乙肝病毒检测.

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1 乙肝病毒检测

2 病毒鉴定方法 一、分离培养方法 二、快速诊断方法 1、光学显微镜检查 病毒包涵体及某些大病毒颗粒的检查 2、电子显微镜的检查 电镜直接检查
免疫电镜检查 3、血清学检查 4、病毒基因组检查 核酸杂交和聚合酶链反应

3 乙肝病毒检测 一、乙肝五项（两对半） 二、乙肝病毒核酸定量检测

4 急性或慢性乙型肝炎（传染性强） （大三阳）
HBV抗原抗体系统检测临床意义 HBsAg 抗-HBs HBeAg 抗-HBe 抗-HBc 临床意义 IgM IgG + - 感染或无症状携带者 急性或慢性乙型肝炎（传染性强） （大三阳） 急性肝炎趋向恢复 （小三阳） 既往感染恢复期 既往感染 既往感染或接种疫苗 未感染，无免疫力

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7 二、乙肝病毒核酸定量检测 1.检测原理 利用荧光PCR技术，以HBV基因组中相对保守区为靶区域，设计特异引物及荧光探针，通过PCR对DNA进行快速定量检测。 荧光探针TaqMan 探针实时荧光 PCR 技术。在 PCR 反应过程中，同时利用 Taq 酶的 5’→3’聚合酶活性和核酸外切酶活性，使得 TaqMan 探针降解，荧光报告基团和淬灭基团分离使得荧光信号发射， FAM 荧光检测乙型肝炎病毒JOE/RED610 nm 波长通道检测内参。

8 PCR分四个阶段

9 如何定量？ Ct值的概念 Ct值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。

10 定量原理 确定初始模板的浓度 初始 DNA量越多, 荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少
Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量

11 荧光化学 TaqMan SYBR Green 1

12 TaqMan

13 SYBR Green I 工作原理 。 SYBR Green 1 结合到双链DNA的小沟部位 变性: 无荧光信号
T C A 变性: 无荧光信号 G T C A 未结合SYBR Green 1 dye

14 2.所用试剂 组分名称 规格 数量 主要成分 核酸提取试剂 DNA提取液I 4.5ml/瓶 2 DNA提取液 质控品及阳性定量参考品
阴性质控品 250ul/管 1 HBV阴性血清 强阳性质控品 灭活HBV阳性血清 临界阳性质控品 HBV定量参考品（2.0X106IU/ml） HBV定量参考品（2.0X105IU/ml） HBV定量参考品（2.0X104IU/ml） HBV定量参考品（2.0X103IU/ml） PCR检测试剂 HBV-内标溶液 100ul/管 内标质粒及稳定剂 HBV-PCR反应管 1人一份/管 20 引物、探针、taq酶等

15 3、实验步骤 1.DNA提取 将待测样本、阳性定量参考品、阴性质控品、HBV强阳性质控品、 HBV临界质控品进行同步处理。 1.1 取200 μL样品，加入450 μL DNA提取液I和4 μL内标溶液，用振荡器剧烈震荡摇匀15秒，瞬时离心数秒，100℃处理10分钟 rpm离心5分钟，备用 2.PCR试剂准备 直接使用HBV-PCR反应管 3. 加样 HBV-PCR反应管分别加入将待测样本、阳性定量参考品、阴性质控品、HBV强阳性质控品、 HBV临界质控品上清20 μL。盖紧管盖，8000rpm离心数秒后扩增

16 4.PCR扩增 对各标本进行标记 反应条件： 93℃ 2分钟 93℃ 45秒→55℃ 60秒→10个循环 93℃ 30秒→45℃ 60秒→30个循环 FAM通道检测HBV核酸，VIC通道检测内标

17 4.结果判定 1 如果在FAM检测通道检测扩增曲线无明显对数期或Ct值等于30，VIC检测通道扩增曲线有明显对数期，则为阴性或小于检测灵敏度
按以下方法判断： C<100,HBV DNA浓度<100 IU/ml 100≤C ≤ 5.0E+008 ,HBV DNA浓度=C IU/ml C>5.0E+008 ,HBV DNA浓度>5.0X108 IU/ml 如需精确定量结果，可将样品用阴性质控品稀释到线性范围后再检测，则样品HBV DNA浓度=（CX稀释倍数） IU/ml

18 5.注意事项 1 每次实验需检测阴性质控品、HBV强阳性质控品、 HBV临界质控品，满足要求方可进行判定（阳性质控品Ct<30，阴性质控品无明显对数期或Ct值等于30 VIC检测通道扩增曲线有明显对数期） 2 本试剂盒的最低检出浓度为30IU/ml，最低定量浓度为100IU/ml 3 所有样品包括质控品均按传染性标本对待严格遵循无菌操作（带口罩手套），所有操作在生物安全柜内操作，物品不能随意带出生物安全柜，用完的物品集中放置高压灭菌后方可处置。

19 一、乙肝病毒e抗原检测 1.检测原理 在微孔板上预包被鼠抗-Hbe单克隆抗体（ HbeAb），配以辣根过氧化物酶标鼠抗-Hbe单克隆抗体（ HbeAb-HRP）及TMB（四甲基联苯胺）等试剂，采用双抗夹心法检测血清中的乙肝病毒e抗原（ HbeAg）

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21 （包被鼠抗-Hbe单克隆抗体（ HbeAb）） （辣根过氧化物酶标鼠抗-Hbe单克隆抗体）
2.所用试剂 组成成分 规格 1.HbeAg微孔板 （包被鼠抗-Hbe单克隆抗体（ HbeAb）） 96TX块 7.底物B （过氧化氢） 7mlX1支 2.HbeAg酶标抗体 （辣根过氧化物酶标鼠抗-Hbe单克隆抗体） 3.5mlX1支 8.终止液 3.HbeAg阳性对照血清 （含HbeAg阳性血清） 1mlX1支 9.封口膜 2张 4.HbeAg阴性对照血清 （正常人血清） 10.自封袋 1个 5.浓缩洗涤 （PBS-T缓冲液） 12.5mlX1支 11. 说明书 1张 6.底物A

22 3、实验步骤 1.平衡 试剂盒个组分取出，平衡至室温（16-25℃）余者以自封袋封存 2.配液 浓缩洗涤液摇匀后，用蒸馏水或去离子水按1:19稀释备用 3. 编号 微孔条固定于支架，按序编号 4.加样 分别用加样器加入阳性对照血清、阴性对照血清50 μL（各加两孔），待测血清50 μL（1孔），空白对照（不加）

23 每孔加入A、B底物50 μL，混匀，37℃暗置15分钟 9.终止 10.测定
5.加酶 每空加酶标抗体50 μL，混匀（空白对照不加） 6.温浴 37℃温浴25分钟，室温平衡5分钟（封口膜覆盖孔口，避免其他因素影响） 7.洗涤 洗涤液充分洗涤5次，洗涤完扣干（每次应保持30-60秒的浸泡时间） 8.显色 每孔加入A、B底物50 μL，混匀，37℃暗置15分钟 9.终止 每孔加50 μL终止液50 μL，混匀 10.测定 酶标仪单波长450nm或双波长450/630nm测定各空OD值，记录结果,30分钟内测定完成）

24 4.结果判定 1. 临界值(C.O)计算 临界值=阴性对照孔OD值均值N X 2.1
2. 结果判定 样品OD值/ C.O ≥1为HbeAg阳性 样品OD值/ C.O <1为HbeAg阳性 3.阴性对照孔均值N大于0.1或阳性对照均值≤0.4实验无效，应重新实验

25 5.注意事项 1. 洗涤时各孔均加满，防止孔内有游离酶未洗净影响结果
2. 所有样品包括质控品均按传染性标本对待严格遵循无菌操作（带口罩手套），所有操作在生物安全柜内操作，物品不能随意带出生物安全柜，用完的物品集中放置高压灭菌后方可处置。 3.微孔板拆封后，取出当天用的微孔条后，其余用封口膜封存避免受潮