTOMAC

56 大渊蛋白芯片的特点： a. 多种特异性抗原或抗体的同时检测； b. 较单一指标明显提高检测的敏感性、特异性； 可单人份操作，需时短，简单。
应用多种高新技术：基因重组技术、单抗技术、分子标记技术、斑点金免疫渗滤技术、微阵列技术、图像数字信息处理技术。

57 POTOMAC

58

59 大渊的发展 第二、三代阅读仪 基因芯片 大鼎生物工程公司（计生产品的研发、生产、销售）
大德实验诊断中心和生物医学产品研发中心（药品、疫苗、试剂、保健品、营养品及化妆品等的研发）

60 THANK YOU FOR YOUR ATTENTION !