1.2 基因工程的基本操作程序 善假于物也.

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1 1.2 基因工程的基本操作程序 善假于物也

2 补：原核细胞的基因结构 非编码区 编码区 非编码区 编码区上游 编码区下游 启动子 终止子 与RNA聚酶结合位点 RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。 转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。 转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。

3 原核细胞的 基因结构 编码区 ：能转录相应的信使RNA，能 编码蛋白质 ①不能转录为信使RNA，不能 编码蛋白质。 非编码区 ②有调控遗传信息表达的核 苷酸序列，在该序列中， 最重要的是位于编码区上 游的RNA聚合酶结合位点。

4 补：真核细胞的基因结构 外显子： 能够编码蛋白质的序列叫做外显子 内含子： 不能够编码蛋白质的序列叫做内含子，内含子能转录为信使RNA
非编码区 编码区 非编码区 编码区上游 编码区下游 启动子 终止子 与RNA聚酶 结合位点 外显子 内含子 外显子： 能够编码蛋白质的序列叫做外显子 内含子： 不能够编码蛋白质的序列叫做内含子，内含子能转录为信使RNA

5 真核细胞的 基因结构 外显子：能编码蛋白质的序列 内含子：不能编码蛋白质的序列 编码区 非编码区 ：有调控作用的核苷酸序列， 包括位于编码区上游的RNA 聚合酶结合位点。 非编码序列： 包括非编码区和内含子

6 都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的
原核细胞与真核细胞的基因结构比较 原核细胞 真核细胞 不同点 编码区是 _____的 编码区是间隔的、_____的 相同点 都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的 连续 不连续 编码区 非编码 思考 编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？ 不一样.真核细胞基因结构要长一些.

7 基因工程基本操作的四个步骤 1、目的基因的获取 2、基因表达载体的构建 3、将目的基因导入受体细胞 4、目的基因的检测与鉴定

8 一、目的基因的获取 1、目的基因的来源 ①从自然界已有的物种分离 ②人工方法合成 2、目的基因主要是指______________________ 编码蛋白质的结构基因 请举出三个以上的例子 目前被广泛提取使用的有：苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。 3、获取目的基因的方法 （1）从基因文库中获取 （2）利用PCR技术扩增 （3）人工合成

9 (1)从基因文库中获取目的基因 什么是基因文库？ 什么是部分基因文库？ 怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？
目的基因的有关信息与什么相联系？

10 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库。
基因组文库 部分基因文库（如cDNA文库） 概念：基因文库 （gene library） 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库。

11 基因组文库: 部分基因文库: 基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库.
基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库.

12 思考：基因文库如何构建？ 1)基因组文库的构建
基因组DNA 限制酶 是指将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组后，导入受体菌的群体中储存，这个群体就称为该生物基因组文库。此种构建基因文库的方法称直接分离法（或鸟枪法）。其目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因。 基因重组 体外包装 转化细菌

13 mRNA 2)cDNA文库的构建 反转录酶 是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互补DNA片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群就叫做这种生物的cDNA文库。此种构建基因文库的方法称反转录法。 cDNA 基因重组

14 基因组DNA文库与cDNA文库构建的比较

15 基因组文库与部分基因文库的关系 DUCK179制作

16 思考：如何从基因文库中得到所需要的基因？
依据：目的基因的有关信息。 如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质 等特性。

17 A C 1、构建基因组DNA文库时，首先应分离细胞的 A、染色体DNA B、线粒体DNA C、总mRNA D、tRNA
2、目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的描述正确的是 A、某生物的全套基因就是一个基因文库 B、将含有某种生物不同的许多DNA片段，导入某个生物 体内，则这个生物就是一个基因文库 C、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库 D、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文库 C

18 (二)利用PCR技术扩增

19 (2)利用PCR技术扩增 聚合酶链式反应 ① 概念：PCR全称为_______________，是一项 在生物____复制___________的核酸合成技术 体外 特定DNA片段 ②原理：__________ DNA复制 已知基因的核苷酸序列 ③条件：_______________________、 _______________、___________ (做启动子)、 ___________. 四种脱氧核苷酸 一对引物 DNA聚合酶 指数 ④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循 环的次数） 2n ⑤结果： 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增

20 ⑥过程： a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板 在热作用下，_____断裂，形成___________ 氢键 单链DNA b、退火（复性55℃-60℃）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部________。 双链 c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从 引物的5′端→ 3′ 端延伸，合成与模板互补的________。 DNA链

21 PCR原理 5/ 3/ G—G T—C 变性 复性 5/ 3/ A—G 引物Ⅰ 延伸 3/ 5/ G—A C—C 5/ 3/ G—G 引物Ⅱ

22 PCR(多聚酶链式反应)

23 1、在遗传工程中，若有一个控制有利性状的DNA分子片段为ATGTG／TACAC，要使其数量增多，可用PCR技术进行人工复制，复制时应给予的条件是
①双链DNA分子为模板 ②ATGTG或TACAC模板链 ③四种脱氧核苷酸 ④四种核苷酸 ⑤DNA聚合酶 ⑥热稳定DNA聚合酶⑦引物 ⑧温度变化 ⑨恒温 A．①③④⑦⑧⑨ B．①②④⑥⑦⑧ C．①②⑤⑥⑦⑨ D．①③⑤⑥⑦⑧ D 2、在基因工程中，把选出的目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌岭脱氧核苷酸是460个）放入DNA扩增仪中扩增4代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是 A.540个 B.8100个 C.17280个 D.7560个 B

24 （3）人工合成：若基因_____，核苷酸序列又 ______ ，则可用此法。 已知
较小 （3）人工合成：若基因_____，核苷酸序列又 ______ ，则可用此法。 已知 肽链氨基酸序列 信使RNA序列 基因的核苷酸序列 目的基因 合成 推测 化学合成法

25 A D 1、在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法是 A、化学合成法 B、基因组文库法 C、cDNA文库法 D、聚合酶链反应
2、下列获取目的基因的方法中需要模板链的是 ①从基因文库中获取目的基因 ②利用PCR技术扩增目的基因 ③反转录法 ④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成 A．①②③④ B．①②③ C．②③④ D．②③ D

26 2、基因表达载体的构建 —— 核心 ①用一定的_________切割 质粒，使其出现一个切 口，露出____________。 ②用_____________切断目 的基因，使其产生_____ ____________。 限制酶 黏性末端 同一种限制酶 相同 的黏性末端 ③将切下的目的基因片段插入质粒的______处， 再加入适量___________，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒） 切口 DNA连接酶

27 2、基因表达载体的构建 —— 核心 质粒 DNA分子 限制酶处理 一个切口 两个黏性末端 两个切口 获得目的基因 DNA连接酶 重组DNA分子（重组质粒） 同一种

28 经此过程，基因表达载体的构建就成功了？ 思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？

29 不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：
（1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达； （2） 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录； （3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记； （4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等； （5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。

30 它们有什么作用？ 基因表达载体的组成： a、目的基因 位于基因的首端,是mRNA结合位点 b、启动子 位于基因的末端,终止转录 c、终止子
d、标记基因 检测目的基因是否导入受体细胞 它们有什么作用？

31 注意 ①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构
③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少 ④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。

32 A．目的基因 B．启动子 C．终止子 D．标记基因
1、（多选）一个基因表达载体的构建应包括 A．目的基因 B．启动子 C．终止子 D．标记基因 2、下列关于基因表达载体的叙述不正确的是 A．启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起始密码 B．启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对mRNA的转录起调控作用 C．标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选 D．基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别 A

33 3、将目的基因导入受体细胞 转化 —— 目的基因进入_________内，并且在 受体细胞内维持_____和_____的过程 受体细胞 稳定 表达 农杆菌转化法 将目的基因导入 植物细胞 基因枪法 花粉管通道法 方法 将目的基因导入 动物细胞 ——显微注射法 将目的基因导入 微生物细胞 ——Ca2+处理法

34 3、将目的基因导入受体细胞 常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。 将目的基因导入受体细胞的原理： 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径

35 1、将目的基因导入植物细胞 特点: （1）农杆菌转化法 转化过程: 能感染双子叶植物和祼子植物,对单子叶植物无感染能力
Ti质粒的T—DNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上 （1）农杆菌转化法 转化过程: 表达载体 农杆菌 植物细胞 新性状 Ti质粒 目的基因 转入 导入 插入 植物细胞染色DNA 构建 表达

36 （2）基因枪法 基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。

37 （3）花粉管通道法 植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。

38 2、将目的基因导入动物细胞 方法: 显微注射法 操作程序: 提纯含目的基因表达载体 显微注射 移植到子宫 取受精卵 受精卵发育 新性状动物

39 3、将目的基因导入微生物细胞 Ca2+处理大肠杆菌 常用法：Ca2+处理 常用菌：大肠杆菌 微生物作受体细胞原因：
繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少 过程： 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA Ca2+处理大肠杆菌 感受态细胞

40 导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组DNA分子吗？
所以要对受体细胞作怎样的处理？ 对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测 怎样进行检测？ 通过目的基因上的标记基因，进行筛选和检测

41 B D C 1、基因工程中科学家常用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，原因是 A．结构简单、操作方便 B．繁殖速度快
C．遗传物质含量少、简单 D．性状稳定、变异少 2、基因工程常用的受体细胞有 ①大肠杆菌 ②枯草杆菌 ③支原体 ④动植物细胞 A．①②③④ B．①②③ C．②③④ D．①②④ B D 3、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 A.人工合成基因 B.目的基因与运载体结合 C.将目的基因导入受体细胞 D.目的基因的检测和表达 C

42 C 8. 采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是
①将毒素蛋白质注射到棉受精卵中 ②将编码毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中 ③将编码毒素蛋白的DNA序列与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵中 ④将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组，导人细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养 A．①② B．②③ C．③④ D．①④ C

43 4、目的基因的检测与鉴定 ——检查是否成功 ①检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因 方法—— DNA分子杂交 检测— ②检测目的基因是否转录出了mRNA 方法—— 分子杂交 ③检测目的基因是否翻译成蛋白质 方法—— 抗原抗体杂交 鉴定—— 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 Go on

44 知识延伸——DNA分子杂交技术 该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单股的DNA小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。

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46 a DNA 变性 DNA杂交 （如检测SARS病毒等） b 附着在膜上 c 硝化纤维素 报告基因（含荧光素分子） 加探针 d 返 回

47 归纳: 基因工程的基本操作程序 获取目的基因 从基因文库 利用PCR 化学方法人工合成 构建基因表达载体 目的基因、启动子、终止子、标记基因
将目的基因导入受体细胞 农杆菌转化法、显微注射法、 Ca2+处理法 目的基因的检测与鉴定 检测：是否插入、转录、翻译 鉴定：

48 求异思维 你能推测出由mRNA反转录形成cDNA的过程大致分为哪些步骤吗？
    反转录酶既可以利用DNA又可以利用RNA作为模板合成与之互补的DNA链。像其他DNA聚合酶一样，反转录酶也以5′→3′方向合成DNA。     cDNA合成过程是：第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。

49 寻根问底 1.为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？
构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。

50 2.将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？
有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多，严格来讲不算基因工程。

51 思考与探究： 1.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导入小麦中,理论上讲你应该怎样做? ①要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物； ②要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。

52 2.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？
有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。

53 3.β-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的β-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？
基本操作如下：     （1）从小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。     （2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。     （3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明β-珠蛋白基因已进入其中。     （4）培养进入了β-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取β-珠蛋白。

54 练习 C 1）以下说法正确的是 （ ） A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体
1）以下说法正确的是 （ ） A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来

55 练习 2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制 （ ） B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 D、它是环状DNA D

56 练习 A 3）有关基因工程的叙述中，错误的是（ ） A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、 限制性内切酶用于目的基因的获得
3）有关基因工程的叙述中，错误的是（ ） A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、 限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶

57 练习 D 4）有关基因工程的叙述正确的是 （ ） A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体
4）有关基因工程的叙述正确的是 （ ） A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料

58 练习 C 5）基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 （ ） A、人工合成目的基因
B、目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达 C