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Chromatography.

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1 Chromatography

2 Chromatography The mixture is dissolved in a fluid called the mobile phase, which carries it through a structure holding another material called the stationary phase. The various constituents of the mixture travel at different speeds, causing them to separate.

3 層析法中的移動相(mobile phase;即流經管柱 的溶劑)通常是液體或氣體。
靜相(stationary phase;固定於管柱內部的物質) 又稱固定相,則是固體或附著於固體或是毛細 管柱內壁的液體。 在氣相層析法(gas chromatography)中,移動 相為氣體,而在液相層析法(liquid chromatography)中,移動相則是液體。 P.434

4 進入管柱的流體稱為沖提液(eluent);離開管 柱的流體稱為析出液(eluate);將液體或氣體 通過層析管柱的過程則稱為沖提(elution)。
P.434

5 18-2 我們如何描述層析圖 層析圖(chromatogram)所顯示的是在一個層 析實驗中隨著時間進行(或沖提體積),偵測 器的感應訊號大小(圖 18-3)。 滯留時間(retention time;tr)則是指某個溶質 在注射後到達偵測器所需要的時間。 P.436

6 圖 18-3 圖 以圖示方式說明層析圖相關參數,包括滯留時間(tr)與半高峰寬(w1/2)。在基線的成分峰寬度(w)是由成分峰所顯示的高斯曲線斜邊延伸與基線相交的點所決定,高斯曲線的標準偏差為 σ。在氣相層析法中,通常注射 0.1 μL 至 0.2 μL 的甲烷所出現的時間可被視為層析中最早出現的時間,也經常被視為移動動相在管柱中所滯留的時間。  P.437

7 圖 18-4 圖 18-4 兩個相同面積與高度的高斯峰之間的解析度。虛線部分為個別單一的成分峰,實線則是兩個成分峰的面積和。重疊部分則以陰影表示。 P.438

8 定性與定量分析 在定性分析的應用方面,要確定層析圖中的成 分峰是哪種成分最簡單的方法是比較已確定物 質與待測物質兩者的滯留時間。更可靠的方式 是利用標準添加法(spiking;也稱 co- chromatography)。 在定量分析上,成分峰的面積與分析物的量成 正比例。 比較面積法與內標法兩種定量方式,後者會得 到比較好的分析物濃度結果。 P.438

9 由溶質與靜相的作用力不同可以將層析法分成:
吸附層析法(adsorption chromatography) 分配層析法(partition chromatography) 離子交換層析法(ion-exchange chromatography) 分子排除層析法(molecular exclusion chromatography) 親和層析法(affinity chromatography) P.435

10 18-9 離子交換層析法 離子交換層析法(ion-exchange chromatography) 以離子性溶質與靜相中帶電荷位置之間的作用力 為分離的基礎(圖 18-2)。 陰離子交換介質(anion exchanger)在靜相上具有 帶正電荷的官能基,能夠吸引陰離子。 陽離子交換介質(cation exchanger)則含有陰離 子官能基,能夠吸引陽離子。 陽離子交換樹脂是將帶負電荷的磺酸根(-SO3-) 或羧酸根(-CO2-)接到聚苯乙烯苯環上(圖 18- 48)。 P.480

11 Ion exchange chromatography
R+A- + B R+B- + A-

12 圖18-33  圖18-48 聚苯乙烯離子交換樹脂的結構,不同的高分子鏈之間以共價鍵方式交聯在一起。 P.480

13 離子交換選擇 上述反應的平衡常數稱為選擇係數(selectivity coefficient)
離子的水合半徑(hydrated radius) 是指離子本身的有效半徑加上周圍 被離子的正電荷或負電荷(圖 11-3) 所緊緊束縛的水分子。 P

14 在圖 18-49 中,利用改變 [H+] 的梯度沖提將不 同鑭系陽離子(M3+)分離。
以下是某些離子對樹脂的大略趨勢: 在圖 中,利用改變 [H+] 的梯度沖提將不 同鑭系陽離子(M3+)分離。 P.482

15 圖18-34  圖18-49 利用陽離子交換管柱以 H+ 梯度沖提的方式(25 分鐘內 mM HNO3)沖提鑭系(III)元素,梯度沖提可以將牢固的滯留於靜相上的陽離子趕出來。 P.482

16 18-11 分子排除層析法 在分子排除層析法(molecular exclusion chromatography),也稱 為凝膠過濾層析法或凝膠滲透層析法中,分子藉著分子大小不同 而分離。 由於小分子在管柱中的路徑較長,大分子會先被沖提出來(圖 )。 這個技術廣泛的應用在生化與高分子化學領域中,藉著這個技術 可以純化巨分子與測定巨分子的分子量(圖 18-55)。圖 是一個應用在材料化學的例子。 P.485

17 Gel filtration chromatography

18 圖18-39  圖18-56 以分子排除層析純化奈米碳管。 P.486

19 Gel filtration chromatography
V0:void volume Ve:elution volume

20 分子量測定 滯留體積(retention volume)是指要將某一個特定溶質沖提出來 所需要的移動相體積。 P.486

21 解 範例 3 以凝膠過濾層析法進行蛋白質層析,記錄不同分 子量標準品與未知物的滯留體積(Vr),請求出待 測物的分子量(MM)。
以凝膠過濾層析法測定分子量 以凝膠過濾層析法進行蛋白質層析,記錄不同分 子量標準品與未知物的滯留體積(Vr),請求出待 測物的分子量(MM)。 P.487

22 圖18-57 分子排除層析法中依照不同分子量與滯留體積 所得到檢量線。
圖18-40  圖18-57 分子排除層析法中依照不同分子量與滯留體積 所得到檢量線。 P.487

23 18-12 親和層析法 親和層析法(affinity chromatography)可以分離複雜組成樣品中 某一個特定的單一化合物。

24 fusion protein: 6-histidine tag 24

25

26 Antibody-Au nanoparticles
金奈米粒子的應用: 驗孕片之原理 (免疫層析法)

27 18-6 氣相層析法 在氣相層析法(gas chromatography)中,氣態的移動相負載著氣 態的溶質通過內含有靜相的長且細的管柱。 管柱 開管式管柱(圖 18-19)的靜相可能是液體或固體,塗佈在內側 管壁(圖 18-20)。 表 18-2 的液態靜相涵蓋了很寬的極性範圍。欲將混和物分離,選 擇靜相的基本原則是「相似者互溶」。 P

28 圖 18-15(b) 圖18-22 分離 22 種帶有 1,2 或 3 個雙鍵的 18 碳脂肪酸酯甲基酯。圖 4-3 中的脂肪酸標示在成份峰 3,7 與 14。所使用的管柱是 supelco IL100 離子液體管壁塗布開管式毛細管柱(100 m × 0.25 mm 內徑,靜相膜厚 0.20 μm),工作溫度為 150ºC,載流氣體為 H2,線性流速為 25 cm/s,偵測器為火焰離子偵測器。    P.457

29 計畫升溫法 圖 所顯示的是對於從沸點 69ºC 的 C6H14 到 356ºC 的 C21H44 的非極性混合物以計畫升溫 法分離的效果。 P

30 圖 18-18 圖 以 (a) 等溫與 (b) 計畫升溫方式分離直鏈烷類,所使用的管柱為填充式非極性管柱。(a) 的偵測靈敏度比 (b) 高 16 倍。  P.459

31 18-7 古典液相層析法 靜相 溶劑 對於吸附型層析來說,氧化矽(SiO2.xH2O; 也稱為矽酸)是常用的靜相之一。
在吸附型層析中,溶劑與溶質互相競爭吸附在 靜相的活性位置。 不同溶劑之間對於從管柱中沖提出特定溶質的 能力與溶質的本質無關。 P.466

32 圖 18-22 圖 溶劑分子與溶質分子對靜相上發生作用力的位置互相競爭。 溶劑分子與靜相的作用力越強,沖提強度也越大。   P.466

33 18-8 高效能液相層析法 高效能液相層析法(high-performance liquid chromatography; HPLC)利用高壓將沖提溶劑推入填充微米級靜相顆粒的管柱中, 這些微米級的靜相顆粒提供了非常良好的層析分離。 在圖 中的分析級 HPLC 設備所使用的管柱內徑約在 1-5 mm 而長度在 5-30 cm,理論板數為每公尺 50,000 至 100,000 板數。 P.468

34 圖 18-23 圖 連接質譜儀作為偵測器的高效率液相層析儀(HPLC)。右圖為管柱放大圖。實際操作時,管柱烘箱會關上,才能維持固定溫度。 P.468

35 液相層析質譜法 電噴灑法(electrospray)是一種成功的應用技術。這種方式藉著 高電壓方式讓移動相變成霧狀由噴口噴出。
另外一種將沖提物導入質譜儀中的方式為大氣壓化學游離法 (atmospheric pressure chemical ionization),見圖 18-44。 圖 是經由質譜儀以選擇離子反應法測定所得到的層析圖。 P.476

36 圖18-51  圖18-44 大氣壓化學游離裝置在液相層析管柱與質譜儀之間的介面。藉由噴霧口的氣體與加熱器產生霧狀氣溶膠。由針尖的電子環形暈所放出的電子可以將分析物變成離子狀態。 P.477

37 親水性作用層析 親水性作用層析(Hydrophilic Interaction Chromatography;HILIC)應用在分離那些極性 太高以至於逆相層析無法滯留的分子。 圖 顯示抗壞血酸(維生素 C)與異抗壞 血酸的層析分離圖譜,兩者在結構上只有在一 個碳(C5)有差別。 當溶液 pH 7 時,胺基會完全質子化。移動相為 90:10(體積/體積)乙腈與含 0.1 M 醋酸氨的 水溶液,圖 顯示,當乙腈的含量增加時, 化合物的滯留時間會增加,這個行為與逆相層 析的趨勢相反,在逆相層析中,乙腈含量增加 滯留時間會縮短。 P

38 圖18-51  圖18-46 以親水性作用層析分離抗壞血酸與異抗壞血酸。以表 18-4 的胺基鍵結管柱做為分離靜相,移動相組成為 90:10 乙腈:H2O(含 0.1 M 醋酸銨)。 P.479

39 薄層層析法

40 彩色插圖 19 彩色插圖 薄層層析法(18-1 節)。(a) 溶劑上升通過靠近底部的染料混合物,平板上塗佈有吸附劑。(b) 當溶劑上升至接近平板頂端時,完成分離過程。


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