第十一章 基因诊断与基因治疗 刘智敏 基础医学院生物化学与分子生物学教研室.

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1 第十一章 基因诊断与基因治疗 刘智敏 基础医学院生物化学与分子生物学教研室

2 第一节 基因诊断 一、基因诊断的概念 基因诊断(gene diagnosis)是以DNA和RNA为诊断材料，通过检查基因的存在、缺陷或表达异常，对人体状态和疾病作出诊断的方法和过程。其基本原理是检测DNA或RNA的结构变化与否，量的多少及表达功能是否正常，以确定被检查者是否存在基因水平的异常变化，以此作为疾病确诊的依据。

3 临床意义: 在于不仅能对疾病作出早期、确切诊断，而且也能确定个体对疾病的易感性及疾病的分期分型、疗效监测、预后判断等。近年来，随着基因诊断技术的发展和应用，基因诊断的原理和方法不仅适用于遗传性疾病，而且已广泛应用于感染性疾病和肿瘤的诊断以及法医学等领域。

4 二、基因诊断的技术方法 （一）基因诊断中常用的分子生物学技术 1、核酸分子杂交 关于核酸分子杂交的基本原理和基本类型前面已讲。在这些方法中：
1、核酸分子杂交 关于核酸分子杂交的基本原理和基本类型前面已讲。在这些方法中： （1）Southern印迹法 是最经典的基因分析方法，不但能检出特异的DNA片段，而且能进行定位和测定分子量，可用于基因的酶切图谱分析、基因突变分析等。 （2）Northern印迹法 可用于组织细胞中总RNA或mRNA的定性和定量分析。

5 （3）斑点杂交 可用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量分析。优点：方法简单、快速、灵敏、样品用量少；
缺点：是不能鉴定所测基因的分子量，特异性不高，有一定比例的假阳性。 （4）原位杂交 可查明染色体中特定基因的位置，用于染色体疾病的诊断。原位杂交的结果是显示有关核酸序列的空间位置状况，因此可检出含核酸序列的具体细胞，细胞具体定位、数目及类型，可检出基因和基因产物的亚细胞定位。

6 2、聚合酶链式反应(PCR) 3、单链构象多态性检测
PCR技术在基因诊断中已得到广泛应用。在应用中，PCR常与其它技术如分子杂交、限制酶酶谱分析、单链构象多态性检测、限制性片段长度多态性分析、DNA序列测定等联合应用。 3、单链构象多态性检测 单链构象多态性(single strand conformation polymorphism，SSCP)检测是一种基于单链DNA构象差别来检测点突变的方法。

7 原理：DNA经变性形成单链后，在中性条件下单链DNA会因其分子内碱基之间的相互作用，形成一定的立体构象。相同长度的单链DNA，如果碱基序列不同，形成的构象就不同，这样就形成了单链构象多态性。长度相同而构象不同的单链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)中表现出不同的迁移率。SSCP常与PCR联合应用，称为PCR-SSCP技术。

8 4、限制酶酶谱分析 基因突变可能导致基因上某一限制酶识别位点的丢失或其相对位置发生改变，以此酶消化待测DNA和野生型对照DNA，通过比较二者的酶切片段的长度、数量上的差异就可判断待测DNA的突变情况。

9 5、DNA序列测定 DNA序列测定是进行基因突变检测的最直接、最准确的方法。不仅可确定突变的部位，而且可确定突变的性质。由于PCR技术的应用，使DNA测序技术从过去的分子克隆后测序进入扩增产物直接测序的新阶段。 现在发展了一种双链DNA循环测序法(dsDNA cycle sequencing)，其特点是直接以PCR产物为模板，在测序体系中以Taq DNA聚合酶替代测序酶，而引物的5＇端带有标记，通过多次变性、退火、延伸的循环来完成测序反应，因此具有快速、简便、灵敏、重复性好等优点。

10 6、DNA芯片技术 DNA芯片技术是近年来兴起的基因分析与检测的新技术，以其快速、敏感、高效、平行化、自动化等特点，将发展成为新一代基因诊断技术。应用DNA芯片；不仅可以检测基因的结构及其突变、多态性，而且可以对基因的表达情况进行分析，因此在基因诊断中的应用前景非常广阔。

11 （二）基因诊断的基本方法 人类疾病的原因包括内因和外因两大类，内因主要是指遗传因素，即基因结构、表达状况的改变。其中基因结构的改变包括点突变、插入、缺失，重排、易位、基因扩增、基因结构多态性变异、前病毒插入等；外因是指外在的环境因素，如病原体的侵入等。 因此，针对这些病因可采取相应的基因诊断方法，主要的可从以下几个方面着手：

12 1、基因突变的诊断 （1）点突变的诊断 ①诊断已知的点突变：对于突变位点已被阐明的一些遗传病，可以采用PCR／ASO(allele specific oligonucleotide，ASO，等位基因特异性寡核苷酸)探针法进行检测。在扩增DNA片段后直接与相应寡核苷酸探针杂交，即可明确诊断是否有突变以及突变是纯合子还是杂合子。 例如，已知某位点正常碱基为C，突变为T(即C→T)：

13 引物1 3′ 5′ 突变位点 引物2 在该位点两端设计引物1、2进行PCR扩增，得到产物后进行斑点杂交或狭缝杂交 (P177)。针对该突变分别合成一对寡核苷酸片段作为探针；其中一个为正常探针，与正常序列互补(中央碱基为G)；另一个是突变探针，与突变序列互补(中央碱基为A)。突变碱基及对应

14 的正常碱基均位于寡核苷酸片段的中央，因为只有在这个位置时，该碱基与被探测的DNA上相应碱基或匹配或错配，对二者结合力影响最大。严格控制杂交及洗脱条件，使只有与靶序列完全互补的探针才能结合在等位基因片段上，而中央碱基与靶序列不匹配的探针则不能结合在等位基因片段上。

15 结果分析：a. 如果从受检者DNA扩增的PCR产物与正常探针杂交，而不和突变探针杂交，表示受检者不存在这种突变基因；b
结果分析：a. 如果从受检者DNA扩增的PCR产物与正常探针杂交，而不和突变探针杂交，表示受检者不存在这种突变基因；b. 如果只有突变探针可以杂交，则说明突变基因是纯合子；c. 若正常探针与突变探针都可杂交，说明突变基因是杂合子；d. 如果患者的DNA与正常探针以及所有已知突变基因的寡核苷酸探针均不能杂交，则提示患者的缺陷基因不属于先前已发现的突变类型，而很可能是一种新的突变类型。

16 进而利用DNA芯片技术，除了上述两个探针外，再设计两个探针，其中央碱基分别为C和T。这4个探针可原位合成或预合成后显微打印在支持物上。杂交分析同上。如果扩增产物与中央碱基为C或T的探针杂交，则可清楚地表明该缺陷基因的新的突变类型为C→G或C→A。 A T C G C →T 芯片设计 探针定位 正常 C →T C →G C →A （纯合子） （杂合子） 新突变 新突变 点突变检测荧光亮点模式

17 ②诊断未知的突变 可采用PCR／SSCP／sequencing方法。通过PCR同时扩增待测基因和野生型对照基因的DNA片段，将扩增的双链DNA变性成单链，用非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离。待测基因的单链DNA上单个碱基的改变可导致构象的改变，其电泳迁移率也会发生改变。通过比较这两者的迁移率，即可判断是否发生基因突变。在SSCP法检测到突变位点存在的基础上，即可通过DNA序列测定得知确切的突变。 DNA芯片技术用于大规模未知突变的筛查，则更显示出该技术的优越性。筛查n个碱基长度序列的每个碱基的变异，需要4×n个探针。如在1.28cm2的支持物上原位合成16000个寡核苷酸探针，通过一次杂交即可快速确定4kb序列内所有的点突变及其部位。

18 （2）少数核苷酸缺失或插入的诊断 可以采用检测点
（2）少数核苷酸缺失或插入的诊断 可以采用检测点 突变的方法。 （3）大片段丢失或插入的诊断 利用DNA缺失区域5＇和3＇端引物进行PCR，通过凝胶电泳观察扩增DNA片段出现与否以及片段的大小，就可诊断出0.5～1.5kbDNA片段的中等程度的缺失。现又发展了多重PCR技术，即用多对引物同时进行PCR，对某一特定基因的不同DNA区域进行缺失诊断。 致病基因 引物1 引物3 5′ 3′ 引物2 引物4

19 引物1和2：可确定有无缺失及缺失片段的相对大小。引物3和4：确定缺失部位。引物3和4的设计要通过研究来加以确定。对于一些较长的基因，设计两端引物(1和2)进行扩增是不合适的，PCR扩增2kb以上的片段比较困难。在这种情况下可采用多重PCR的方法。 （4）基因重排(染色体易位)的诊断 利用PCR可以检测基因重排，其前提是已知重排基因和重排位点的序列。可设计3条PCR引物进行2个PCR反应。

20 引物(1+3)可扩增得到正常基因的PCR产物； 引物(2+3)可扩增得到重排基因的PCR产物。
引物1 引物2 5′ 3′ 引物3 引物1：正常位点的序列； 引物2：重排位点的序列； 引物3：基因内的序列。 引物(1+3)可扩增得到正常基因的PCR产物； 引物(2+3)可扩增得到重排基因的PCR产物。 也可单用引物(2+3)有无产物判断有无重排。但同时用(1+3)和(2+3)进行PCR反应，互为阴性对照和阳性对照，结果更可靠。

21 （5）基因扩增的诊断 以待测基因的DNA片段或cDNA片段作为探针，采用适当的限制酶将基因组DNA进行酶切，通过Southern印迹杂交分析。若基因组中该基因(或DNA片段)的拷贝数发生改变，杂交后显示的条带位置会发生改变，对放射性自显影条带进行吸光度扫描，可进行基因定量。

22 2、多态性分析 （1）限制性片段长度多态性分析
在人群中，个体间基因组的核苷酸序列存在着差异性，称为DNA的多态性。突变、重排、单个核苷酸的插入或缺失可使DNA顺序发生改变。其中有些可能造成限制酶切位点的增加、缺失或易位，致使DNA分子的限制酶切位点数目、位置发生改变。用限制酶切割基因组时，所产生的限制性片段的数目和每个片段的长度就不同，这就是限制性片段长度多态性(RFLP restriction fragment length polymorphism)。能导致限制性片段发生改变的酶切位点又称为多态性位点。

23 限制酶酶切位点改变造成的RFLP可分为两种情况：①在限制酶识别位点发生单个碱基置换，导致这一多态性位点的丢失或获得，称为点多态性。这种多态性只有两个等位片段，即多态性位点有或无。②由于限制酶识别位点之间的DNA序列缺失、插入或重复，限制酶的识别序列不发生改变，但它在基因组中相对位置发生了变化，这类多态性可以有两个或两个以上的等位片段。

24 RFLP分析法主要有限制酶酶切图谱直接分析法和RFLP间接分析法。
①限制酶酶切图谱直接分析法：适用于分析点多态性、核苷酸的缺失、插入或重组引起的多态性，可用于诊断疾病基因结构多态性变异已经明确的疾病。

25 其方法有两种：一种是根据已知的变异选用特定的限制酶水解DNA，然后用特异探针进行Southern印迹杂交，若存在疾病基因则显示与正常人不同舶杂交条带，据此诊断疾病。另一方法是用PCR法将基因片段扩增后，再用特定限制酶水解扩增产物，分析酶解后产物分子的大小，判断是否有疾病基因。

26 如Lener遗传性视神经病，是由线粒体，DNA(mtDNA)发生突变而引起的。大多数Lener病患者第11778位的G→A，这种转换使Sfa N I酶切位点丧失。在该位点两端设计一对引物，PCR产物为340bp。正常个体的PCR产物经Sfa N I酶切后电泳，出现190bp和150bp两条带，而患者只出现340bp一条带。有的个体出现了340bp、190bp和150bp三条带，说明该个体存在野生型和突变型两种类型的mtDNA。

27 ②RFLP间接分析法 大多数由基因缺陷引起的遗传性疾病的基因结构、突变情况和基因产物等遗传基础并不清楚，不能应用限制酶酶切图谱直接分析法进行诊断，而需要采用基因连锁分析。 RFLP按照孟德尔方式遗传。在某一特定的家庭中，如果某一致病基因与特异的多态性片段紧密连锁，就可用这一种“遗传标记”来判断家庭成员或胎儿的基因组中是否携带有致病基因。这种通过对RFLP的连锁分析对疾病基因进行间接诊断的方法称为RFLP间接分析法。

28 另外，当重要的DNA多态性位点周围的DNA序列已知时，应用PCR方法可以简便地检测到家庭成员中这些多态性位点的存在和丢失，通过连锁分析，即可对有遗传危险的胎儿进行产前诊断和携带者检测，这称为PCR／RFLP连锁分析法。

29 （2）DNA重复序列多态性分析 人类基因的基因内或旁侧序列存在许多重复序列(如微卫星DNA 2-6个碱基重复序列、小卫星DNA 6-12个碱基重复序列等)，由于重复单位的数目不同而形成多态性。已发现一些基因结构或表达异常与这些重复序列相关。对这些重复序列的多态性分析也成为基因诊断的重要依据。 如果重复序列两侧的DNA序列已知，即可根据这些序列设计PCR引物，通过PCR产物的电泳分析来检测重复序列的多态性。

30 3、基因表达异常的诊断 结构基因变异可引起疾病，基因表达过程发生异常亦可引起疾病。通过RNA诊断可对待测基因的转录产物(mRNA)进行定量分析，检测其转录和加工的缺陷以及外显子的变异等，既可用于疾病的诊断，也可用于基因治疗效果的监测。常用的诊断方法有如下几种：

31 （1）mRNA的相对定量分析 ①斑点杂交或狭缝杂交：将放射性核素标记的DNA探针与点在硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上的待测RNA进行杂交，经放射自显影后进行吸光度扫描，通过正常对照与待测标本的比较可以确定待测RNA表达量的高低。

32 ②RT-PCR(逆转录PCR)法: 从表达某一特定基因的组织中提取总RNA，经逆转录酶合成cDNA，然后采用PCR扩增cDNA片段，经凝胶电泳分离后，进行吸光度扫描，计算出相应的RNA含量。如果加人带有放射性核素标记的dNTP作为PCR的底物，那么PCR产物经电泳分离后切出凝胶中的cDNA片段，测定其放射性活度，即可推算出mRNA的含量。

33 （2）mRNA的绝对定量分析 可采用RT-PCR/竞争性PCR的方法。构建一组与待测mRNA相似，但长度相差约50bp的“标准cDNA链”，并稀释成已知的不同浓度，然后与待测mRNA逆转录产物(cDNA)一起作为模板，在相同的扩增引物的指导下进行竞争性PCR反应，以α-32P-dCTP作标记。依次测定竞争性PCR后两组扩增产物的放射性活度，经计算机处理后计算出mRNA样品的绝对含量。

34 （3）mRNA长度分析 可采用Northern杂交法，将琼脂糖凝胶电泳分离后的RNA转移到硝酸纤维素滤膜上后，再与放射性核素标记的DNA探针杂交，根据放射自显影图谱，可检测某种特异的mRNA的长度有无变化。也可根据RT-PCR产物电泳条带的位置，判断cDNA的长度和大小，确定相应的mRNA区段是否有长度改变。通过长度分析可以初步确定基因中是否有缺失或插入，以及是否有mRNA剪接加工缺陷的可能。随后进一步进行序列分析。

35 4、外源DNA检测 细菌、病毒、支原体、立克次体和寄生虫等病原体侵入机体后引起机体发生感染性疾病。以前对病原体的检测主要应用微生物学、免疫学和血清学等方法，但上述方法存在不足之处，灵敏度不高或特异性较低，不能早期诊断。如今许多病原体的基因结构已被阐明，应用核酸分子杂交或PCR等技术，设计基因特异性探针，或合成特异的寡核苷酸引物，可直接从临床标本中检测病原体基因组核酸（DNA或RNA）的存在，即可早期、快速、敏感、特异地确定病原体的存在。

36 三、遗传病的基因诊断 （一）遗传性疾病的种类 （二）遗传性疾病基因诊断的策略 1、血红蛋白病 2、杜氏肌营养不良症 3、甲型血友病 ……
现已证实，所有遗传性疾病都是由于某种基因的缺失或变异所致。对这类疾病进行基因诊断可采取两种策略：直接诊断策略和间接诊断策略。

37 2、间接诊断策略 即采用多态性连锁分析的方法，寻找具有基因缺陷的染色体，并判断被检者是否有这条染色体。
1、直接诊断策略 即采用基因突变的诊断方法，通过各种分子生物学技术直接检测导致遗传性疾病发生的各种基因突变。这种策略的前提是被检测基因必须已被克隆，基因的正常序列和结构已被阐明。 对DNA较小范围的改变，可采用PCR技术进行检测；对于较长的DNA片段的突变，常选择核酸分子杂交技术来进行检测。 2、间接诊断策略 即采用多态性连锁分析的方法，寻找具有基因缺陷的染色体，并判断被检者是否有这条染色体。

38 在许多情况下，疾病的致病基因尚未被克隆而无法进行直接诊断，但若致病位点已在基因组中被定位，则可以采用间接诊断策略。
一般应用尽可能靠近致病位点的基因外探针或利用人类基因组中的一些重复序列作为遗传标记，通过多态性分析给致病的那条染色体定标记，从而确定被检者是否带有这 一致病染色体。间接诊断必须具有较完整的家系资料，家系中必须具备先证者。

39 间接诊断并不是寻找DNA的遗传缺陷，而是通过分析DNA的遗传标记的多态性来判断被检者是否具有带致病基因的染色体，是判断被检者患病的可能性。
（三）遗传性疾病检测方法 遗传性疾病共同检测诊断方法 1、DNA检测与分析 2、RNA检测与分析

40 例：异常血红蛋白病的基因诊断 异常血红蛋白病是由于珠蛋白基因的突变导致珠蛋白肽链结构发生异常的一类血红蛋白分子病，其中珠蛋白基因的突变包括：单个碱基替代，密码子的缺失与插入，移码突变，终止密码突变，融合突变(编码两条不同肽链的基因发生重排而形成融合基因)。可通过DNA检测分析和RNA检测分析进行诊断。

41 A. DNA检测与分析：如Hb D Punjab是我国常见的一种异常血红蛋白病，它是由血红蛋白β链第121位密码子由GAA(谷氨酸)突变为CAA(谷氨酰胺)所致。该突变同时使限制酶．EcoRI位点消失(GAATTC→CAATTC)，应用PCR技术结合限制酶酶谱分析即可快速、简便地鉴定该疾病。具体方法是扩增β珠蛋白基因第3个外显子的大部分和基因3’端的DNA序列，共长144bp，用EcoRI消化后，在电泳凝胶上可以观察到40bp和104bp两个片段，然而在Hb D Punjab杂合子，扩增DNA经EcoRI消化后就同时具有144bp和104+40bp两种类型。

42 又如镰刀形红细胞性贫血症是由于β珠蛋白基因的第6位密码子由GAA突变为GUA，导致HbS的β链第6位的谷氨酸被缬氨酸替代。镰刀形红细胞性贫血症的基因诊断可采用：①PCR／限制酶谱分析法，扩增的294bpβ珠蛋白基因片段不能被OxaNI酶切，电泳图仅见294bp片段。正常人的扩增片段，可被该酶切成191bp和103bp两个片段。②合成特异的寡核苷酸探针进行Southern印迹杂交分析。 B. RNA检测与分析：直接测定异常血红蛋白病人珠蛋白mRNA的RT-PCR产物序列，可准确鉴定出基因编码区的碱基变化，进而推导出肽链中相应氨基酸的改变。

43 四、感染性疾病的基因诊断 （一）感染性疾病的种类 1、病毒性肝炎 2、细菌性疾病 3、寄生虫疾病 （二）感染性疾病基因诊断的策略
1、病毒性肝炎 2、细菌性疾病 3、寄生虫疾病 （二）感染性疾病基因诊断的策略 感染性疾病是由于感染了某种病原体而引起的一类疾病。过去对这类疾病的病因诊断是通过检测病原体的形态或通过病原体的培养观察其生态、生化特性以及毒性试验等，或检测病人体内特异性抗体等方法作出判断。这些方法存在较大缺陷。

44 病原体都是生物体，每种生物都有各自种族特异的基因。DNA重组技术的发展，对多种病原体的基因作了大量的分析工作，对常见病原体的特异基因或DNA片段的组成特点积累了大量的资料。现在可采用核酸分子杂交技术，针对病原体特异的核酸序列设计探针来进行杂交；或应用PCR技术扩增病原体基因的保守序列；或将核酸分子杂交技术与PCR技术联合应用，能够对大多数感染性疾病作出明确的病原体诊断，而且能诊断出带菌者和潜在性感染，并能对病原体进行分类、分型鉴定。

45 五、肿瘤的基因诊断 （一）肿瘤基因诊断的策略 （二）检测方法 （以肝炎为例） 1. PCR法 2. 核酸分子杂交法 3. DNA芯片技术
（二）检测方法 （以肝炎为例） 1. PCR法 2. 核酸分子杂交法 3. DNA芯片技术 五、肿瘤的基因诊断 （一）肿瘤基因诊断的策略 肿瘤的发生发展是多因素、多基因、多阶段相互协同作用的癌变过程，其关键是人类细胞基因组本身出现异常。目前，肿瘤的基因诊断可采取以下策略。

46 1、检测肿瘤相关基因 如癌基因、抑癌基因、肿瘤转移基因、肿瘤转移抑制基因等基因的突变及表达异常。可应用基因突变及表达异常的诊断方法。
2、检测肿瘤相关病毒的基因 如①与鼻咽癌、Burkitt 淋巴瘤有关的EB病毒；②与宫颈癌有关的人类乳头瘤病毒（human papilloma virus, HPV）；③与肝癌有关的乙肝病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）；④与成人T细胞性白血病、淋巴瘤有关的HTLV-1病毒等；均可采用病原体的诊断方法。 3、检测肿瘤标志物基因或mRNA。

47 （二）肿瘤相关基因的检测 1、ras癌基因的检测 2、抑癌基因p53的检测 3、其它基因的检测

48 六、基因诊断在法医学中的应用 （一）法医学鉴定的分子基础
人类个体的多样性和个性取决于基因组DNA核苷酸序列的差异，即DNA的多态性。其中，微卫星DNA和小卫星DNA等是重要的多态性标志。这些重复序列在不同个体间的重复单位数目不同，变化很大。但在不同个体中，重复序列两侧的DNA片段的碱基组成相同，因此可用同一种限制酶，将不同个体的重复序列从其两侧切下来。由于重复单位数目不同，因而获得的酶切片段长度不同。若以PCR扩增这些序列，采用相同的引物可以扩增出不同长度的DNA片段。

49 针对重复序列人工合成寡核苷酸短片段作为探针，与经过酶切的人基因组DNA进行Southern印迹杂交，可以得到大小不等的杂交带，而且杂交带的数目和分子量大小具有个体特异性，就像人的指纹一样，因而把这种杂交带图谱称为DNA指纹或基因指纹(gene finger-printing)。由探针杂交产生的DNA指纹具有以下特点： ①一个DNA指纹探针可同时检测十几个、甚至几十个位点的变异，因而DNA指纹更能反映基因组的特异性；

50 ②具有高度特异性，只有同卵双生子女才会有完全相同的 指纹；
③具有稳定的遗传性，通过家系分析表明，DNA指纹谱中几乎每一条带都能在双亲之一的指纹谱中找到，而产生新带的概率仅为0.001％～0.004％之间； ④DNA指纹图谱具有体细胞稳定性，即从同一个体中不同组织、血液、肌肉、毛发、精液等产生的DNA指纹完全一样。因此，DNA指纹可作为法医学鉴定的有力依据。

51 （二）DNA指纹与法医学鉴定 法医学鉴定的主要目的是个人识别和亲子鉴定。以前应用的是血型、血清蛋白型、红细胞酶型和白细胞膜蛋白抗原型(HLA)分析及特异性探针RFLP分析，但所有这些方法无论是单独使用还是联合应用，其个体识别能力均不够，只能排除而无法达到同一认定。由于DNA指纹具有很高个体特异性，在法医学鉴定中得到广泛应用。DNA指纹分析的主要手段是进行Southern印迹杂交，其基本操作与一般RFLP分析基本相同。结合PCR扩增技术，法医物证检验的DNA指纹分析尤为有意义。

52 在法医物证检测中，在同一张Southern blot图上对现场检材(如一根毛发，单个精斑，一滴血，少许唾液等)的DNA指纹和嫌疑对象的DNA指纹进行对比，确定二者的相关性。如果条带完全一致(包括条带的位置和强度)，则为同一个体。有时，二者可能出现一些差异，则要计算同一认定的可信程度或经过相关的技术处理。 在亲子鉴定时，要同时分析父母(生物学上的父母或嫌疑对象)的DNA指纹。被鉴定对象的DNA指纹条带来自父母双方，因此可从父母(生物学父母)的基因指纹图谱中找到相应条带。

53 目前正在开发、分离的第三代DNA多态性标记系统——单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)标记，可作为特异性基因标记以区分个体之间的差异。SNP结合DNA芯片技术的方法将成为法医学鉴定中一种很有前景的新方法。

54 第二节 基因治疗 随着在细胞分子水平上对疾病发病机制认识的深入，基因治疗已成为目前医学分子生物学最重要的研究领域之一。人类基因治疗最初着眼于遗传病。1990年开始对腺苷酸脱氨酶(ADA)缺陷所致的先天性免疫缺陷综合症进行体细胞基因治 疗并初见成效。随着基因治疗基础研究的不断突破，现在基因治疗不仅用于治疗多种遗传病(如血友病等)，也已用于治疗恶性肿瘤、某些传染病(如艾滋病)、心血管疾病和糖尿病

55 等的治疗。今后临床基因治疗的应用范围将会进一步扩大。
作为一种新的治疗手段，基因治疗为许多疑难病症的治疗带来了希望，在临床疾病治疗中有着极大的发展潜力。然而，基因治疗还存在着许多问题和困难，其中一些在目前还是难以逾越的障碍。因此，在了解基因治疗的原理和应用前景的同时，也应了解各种基因治疗面临的问题和困难，对基因治疗的现状和发展前景应该有一个正确的认识。

56 一、基因治疗的概念 基因治疗(gene therapy)是指通过在特定靶细胞中表达该细胞本来不表达的基因，或采用特定方式关闭、抑制异常表达基因，达到治疗疾病目的的治疗方法。 在基因治疗研究的早期，基因治疗是指将目的基因导入靶细胞后与宿主细胞内的基因组发生整合，成为宿主遗传物质的一部分，目的基因表达产物起到对疾病的治疗作用。随着基因治疗基础研究的发展，治疗研究的技术不断进

57 步，研究内容也不断扩展，不仅可以将外源性正常基因导入到病变细胞中，替代或与缺陷基因共存，产生正常基因表达产物以补充缺失的或失去正常功能的蛋白质，而且可以采用适当的技术抑制细胞内过盛表达的基因，达到治疗疾病的目的；还可以将特定的基因导入非病变细胞，在体内表达特定产物，达到治疗疾病的目的；也可以向功能或生物学特性异常的细胞中导入细胞本来不表达的基因，利用其表达产物达到治疗疾病的目的。在这些治疗研究中，所应用的目的基因就像临床上使用的药物一样，在治疗中发挥作用。

58 二、基因治疗研究的主要内容或策略 （一）基因标记
基因标记(gene labeling)实验是基因治疗的前奏。标记假定对患者有治疗作用的细胞，用标记实验验证两个问题： ①外源基因能否安全地转移到患者体内； ②从患者体内取出的细胞能否检测到转移基因的存在。 接受标记实验的患者不一定直接获得治疗效果，其主要目的是得到对于进一步临床基因治疗有用的信息。目前常用的基因标记

59 方法是将含neo基因(neomycin phosphorransferase gene,新霉素磷酸转移酶基因)的重组逆转录病毒载体在体外转染细胞，然后输入体内，可以很方便地跟踪这种标记细胞的命运。
最早进行的基因标记临床研究是肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)基因标记实验。从恶性黑色素瘤组织或转移淋巴结制备TIL细胞，在IL-2的存在下进行培养。这种TIL能杀伤肿瘤细胞。基因标记实验是在体外将含有抗性标记基因(neo基因)的逆转录病毒载体转染TIL，传代培养的TIL即含有neo基因，能在含抗生素G418的培养液中生长，筛选出基因转染细胞。

60 将这种基因修饰过的TIL注射给黑色素瘤患者，可以研究TIL在体内各组织器官、血液循环、淋巴结、肿瘤组织的分布情况，观察TIL是否能进入肿瘤组织以及它在体内的存活时间，同时能了解这种体外基因修饰过的TIL是否会自主生长和恶变，注射后对人体是否有害，这些问题的研究为基因治疗打下了基础。 恶性肿瘤(特别是白血病)患者在进行大剂量化疗后，机体免疫防御功能也受到严重破坏。在这种情况下，常需给病人输回在治疗前储存的自身骨髓以重建骨髓的正常功能。

61 若将骨髓细胞进行标记，便于研究输入骨髓细胞的命运，以了解移植骨髓细胞重建的生物学，为骨髓移植提供更合适的条件，同时也可作为判断净化骨髓细胞中的肿瘤细胞方法成功与否的指标。
同样，在进行其它各种疾病的治疗之前，都可以进行类似的标记实验，以获得基因治疗研究中的许多必需的资料。

62 （二）基因置换 所谓基因置换(gene replacement)或称基因矫正(gene correction)，是指将特定的目的基因导入特定的细胞，通过定位重组，以导入的正常基因置换基因组内原有的缺陷基因。基因置换的目的是纠正缺陷基因，将缺陷基因的异常序列进行矫正，对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，不涉及基因组的任何改变。 基因置换的必要条件是：①对导入的基因及其产物有详尽的了解；②外来基因能有效地导入靶细胞；③导入基因能在靶细胞中长期稳定驻留；④导入基因能有适度水平的表达；⑤基因导入的方法及所用载体对宿主细胞安全无害。

63 利用基因打靶技术，在基因置换的实验研究中已取得了一些进展。Oliver等利用基因同源重组的基因打靶技术将人的β-珠蛋白基因实现了定点整合。Capeehi等应用小鼠胚胎干细胞(ES)也实现了次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)基因的定点重组。实现定点重组或整合的条件是转导基因的载体具有与染色体上的DNA相同的序列。这样，带有目的基因的载体就能找到同源重组的位点进行部分基因序列的交换，以使基因置换这一基因治疗策略得以实现。

64 要实现基因置换，需要采用同源重组使相应的正常基因定位导入受体细胞的基因缺陷部位。定位导入的自然发生率约1／100万，采用胚胎干细胞培养的方法，这种同源重组的检出率最高可达1／10。考虑到正常体细胞的生命周期，以及克隆筛选等实验给细胞生长带来的一系列问题尚未解决，因此用同源重组修复异常基因的方法进行遗传病的基因治疗只能作为远期目标。

65 (三)基因添加 基因添加或称基因增补(gene augmentation)是通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。基因添加有两种类型： 一是针对特定的缺陷基因导入其相应的正常基因，使导入的正常基因整合到基因组中，而细胞内的缺陷基因并未除去，通过导入的正常基因表达正常产物，从而补偿缺陷基因的功能； 二是向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因，利用其表达产物达到治疗疾病的目的。例如，将细胞因子基因导入肿瘤细胞进行表达，即属于这一类型。 基因添加与基因置换一样，也必须具备上述5个必要条件。

66 (四)基因干预 基因干预(gene interference)是指采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。较常用的方法是采用反义核酸或反义核酸加核酶，抑制基因的表达。此类基因治疗的靶基因往往是过度表达的癌基因或者是病毒的基因。

67 三、基因转移技术和靶细胞 基因治疗的方式有两种：第一种是体内直接转基因，称为体内法，这是最有前途的方式，也是各种基因转移技术集中攻关的方向。但目前仍存在转移和表达效率低等困难。现已在腹腔、静脉、动脉、肝、肌肉、气管、乳腺及脑等多种组织器官获得成功。第二种是细胞介导的基因治疗，称为回体法，即先将合适的靶细胞在体外进行增殖，将外源基因导入细胞内使其能高效表达，然后再将这种基因修饰过的细胞回输病人体内，使外

68 源基因在体内表达，从而达到治疗目的。这是目前最常用的方式，所使用的靶细胞既有细胞株也有原代细胞。
无论采用何种方式，基因治疗都必须通过适当的基因转移(gene transfer)技术将外源基因转移至特定细胞内。基因转移技术有两大类：生物学方法和非生物学方法。前者主要是利用载有外源基因的缺陷病毒感染受体细胞，后者是通过物理或化学方法将DNA导入细胞。两类方法各有千秋，每一类的各种方法也有各自的特点，使用上也有一定的侧重。

69 ψ （一）基因转移的生物学方法 （以逆转录病毒载体为例） 逆转录病毒载体是基因治疗中最常用的载体。
1、逆转录病毒载体的结构 常用的逆转录病毒载体是从小鼠白血病病毒（Mo-MLV）的前病毒（DNA）制备的。同所有逆转录病毒一样，该病毒基因组可分为两类组分：一是编码病毒功能蛋白的结构基因gag、pol、env，也称为反式功能区；二是复制、整合、RNA转录及包装所必须的顺式作用区。 ψ LTR LTR LTR：长末端重复序列 Ψ：包装信号序列 gag pol env 逆转录病毒（9.8Kb）

70 将前病毒DNA中编码功能蛋白的基因切除，而保留顺式作用区，并将其插入质粒，即构成了逆转录病毒载体。在前病毒区插入了一个抗性标记基因，供阳性筛选用。
5′ LTR Neo 3′ LTR ψ 插入外源 cDNA Ampr ori E （ ） RNA 转染包装细胞， 在包装细胞中包装成假病毒 转录出RNA 逆转录病毒载体

71 2、包装细胞 包装细胞（packaging cell）系是将缺失了包装信号及相关序列的缺陷型逆转录病毒（辅助病毒）导入哺乳动物细胞而制备成的一种特殊的细胞系，这种细胞因携带有逆转录病毒基因组而能够大量产生病毒包装蛋白，而辅助病毒自身缺乏包装信号（ψ序列）而不能包装，不产生病毒颗粒。 3、逆转录病毒载体的特点 逆转录病毒载体转变成假病毒颗粒后，假病毒颗粒中所包含的RNA与逆转录病毒基因组的结构相似，实际上只是以目的基因和标记基因取代了病毒的结构基因。感染靶细胞的过程与普通逆转录病毒一样。

72 4、逆转录病毒载体用于基因治疗的安全性问题
（1）逆转录病毒感染的可能性：不能完全排除逆转录病毒载体与辅助病毒发生重组，恢复成完整的野生型病毒。 （2）污染的可能性：目前所用的逆转录病毒载体的假病毒都是从细胞培养上清中制备，不能像人工合成的产品那样进行纯化，污染的几率较高。 （3）逆转录病毒载体在靶细胞基因组的整合：导入的基因与其整合部位的相邻基因的表达可能相互影响。

73 （二）基因转移的非生物学方法 1、载体--脂质体 用人工方法将磷脂在水溶液中形成一种脂质双层包围水溶液的脂质微球，称脂质体（liposome）。脂质分子在水溶液中形成脂质微球时，可将生物大分子（如酶、抗体、核酸等）或小分子药物包入脂质微球中，因此它可作为一种运载工具，通过脂质体膜与体细胞的相互作用（包括膜融合、被吞噬等），把含有特殊功能的生物大分子及小分子药物导入细胞中。

74 脂质体可以携带各种基因片段，保护基因不被核酸酶降解。脂质体的脂双层分子可以掺入糖脂和抗体等归巢装置，提高脂质体靶向性。通过静脉注射，脂质体可将所携带基因选择性地导入靶细胞中，达到基因治疗的目的。因此，脂质体作为载体在基因治疗中具有广阔的应用前景。

75 将裸露DNA直接注入肌肉内。外源基因在肌肉中的表达量与注入的外源性基因含量成正比，与溶液体积无关。
2、方法 (1)直接注射 将裸露DNA直接注入肌肉内。外源基因在肌肉中的表达量与注入的外源性基因含量成正比，与溶液体积无关。 (2)受体介导基因转移技术 受体介导的细胞内吞作用是20世纪70年代发现的细胞转移特异外源物质进入细胞的一种方式。细胞膜上存在一些专一性受体，是组织或器官特异的。当这些受体专一性地与相应的配体结合后，所形成的受体配体复合物就会在细胞膜上某些特定区域富集，通过细胞的内吞作用，实现这些配体向细胞内转移。

76 受体介导的吞噬作用有两个明显特点： ①具有细胞、组织或器官专一性，配体只能被一些特异的细胞吞噬； ②配体进入细胞的转移效率很高。 (3)其它方法 基因转移的非生物学方法还有DNA-磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、显微注射、颗粒轰击等。

77 （三）基因转移的靶细胞 基因治疗中，选择什么样的细胞作为基因转染的靶细胞，是基因治疗成功与否的一个重要因素。可供选择的靶细胞有两大类。一类是生殖细胞，另一类是体细胞。 目前常用靶细胞主要有以下几种： 1、造血细胞 造血组织细胞在体内多处分布，有较多的遗传病与造血组织有关，骨髓移植方法已经建立，使造血细胞成为基因治疗中最重要的受体细胞。骨髓中的造血干细胞能分化成各系血细胞，具有移植方便、繁殖能力强等特点，是基因治疗合适的靶细胞。

78 2、皮肤成纤维细胞 容易移植并可经体外培养生长，在进行皮肤移植的鼠模型中可持续存在，因此皮肤成纤维细胞也可作为基因转移的靶细胞。
3、肝细胞 肝是重要的代谢器官，许多遗传病都是由于肝特异的基因产物缺陷而引起的，肝也是肿瘤的高发部位；此外，肝细胞作为移植细胞也可在异位发挥功能，与葡萄糖基质连接的肝细胞可在腹腔内生存2个月，并在1个月内有功能。因此，肝细胞作为受体细胞是基因治疗研究的热点之一。 4、血管内皮细胞 将基因导入血管内皮细胞，可以直接向血液中分泌基因表达产物。

79 5、淋巴细胞 外周血淋巴细胞中的T淋巴担负着重要的免疫功能，也很容易从体内取出和回输，可以在体外进行培养和扩增，并对目前常用的几种基因转移方法都具有一定的敏感度。
6、肌肉细胞 骨骼肌细胞的突出特点是可采用直接体内基因转移，即将真核表达载体直接注射入骨骼肌。 7、肿瘤细胞 肿瘤细胞对目前绝大多数的基因转移方法都比较敏感，特别是肿瘤细胞始终处于旺盛的分裂状态，可进行高效率的转导。 8、其它细胞 许多实质器官细胞、心肌细胞和脾细胞

80 （一）反义RNA(anti-sense RNA)
四、反义RNA、核酶及三链DNA在基因治疗中的应用 （一）反义RNA(anti-sense RNA) 反义RNA是指与mRNA互补后，能抑制与疾病发生直接相关基因的表达的RNA。它封闭基因表达，具有特异性强、操作简单的特点，可用来治疗由基因突变或过度表达导致的疾病和严重感染性疾病。 1、反义RNA治疗的基本方法 1） 反义寡核苷酸（反义ON） 体外合成10至几十个核苷酸的反义ON或反义硫代磷酸酯寡核苷酸序列，用脂质体等将反义ON导入体内靶细胞，然后反义ON与相应mRNA特异性结合，从而阻断mRNA的翻译。

81 2） 反义RNA表达载体 合成或PCR扩增获取反义RNA的DNA，将它克隆到表达载体，然后将表达载体用脂质体导入靶细胞，该DNA转录反义RNA，反义RNA即与相应的mRNA特异性结合，同样阻断某基因的翻译。 2、反义RNA的特点与问题 反义RNA用于基因治疗具有以下特点： 　　1） 具有特异性强 只阻断靶基因的翻译表达。 　　2） 安全性好 反义RNA只与特定mRNA结合，不改变 基因结构，最终会被RNase水解，不残留。　

82 3） 操作简单 反义ON可大量合成，反义RNA的DNA既可合成又可PCR扩增获得。 4） 靶基因范围广 适应于多种疾病，亦可同时用多个反义RNA封闭多个基因，有可能应用于多基因病。
但是，反义RNA作为基因治疗的常规药物，还存在一些需要解决： 1） 反义RNA的选择设计难 反义RNA与mRNA亲和力、结合的特异性受结合位点两侧序列的二级或三级结构的影响。

83 2） 有副作用问题 副作用与反义ON的多聚阴离子性质有关，目前有人正在试图去除多聚阴离子性质，减少副作用。
3、反义RNA的应用 　反义RNA目前主要用于恶性肿瘤、病毒感染性疾病等。 1）恶性肿瘤 用反义K-ras封闭胰腺癌、肺癌的K-ras癌基因，对癌细胞具有明显的抑制作用。用反义RNA封闭慢性粒细胞白血病的bcr-abl融合基因的表达，能抑制肿瘤细胞的生长。通过反义RNA抑制程序性细胞死亡的拮抗基因bcl-2可提高化疗药对T淋巴细胞白血病细胞的杀伤作用。反义bcl-2亦可阻碍非何杰金氏淋巴肉瘤的生长。

84 2）病毒性疾病 HIV的反式激活蛋白反应顺序（TAR）与TAT蛋白结合可促使HIV转录，当用反义TAR封闭TAR时，可终止HIV的转录，现已取得体外抗HIV的效果。反义RNA对麻疹病毒也有显著的拮抗作用。 3）其他疾病 用胞间粘着分子的反义ON治疗肠炎病人，70%的病人其症状得到控制。针对CMV的反义ON也用于治疗CMV-视网膜炎病人。针对血管平滑肌细胞增殖的生长因子的反义ON能预防血管成形术后的再狭窄。

85 （二）核酶 1、核酶的概念 在没有任何蛋白质（酶）存在的条件下，某些RNA分子也能催化其自身或其它RNA分子进行化学反应，即某些RNA具有酶样的催化活性，这类具有催化活力的RNA被命名为核酶（ribozyme）。（P15） 2、核酶的基本组成 用于基因治疗的核酶分子由三个部分组成，中间是保守序列（能够组成酶活性结构域），两端是引导序列（guide sequences）。引导序列随靶序列的碱基组成而变。

86 3、核酶的应用 与一般的反义RNA相比，核酶具有较稳定的空间结构，不易受到RNA酶的攻击，而更重要的是，核酶在切断mRNA后，又可从杂交链上解脱下来，重新结合和切割其它的mRNA。
核酶导入细胞有两种方法： 一是外源导入，多用脂质体法，将体外转录合成的核酶通过脂质体包裹后，导入细胞。 二是内源导入，即通过真核表达载体在细胞内表达核酶。

87 （三）三链DNA (triple-strand DNA)
根据寡聚脱氧核苷酸（ODN）或脱氧寡核苷酸（TFO）与靶DNA的结合具有高度序列特异性，通过TFO在DNA结合蛋白的识别位点处，与靶基因结合形成三螺旋，从而专一性地干扰DNA与反式作用因子的结合，抑制转录起始或转录延伸，在转录水平上抑制基因表达。进行负调控。 见 Page 11 图2-3 和 图2-4

88 分子内三链DNA形成的4种同分异构体

89 （a）三股螺旋DNA （b）三股螺旋DNA三维投影图

90 五、基因治疗的应用研究 （一）遗传病的基因治疗研究
基因治疗方案用于人体之前必须进行三个阶段的试验，即体外研究、小鼠体内研究和灵长类动物体内研究，以保证对人体无害。 （一）遗传病的基因治疗研究 目前发现的单基因病至少已有6000余种，其中有临床改变的遗传病约3000种。随着人们生活条件与医疗水平的提高，多种传染病得到控制，而遗传病的危害逐渐突出。 应用：人类历史上第一种进行基因治疗的疾病是腺苷脱氨酶缺乏症，该病的基因治疗是一个较成功的范例。

91 1、腺苷脱氨酶缺陷遗传病 腺苷脱氨酶（adenosine deaminase, ADA）是核酸代谢反应中催化腺嘌呤核苷（A）和脱氧腺嘌呤核苷（dA）脱氨的一种酶，含362个氨基酸。人ADA基因定位于20q12-q13.11染色体位置上。ADA的基因长32kb，由12个外显子和11个内含子构成。 正常情况下，ADA可由多种不同组织细胞类型表达。胸腺细胞和T淋巴母细胞表达ADA mRNA的水平最高。在ADA缺陷病人体内，ADA基因可发生错义突变或大片段缺失，亦可发生内含子序列缺失，从而导致相应的氨基酸序列的变化或发生氨基酸替代，改变蛋白质的空间结构及稳定性，使酶活性丧失，最终引发ADA缺陷。

92 2、ADA缺陷基因治疗的实验研究 从1984年开始，ADA缺陷病的治疗转向基因治疗研究。 ADA缺乏症基因治疗研究中，基因转移采用的是逆转录病毒载体途径。实验研究包括体外培养的离体细胞ADA基因的转移，低等动物（如小鼠等）淋巴细胞ADA基因转移、回输，以及较高等的动物如猴的淋巴细胞ADA基因转移、回输。 3、ADA缺陷的临床基因治疗 年，美国RAC与FDA批准了ADA缺陷的基因治疗。临床基因治疗于当年开始。第一个接受基因治疗的是一个4岁女孩。患儿从1990年9月起的10个半月中，共接受了7次自体细胞输注，同时每周注射PEG-ADA，患儿免疫功能增强，临床症状改善。

93 4、ADA缺陷临床基因治疗的潜在问题 淋巴细胞是ADA缺乏症基因治疗的靶细胞中较为常用的种类。但淋巴细胞的寿命一般较短。随着转染淋巴细胞的死亡，ADA的表达量势必逐渐下降，到一定程度，ADA的分泌量不足以发挥其治疗作用，就必须重新进行基因治疗程序。因此，需要寿命较长的靶细胞. 骨髓造血干细胞的寿命较长，在小鼠等动物和人体上，以逆转录病毒载体转染已有成功的报道。但骨髓干细胞在骨髓整个细胞群中难以分离培养。人们希望通过骨髓干细胞的转染回输，达到持久的疗效，起码可以减少重复基因治疗的次数。

94 （二）肿瘤的基因治疗研究 肿瘤是一种非常复杂的疾病，因此，肿瘤基因治疗的策略也具有多样性。
1、修正肿瘤相关基因的功能 肿瘤是一种多基因遗传病，修正其功能和恢复抑癌基因的功能可以使一些恶性肿瘤细胞得到一定程度的逆转。 （1）恢复抑癌基因的功能 通过基因转染的方法将正常抑癌基因导入肿瘤细胞，使之表达正常的抑癌基因产物，可以在一定程度上抑制肿瘤的恶性表型。研究较多的是p53和Rb基因。 （2）纠正癌基因的表达 2、导入特定的基因产生肿瘤特异的药物敏感性 病毒导向的酶解药物前体疗法（virus-directed enxyme prodrug therapy, VDEPT）是一种特殊的肿瘤基因治疗方法。其核心是利用组织或细胞特异的基因表达调控元件，使目的基因的表达只在相应组织或细胞中存在。

95 3、肿瘤的免疫基因治疗 免疫系统在癌症防治中起着至关重要的作用。
（1）外源基因导入肿瘤细胞 ： 产生免疫刺激作用 （2）外源基因导入免疫细胞：直接调整细胞介导免疫功能，杀伤肿瘤。 （3）肿瘤的免疫基因治疗面临的问题 a.细胞因子作用的双重性 b.细胞因子基因转染肿瘤细胞疫苗的有效性

96 六、基因治疗的前景与问题 基因治疗是近20年来分子生物学和重组DNA技术迅速发展的一种结果。从理论上讲，若能将缺陷的基因进行原位的修补，应是疾病的一种根治方法，可惜目前还不能达到此目的，这应是今后研究的一个重要方向。有着良好的前景，但是对其利与弊要充分估计，尚有许多理论性和技术性的问题。

97 注意问题： 1、基因治疗中所用的各种启动子，在不同种类的体细 胞中表达效率是不同的。 2、基因治疗研究中，体外基因转移是一个重要的研究
领域，人体细胞在体外进行长期培养和繁殖，细胞 的生物学特性是否会改变是值得研究的问题。 3、基因治疗研究中，导入外源基因对机体的不利影响 也是一个不容忽视的问题。

98 小 结 基因诊断是以DNA和RNA为诊断材料，通过应用分子生物学技术，检查基因的存在、结构缺陷或表达异常，对人体状态和疾病作出诊断的方法和过程。基因诊断的方法主要包括：①基因突变的检测；②多态性分析；③基因表达的检测；④外源DNA的检测。在这个过程中，常应用核酸分子杂交、PCR、SSCP检测、限制酶酶谱分析、DNA序列测定、DNA芯片等技术。基因诊断已广泛应用于遗传病、感染性疾病、肿瘤的诊断及法医学等领域。 遗传性疾病是由于基因突变所致,其基因诊断可采取两种策略:①直接诊断策略，直接检测导致遗传病发生的各种基因突变；

99 ②间接诊断策略，即寻找具有基因缺陷的染色体并判断被检者是否具有这条染色体。感染性疾病是由于某种病原体的感染所引起，由此针对病原体的基因序列，设计特异性探针进行分子杂交或合成特异的寡核苷酸引物进行PCR扩增，即能对该疾病作出明确的病原体诊断；肿瘤的发生是多因素、多基因、多阶段相互协同作用的癌变过程，具体说来，肿瘤的形成过程伴随着多种癌基因的活化、抑癌基因的失活以及两者之间的相互作用。目前肿瘤的基因诊断可通过：①检测肿瘤相关基因的突变及表达异常；②检测肿瘤相关病毒基因；③检测肿瘤标记物基因来实现。法医学鉴定中主要应用DNA多态性分析的方法，即应用DNA指纹技术来进行个人识别和亲子鉴定。

100 基因治疗原理：是指通过在特定靶细胞中表达该细胞本来不表达的基因，或采用特定方式关闭、抑制异常表达基因以达到治疗疾病目的的治疗方法。基因治疗的策略包括基因标记、基因置换、基因添加、基因干预等，通过这些策略，可以进行基因示踪、纠正或抑制异常基因、表达特定的外源基因等，达到治疗疾病的目的。 基因治疗方法：体内基因转移的方法包括生物学方法和非生物学方法两大类，生物学方法主要采用各种病毒载体将外源基因导入靶细胞，非生物学方法主要有脂质体介导基因转移、直接注射、受体介导基因转移等。这些方法主要是将外源基因导入靶细胞，表达出特定的产物，达到治疗疾病的目的。另一方面，采用反义核酸、核酶、三链DNA等技术，则可将特定的核酸片段导入细胞，通过抑制异常基因的表达而达到治疗疾病的目的。

101 基因治疗靶细胞：目前基因转移的靶细胞主要是体细胞，包括造血细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、血管内皮细胞、肌肉细胞、肿瘤细胞及其它细胞。基因治疗一般不考虑生殖细胞途径，以避免外源基因的整合对个人及人类基因库带来长期持续的影响。 基因治疗的策略：基因治疗方案用于人体之前必须进行三个阶段的试验，即体外研究、小鼠体内研究和灵长类动物体内研究，以保证对人体无害。 对遗传病的基因治疗多以导入正常基因、替代或弥补缺陷基因的功能为主；肿瘤的基因治疗则可实行多种不同的策略，如修正肿瘤相关基因的功能、导入特定的基因产生肿瘤特异性的药物敏感性、免疫基因治疗等。传染病的基因治疗则以破坏病原体的基因组为主要手段，