Chap9 菌种保藏 (P278).

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1 Chap9 菌种保藏 (P278)

2 一、菌种保藏 （preservation，conservation)
基本要求：在一定时间内使菌种不死、不变（性状不退化）、不乱（污染）。一般通过低温、干燥、缺氧等来实现。 原理 首先，要挑选典型菌种的优良纯种，最好采用它们的休眠体进行保藏。 其次，创造一个使微生物代谢不活泼、 生长受抑制的环境条件。 再次，添加保护剂或酸碱中和剂，避免 保藏过程中细胞受伤。

3 良好的菌种保藏方法的要求 保持原菌的优良性状长期稳定 方法通用性 操作简便性 设备普及性

4 （一）常用菌种保藏的设备 冷冻干燥仪

5 （二）常用菌种保藏方法 定期移植保藏法（斜面保藏法） 液体石蜡法 砂土保藏法 固体曲保藏法 冷冻干燥保藏法 液氮保藏法

6 （二）常用菌种保藏方法 定期移植保藏法（斜面保藏法） 液体石蜡法
将菌种接种在斜面、液体或半固体培养基上，待生长完全后，置普通冰箱4℃保藏，一般1～3个月必须传代一次 优点：方便，不受条件限制，各类微生物均可。 缺点：时间短、传代多、易退化。 主要问题：培养及脱水 液体石蜡法 生长完全的斜面上覆盖无菌的液体石蜡， 液面高于斜面1cm，直立于普通冰箱保 藏。保藏时间1～2年。

7 砂土保藏法 河砂和瘦土分别过筛，用酸浸泡去除河砂中的有机质，洗涤中和，干燥，按比例3:2或1:1混合分装于小试管内，加塞灭菌，无菌检查后使用。把健壮的孢子悬液滴于砂土中搅拌均匀，真空干燥后封口，置于冰箱或干燥器中 优点：低温、干燥、无氧、无营养，保藏效果好，时间可达几年至数十年。 缺点：只适用于产孢子的 微生物，不能用于保藏 营养细胞

8 固体曲保藏法 采用麸皮、大米、小米或麦粒等天然农产品为产孢子培养基，使菌种产生大量休眠体加以保存。适用于产孢子的菌种。

9 冷冻干燥保藏法： 将液体样品（含保护剂的菌悬液）在冻结状态下升华其中水分，最后达到干燥。培养物用无菌脱脂牛奶—保护剂制成菌悬液，加入安瓿中，冷冻、抽真空、封口 优点：低温、干燥、无氧、有保护剂，可保藏各大类微生物，保藏时间可达几十年，是目前使用最广、最有效的保藏方法。 一般专业机构大都用此法保藏。 缺点：不能保藏真菌菌丝。

10 液氮保藏法 液氮温度可达－196℃。把菌悬液置于10%甘油或二甲亚砜保护剂中，密封于安瓶中，先降至0oC，再按1oC/min降至-35oC，然后置于液氮罐内保藏。 优点：保藏效果好。 缺点：价格昂贵。

11 方法的选择 在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、使用特点及现有条件等进行综合考虑。
对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。

12 （三）菌种保藏机构（国内） 1978年7月，中国微生物菌种保藏管理委员会（CCCCM）在北京成立，下设六个全国性菌种保藏管理中心：
1. 普通微生物菌种保藏管理中心 中科院微生物研究所：细菌、真菌 中科院武汉病毒研究所：病毒 2. 农业微生物菌种保藏管理中心 中国农科院 3. 工业微生物菌种保藏管理中心 轻工部食品发酵工业科学研究所 4. 医学微生物菌种保藏管理中心 卫生部药品生物检定所：细菌 中国医学科学院皮肤病研究所：真菌 中国医学科学院病毒研究所：病毒 5. 抗生素菌种保藏管理中心 国家医药总局四川抗生素研究所：新抗生素菌种 华北制药厂抗生素研究所：生产用抗生素菌种 6. 兽医微生物菌种保藏管理中心 农业部兽医药品监察所

13 （三）菌种保藏机构（国外） 1. 国际性机构 2. 美国 4. 英国 5. 日本 6. 德国 世界菌种保藏联合会（WFCC）
美国典型菌种收藏馆（ATCC），农业研究服务处菌种收藏馆（ARS） 3. 荷兰 真菌中心保藏所（CBS） 4. 英国 国立典型菌种收藏馆（NCTC），英联邦真菌研究所（CMI），国立工业细菌收藏所（NCIB） 5. 日本 日本微生物菌种保藏联合会（JFCC） 东京大学应用微生物研究所（TAM） 大阪发酵研究所（IFO） 6. 德国 发酵工业研究所微生物收藏馆（MIC）

14 微生物学名中常用名称 ATCC: 美国典型菌种收藏馆（模式培养物保藏中心） CMCC: 中国医学菌种保藏中心 参见p5

15 二、菌种的衰退与复壮 衰退（degeneration）是指由于自发突变的原因，某物种原有一系列生物学性状发生量变或质变的现象。
菌种原有的典型性状变得不典型时就称菌种退化，如：微生物菌落形态或个体形态的变化；生长速度缓慢，产孢子量减少；色素产生情况的变化；研究菌种遗传标记的丢失；生产菌种生产性状的劣化等 复壮（rejuvenation）广义是指在菌种的典型特征尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状的测定工作，以期从中选择到自发的正变个体。 复壮的方法：纯种分离法，针对病原菌通过宿主体 复壮，淘汰已衰退的个体

16 Chap10 微生物系统进化与分类 (p312) 界、门、纲、目、科、属、种保藏效果好。 是最基本的分类单位
一、通用分类单元 界、门、纲、目、科、属、种保藏效果好。 是最基本的分类单位 每一分类单位之后可有亚门、亚纲、亚目、亚科...

17 以啤酒酵母为例，它在分类学上的地位是： 界(Kindom)：真菌界 门(Phyllum)：真菌门 纲(Class)：子囊菌纲 目(Order)：内孢霉目 科(Family)：内孢霉科 属(Genus)：酵母属 种(Species)：啤酒酵母

18 几个常用概念 1 种（species）：是一个基本分类单位；是一大群表型特征高度相似、亲缘关系极其接近，与同属内其他种有明显差别的菌株的总称。 根据16SrRNA序列分析，同源性>97%的两个原核微生物很可能是同一个种。 2 菌株（strain）: 表示任何由一个独立分离的单细胞繁殖而成的纯种群体及其一切后代（起源于共同祖先并保持祖先特性的一组纯种后代菌群）。 因此，一种微生物的不同来源的纯培养物均可称为该菌种的一个菌株。 例如：Escherichia coli B 和Escherichia coli K12

19 3 亚种(subspecies）： 当某一个种内的不同菌株存在少数明显而稳定的变异特征或遗传形状，而又不足以区分成新种时，可以将这些菌株细分成两个或更多的小的分类单元——亚种。 变种是亚种的同义词，因“变种”一词易引起词义上的混淆，从1976年后，不再使用变种一词。通常把实验室中所获得的变异型菌株，称之为变种。如：E.coli k12（野生型）是不需要特殊aa的，而实验室变异后，可从k12获得某aa的缺陷型，此即称为E.coli k12的变种。 4 型(form): 常指亚种以下的细分。当同种或同亚种内不同菌株之间的性状差异 不足以分为新的亚种时，可以细分为不同的型。 例如：按抗原特征的差异分为不同的血清型。

20 二、微生物在自然界的地位 （前言部分） （一）生物的界级分类学说 植物界 动物界 原始生 物界 菌界 Copeland 植物界 动物界
原核生物界 原生生物界 真菌界 Whittaker 五界上 加上病 毒界 王大耜 细菌域 古生菌域 真核生物域 美国 Woese 动物界 植物界 林奈 动物界 植物界 原生生 物界 Haeckel 生物进化尺度：16SrRNA及类似的rRNA基因

21 三、微生物的鉴定

22 细菌分类鉴定 《伯杰氏手册》简介 美国的《伯杰氏鉴定细菌学手册》编写者集国际学术界的权威学 者，为各国微生物分类学界公认的一本经典佳作。
第一版1923年出版，后一直再版至今，先后修订出版了11个版本，1974年出版了第八版，1994年已出至第九版，由于G+Cmol%测定、核酸杂交和16SrRNA寡核苷酸序列测定等新技术和新指标的引入，使原核生物分类从以往以表型、实用性鉴定指标为主的旧体系向鉴定遗传型的系统进化分类新体系逐渐转变，现书名已改为《伯杰氏系统细菌学手册》，（Bergey’ Mamual of Systematic Bacteriology），简称《系统手册》 20世纪初德国Lehmann和Neumann的《细菌分类图说》 前苏联克拉西尔尼可夫的《细菌与放线菌的鉴定》 法国A.R.Prevot的《细菌分类学》

23 真菌