第七章 氨基酸发酵工艺.

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1 第七章 氨基酸发酵工艺

2 第一节 氨基酸概况 所谓氨基酸，是指同一分子内含有氨基和羧基的化合物的总称，也包括脯氨酸之类的亚氨基酸。 一、氨基酸的用途 1、在医药工业中的应用 （1）重要的营养剂 （2）治疗药剂 （3）短肽药物 （4）医药品合成原料

3 2、氨基酸在食品工业中的应用 1）营养与食品强化； 2）风味与调味； 3）增香与除臭； 4）抗氧化与保质； 5）防腐与保鲜；

4 3、氨基酸在饲料工业中的应用 氨基酸作为饲料添加剂具有以下功效： 1）、促进动物生长发育； 2）、改善肉质、提高产奶、产蛋量； 3）、降低成本，提高饲料利用率； 4）、节省蛋白质饲料。 目前蛋氨酸、赖氨酸作为饲料添加剂的使用量最大，色氨酸、苏氨酸等也被确定为饲料添加剂。

5 4、氨基酸在农业中的应用 1）、杀虫剂 如刀豆氨酸可使南方毛虫拒食而死； 2）、杀菌剂 1972年，日本推出N月酰缬氨酸作为治稻瘟病药剂；
1）、杀虫剂 如刀豆氨酸可使南方毛虫拒食而死； 2）、杀菌剂 年，日本推出N月酰缬氨酸作为治稻瘟病药剂； 3）、除草剂 如激光除草剂的δ-氨基一酰丙酸； 4）、农药稳定剂 如色氨酸可作为杀虫剂水杨酸或环磷酸的稳定剂； 5）、植物生长的促进剂 如谷氨酸能使大豆增产； 6）、脱叶剂 如L-赖氨酸有加速树叶脱落的作用。

6 5、氨基酸在化学工业中的应用 1）、氨基酸系表面活性剂； 2）、氨基酸在高分子合成领域的应用； 3）、氨基酸在化妆品中的应用。

7 二、氨基酸生产方法概论 （一）生产方法 1、直接发酵法 发酵法是借助微生物具有合成自身所需氨基酸的能力，通过对菌株的诱变处理，选育出各种营养缺陷型及氨基酸结构类似物，以解除代谢调节中的反馈抑制与阻遏，达到过量合成某种氨基酸的目的。 目前发酵法生产氨基酸产量最大的是谷氨酸。

8 2、添加前体发酵法 又称微生物转化法，是使用葡萄糖作为发酵碳源、能源、再添加特异的前体物质，以避免氨基酸合成途径的反馈抑制，经微生物作用将其有效地转变为目的氨基酸。 3、酶法 是利用微生物中特定的酶作为催化剂，使底物经过酶催化生成所需的产品。

9 4、化学合成法 利用有机合成和化学工程相结合的技术生产或制备氨基酸的方法。 化学合成法可归纳为一般合成法及不对称合成法两类，前者产物都为DL型氨基酸混合物，后者产物为L型氨基酸。 5、蛋白质水解提取法 以毛发、血粉及废蚕丝等蛋白质为原料，通过酸、碱或酶水解成多种氨基酸混合物，以分离纯化得各种氨基酸的方法。

10 （二）国际国内生产概况 生产氨基酸的大国为日本和德国。 日本的味之素、协和发酵及德国的德固沙是世界氨基酸生产的三巨头。它们能生产高品质的氨基酸,可直接用于输液制剂的生产。 日本在美国、法国等建立了合资的氨基酸生产厂家,生产氨基酸和天冬甜精等衍生物。

11 国内生产氨基酸的厂家主要是天津氨基酸公司,湖北八峰氨基酸公司,但目前无论生产规模及产品质量还难于与国外抗衡。
在80年代中后期,我国从日本的味之素、协和发酵以技贸合作的方式引进输液制剂的制造技术和仿造产品,1991年销售量为二千万瓶,1996年达六千万瓶,主要厂家有无锡华瑞,北京费森尤斯,昆明康普莱特,但生产原料都依赖进口。

12 三、菌株的育种 从自然界中筛选有产酸能力的菌株,并建立其培养条件。 筛选营养缺陷型菌株来解除反馈抑制积累氨基酸。
在确立突变技术和阐明氨基酸生物合成系统调节机制的基础上发展为营养缺陷变异株、抗药性菌株的育种。 随着重组DNA技术的发展,接合、转导、转染、细胞融合等手段首先用于体内基因重组,是早期用基因重组方法构建生产菌株的尝试。 随着载体、受体系统的构建及体外基因重组技术的日益完善,氨基酸生物工程菌的构建有了长足的发展。 苏氨酸等的生产菌株被成功地构建并应用于工业化生产。

13 1、用野生株的方法 这是从自然界获得的分离菌株进行发酵生产的一种方法。 典型的例子就是谷氨酸发酵。 改变培养条件的发酵转换法中,有变化铵离子浓度、磷酸浓度，使谷氨酸转向谷氨酰胺和缬氨酸发酵

14 2、用营养缺陷变异株的方法 这一方法是诱变出菌体内氨基酸生物合成某步反应阻遏的营养缺陷型变异体，使生物合成在中途停止，不让最终产物起控制作用。 这种方法中有用高丝氨酸缺陷株的赖氨酸发酵，有用精氨酸缺陷株的鸟氨酸发酵，还有用异亮氨酸缺陷株的脯氨酸发酵。

15 3、选育生产氨基酸的代谢调节突变株 用一种与自己想获得的氨基酸结构相类似的化合物加入培养基内，使其发生控制作用，从而抑制微生物的生长。这样，就可以得到在这种培养基中能够生长的变异株，而这种变异株正是解除了调控机制的，能够生成过量的氨基酸。 利用此方法发酵的有:苏氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、组氨酸和精氨酸。

16 4、体内及体外基因重组的方法 基因工程包括细胞内基因重组方法和试管内的体外基因重组方法。 体内基因重组在应用上又称为杂交育种，主要方法包括：转化、转染、接合转移、转导和细胞融合等，这都是在细胞内暂时地产生染色体的局部二倍体，在两条DNA链之间引起两次以上的交叉，是遗传性重组现象。 细胞内基因重组技术的缺点是，现在只在同种或有近缘关系的微生物之间进行并较难成功。

17 代谢工程在阐明代谢途径及其调控规律的基础上，应用重组DNA技术可以改变代谢途径分支点上的流量或引入新的代谢步骤与构建新的代谢网络。
其主要步骤为: 鉴定目标代谢途径涉及的酶(特别是限速酶); 取得酶基因，必要时可用蛋白质工程技术，如定点诱变，基因剪接等，使蛋白具有新的特点(增强活性或稳定性、解除反馈抑制等); 将一种或多种异源的或改造后的酶基因与调节元件一起克隆进目标生物; 使调节元件的作用及培育条件最优化。

18 　5、基因工程菌株的构建 1）受体菌的获得 目前使用的氨基酸工程菌受体主要是大肠杆菌K-12及棒状杆菌家族，通常是通过诱变选育出的基础产率较高的菌株。 大肠杆菌遗传背景研究得清楚，载体系统完善，利于工程菌的构建，但它含有内毒素且不能将蛋白产物分泌至胞外，为应用带来困难。 棒状杆菌能克服这两个缺点，但载体受体系统研究较晚且有限制修饰系统的障碍，所以获得利于外源基因导入及表达且能稳定遗传的受体菌是尚待解决的问题。

19 2）载体的构建 有效的载体需要有在受体菌中可启动的复制起始位点，这可从棒状杆菌家族内源小质粒中获得; 载体所需的筛选标记及外源基因插入的多克隆位点，可从常用的克隆载体中获得。

20 3）基因转移手段 由于棒状杆菌是革兰氏阳性菌，CaCl2转化法对它不适用。 通常采用的方法有:原生质体转化、转导，电转化，接合转移。
原生质体转化的方法是较早采用的方法，由于受到原生质体再生条件的局限，效率不高; 电转化方法由于高效，快速被广泛使用，目前它的转化效率可达到原生质体转化法的100～1000倍。 接合转移可用于基因在亲缘关系远的物种之间的转移，并且可将外源基因整合于染色体上，易于稳定遗传。

21 四、氨基酸发酵的代谢控制 控制发酵的条件 控制细胞渗透性 控制旁路代谢 降低反馈作用物的浓度 消除终产物的反馈抑制与阻遏作用 促进ATP的积累，以利氨基酸的生物合成

22 1、控制发酵的条件 专性需氧菌，控制环境条件可改变代谢途径和产物。

23 2、控制细胞渗透性 生物素、油酸和表面活性剂，引起细胞膜的脂肪酸成分的改变，从而增加细胞膜的透性。
青霉素：抑制细胞壁的合成，由于细胞膜内外的渗透压而泄露出来。

24 3、控制旁路代谢

25 4、降低反馈作用物的浓度 利用营养缺陷型突变株进行氨基酸发酵必须限制所要求的氨基酸的量。 限制精氨酸的浓度可解除反馈抑制，实现鸟氨酸的生物合成。

26 第二节 氨基酸发酵工艺的控制 培养基 pH 温度 氧

27 一、培养基 1、碳源：淀粉水解糖、糖蜜、醋酸、乙醇、烷烃 碳源浓度过高时，对菌体生长不利，氨基酸的转化率降低。 菌种性质、生产氨基酸种类和所采用的发酵操作决定碳源种类

28 2、氮源：铵盐、尿素、氨水； 同时调整pH值。 营养缺陷型添加适量氨基酸主要以添加有机氮源水解液。 需生物素和氨基酸，以玉米浆作氮源。 尿素灭菌时形成磷酸铵镁盐，须单独灭菌。可分批流加。 氨水采用pH自动控制连续流加法.

29 3、合适C/N 氮源用于调整pH。 合成菌体 生成氨基酸，因此比一般微生物发酵的C/N低。

30 4、磷酸盐：对发酵有显著影响。不足时糖代谢受抑制。
5、镁：是已糖磷酸化酶、柠檬酸脱氢酶和羧化酶的激活剂，并促进葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活力。 6、钾：促进糖代谢。谷氨酸产酸期钾多利于产酸，钾少利于菌体生长。

31 7、钠：调节渗透压作用，一般在调节pH值时加入。
8、锰：是许多酶的激活剂。 9、铁：是细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶的活性基的组成分，可促进谷氨酸产生菌的生长。 10、铜离子：对氨基酸发酵有明显毒害作用。

32 11、生长因子：生物素 作用：影响细胞膜透性和代谢途径。 浓度：过多促进菌体生长，氨基酸产量低。过少菌体生长缓慢，发酵周期长。 与其它培养条件的关系：氧供给不足，生物素过量时，发酵向其它途径转化。 生物素来源：玉米浆、麸皮水解液、甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜为来源。

33 二、pH对氨基酸发酵的影响及其控制 作用机理：主要影响酶的活性和菌的代谢。 控制pH方法：流加尿素和氨水 流加方式：根据菌体生长、pH变化、糖耗情况和发酵阶段等因素决定。

34 控制方式： （1）菌体生长或耗糖慢时，少量多次流加尿素，避免pH过高 （2）菌体生长或耗糖过快时，流加尿素可多些，以抑制菌体生长。 （3）发酵后期，残糖少，接近放罐时，少加或不加尿素，以免造成氨基酸提取困难。 （4）氨水对pH影响大，应采取连续流加。

35 三、温度对氨基酸发酵的影响及其控制 菌体生长达一定程度后再开始产生氨基酸，因此菌体生长最适温度和氨基酸合成的最适温度是不同的。 菌体生长温度过高，则菌体易衰老，pH高，糖耗慢，周期长，酸产量低。 采取措施：少量多次流加尿素，维持最适生长温度，减少风量等，促进菌体生长。

36 四、氧对氨基酸发酵的影响及其控制 要求供氧充足的谷氨酸族氨基酸发酵：生物合成与TCA循环有关。 适宜在缺氧条件下进行的亮氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸发酵：菌体呼吸受阻时产量最大。 供氧不足时产酸受轻微影响的天冬氨酸族氨基酸发酵。

37 第三节 氨基酸生产工艺 A、谷氨酸生产工艺 工业化生产开始于由水解小麦面筋或大豆蛋白质而制取。 1957年，日本率先采用微生物发酵法生产，并投入大规模工业化生产，这是被誉为现代发酵工业的重大创举，使发酵工业进入调节代谢的调控阶段。 谷氨酸是一个很重要的氨基酸，占氨基酸总量的2/3。 我国现已有30余家生产，年产量达110万吨，居世界首位。

38 一、产生菌株特点： 革兰氏阳性 不形成芽胞 没有鞭毛，不能运动 需要生物素作为生长因子 在通气条件下才能产生谷氨酸。

39 二、谷氨酸生物合成机理： 由三羧酸循环中产生的a-酮戊二酸，在谷氨酸脱氢酶和氢供体存在下进行还原性氨化作用而得到。

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41 三、生产工艺 （一）、淀粉水解糖的制备：酸水解或酶水解 1、调浆：干淀粉用水调成10-11Bx的淀粉乳，加盐酸0.5-0.8％至pH1.5。
2、糖化：蒸汽加热，加压糖化25min。冷却至80℃下中和。 3、中和：烧碱中和，至pH 4、脱色：活性炭脱色和脱色树脂。活性炭用量为 ％，在70度及酸性条件下搅拌后过滤。

42 （二）、菌种扩大培养 1、斜面培养：主要产生菌是棒状杆菌属、短杆菌属、小杆菌属、节杆菌属。 我国各工厂目前使用的菌株主要是钝齿棒杆菌和北京棒杆菌及各种诱变株。 生长特点：适用于糖质原料，需氧，以生物素为生长因子。 斜面培养基：蛋白胨、牛肉膏、氯化钠组成的pH 琼脂培养基，32℃培养18-24h。

43 酶法糖化：以大米或碎米为原料时采用 大米进行浸泡磨浆，再调成15Bx，调pH6.0，加细菌a-淀粉酶进行液化，85 ℃30min，加糖化酶60 ℃糖化24h，过滤后可供配制培养基。 糖蜜原料：不宜直接用来作为谷氨酸发酵的碳源，因含丰富的生物素。 预处理方法：活性碳或树脂吸附法和亚硝酸法吸附或破坏生物素。也可以在发酵液中加入表面活性剂吐温60或添加青霉素。

44 2、一级种子培养：由葡萄糖、玉米浆、尿素、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸铁及硫酸锰组成。pH6. 5-6
2、一级种子培养：由葡萄糖、玉米浆、尿素、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸铁及硫酸锰组成。pH 。1000ml装 ml振荡，32℃ 培养12h。 3、二级种子培养：用种子罐培养，料液量为发酵罐投料体积的1％，用水解糖代替葡萄糖，于32℃ 进行通气搅拌7-10h。种子质量要求：二级种子培养结束时，无杂菌或噬菌体污染，菌体大小均一，呈单个或八字排列。活菌数为 个/ml。

45 种子培养基的要求: 1、营养物质必须丰富和完全； 2、营养浓度不宜过高，以略稀为好。特别是葡萄糖浓度不要超过4%； 3、种子培养基的成分必须能够维持在培养期间所需的pH值。

46 （三）谷氨酸发酵 1、适应期：尿素分解出氨使pH上升。糖不利用。2-4h。 措施：接种量和发酵条件控制使适应期缩短。 2、对数生长期：糖耗快，尿素大量分解使pH上升，氨被利用pH又迅速下降。溶氧急剧下降后维持在一定水平。菌体浓度迅速增大，菌体形态为排列整齐的八字形。不产酸。12h。 措施：及时供给菌体生长必须的氮源及调节pH，在pH 时流加尿素；维持温度30- 32℃。

47 3、菌体生长停止期：谷氨酸合成。 措施：提供必须的氨及pH维持在 。大 量通气，控制温度34-37 ℃。 4、发酵后期：菌体衰老，糖耗慢，残糖低。 措施：营养物耗尽酸浓度不增加时，及时放罐。 发酵周期一般为30h。

48 Production Process of L-Glutamic acid
Sketch of main reaction in Corynebacterium glutamicum Connected with the citric acid cycly

49 （四）谷氨酸发酵控制 （1）生物素：作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA的辅酶，参与脂肪酸的生物合成，进而影响磷酯的合成。 当磷酯含量减少到正常时的一半左右时，细胞发生变形，谷氨酸能够从胞内渗出，积累于发酵液中。 生物素过量，则发酵过程菌体大量繁殖，不产或少产谷氨酸，代谢产物中乳酸和琥珀酸明显增多。 生物素一般控制在亚适量.

50 （2）种龄和种量的控制 一级种子控制在11-12h，二级控制在7-8h。 种量为1％。过多，菌体娇嫩，不强壮，提前衰老自溶，后期产酸量不高。 （3）pH。 发酵前期，幼龄细胞对pH较敏感，pH过低，菌体生长旺盛，营养成分消耗大，转入正常发酵慢，长菌不长酸。一般控制在7.5左右. 谷氨酸脱氢酶最适pH为 ，转氨酶最适pH 。在发酵中后期，保持pH不变。过高转为谷氨酰胺，过低氨离子不足。

51 （4）通风：不同种龄、种量，培养基成分，发酵阶段及发酵罐大小要求通风量不同。
在长菌体阶段，通风量过大，生物素缺乏，抑制菌体生长。 在发酵产酸阶段，需要大量通风供氧，以防过量生成乳酸和琥珀酸，但过大通风，则大量积累a-酮戊二酸。 防止噬菌体和杂菌的污染 从空气过滤、培养基、设备、环境等环节严格把关。

52 （5）温度 谷氨酸菌体生长最适温度为32℃左右，而产酸的最适温度在34~36℃。一般前期控制32~33℃，中期34~35℃，后期35~37℃。 发酵过程中，如温度过高，菌体生长迟滞，形状不规整，且易衰老，以至到发酵中期就停止产酸。 措施： （1）小通风，停止搅拌，待OD上升后再行搅拌和正常通风； （2）与另一正常罐对压后，继续发酵； （3）采取补料、重新灭菌、重新补种的办法。

53 谷氨酸发酵的工艺流程简图 培养基的配制 上罐实消 冷却接种 三角瓶培养 固体斜面培养 发 酵 发 酵 液 DO值 pH 发酵过程参数的控制
温度 搅拌速度 发 酵 发酵过程参数测定 还原糖的测定 谷氨酸的测定 菌体形态观察 菌体浓度测定 发 酵 液

54 （五）、谷氨酸的提取 1、等电点法：操作简单，收率60％。周期长，占地面积大。 2、离子交换法：用阳离子交换树脂提取吸附谷氨酸形成的阳离子，再用热碱洗脱，收集相应流分，再加盐酸结晶。提取收率可达80%~90%。

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58 B、赖氨酸生产工艺 发酵法生产赖氨酸主要包括：培养基配制、种子制备和扩大培养、发酵等工序。 1、碳源 赖氨酸产生菌均不能利用淀粉，只能利用葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖。生产上通常采用双酶法来水解淀粉制糖。 2、氮源 赖氨酸产生菌缺乏蛋白质分解酶，对有机氮源必须水解才能利用。

59 3、生长因子 赖氨酸产生菌几乎是谷氨酸产生菌的各种生化标记突变株，均为生物素缺陷型，故需用生物素作为生长因子。 4、发酵条件控制 氧气不足，导致乳酸积累，并可能使赖氨酸的产生受到不可逆抑制。 发酵时，添加某些前体可增加赖氨酸的产量。

60 5、温度控制 前期32℃，中后期34℃。 6、pH控制 控制在6.5~7.5，最适为6.5~7.0。 7、补糖 当发酵液中糖降至5%时开始补糖，全程补3~5次。 8、发酵周期 一般采用二级种子扩大培养，种量2%左右，种龄8~12h。发酵周期60~70h。

61 黄色短杆菌合成赖氨酸的途径

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