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第十一、十二章 抗体、疫苗与基因治疗
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第一节：抗体 第一代抗体 多克隆抗体（polyclonal antibody） 第二代抗体 单克隆抗体（monoclonal antibody） 第三代抗体 基因工程抗体 （genetic engineering antibody）
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抗体产生的机理 抗原（非自己的物质）免疫动物 激活免疫B细胞 转化成浆细胞 分泌特异性抗体
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单克隆抗体 单克隆抗体将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞融合，通过有限稀释法及克克隆化，使杂交瘤细胞成为纯的单克隆细胞系而产生的抗体。 针对单一抗原决定簇 由单一B淋巴细胞产生
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单克隆抗体制备流程 Antigen immunization Cell fusion HAT medium selection
ELISA test positive cell clone Subcloning of the positive cell clone Production of ascites Purification of monoclonal antibody
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单克隆抗体制备的基本步骤 1.抗原提纯与动物免疫 2.骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备 3.细胞融合 4.抗体检测 5.杂交瘤的克隆化和冻存 6.McAB的制备 7.单克隆抗体的纯化
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单抗的制备步骤
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BalB/c mouse
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Antigen immunization
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Immunizing
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Sp2/0 cells
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Remove the spleen Prepare a single cell suspension of the spleen
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cell fusion
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性孔用常规的有限稀释法克隆，获对上述抗原有特异性反应的杂
交瘤细 胞株。细胞株进一步扩大培养，用于制备单抗腹水和液 氮 冻存
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ELISA test positive cell clones
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subclone of positive clone
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Production of ascites
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鼠源化单抗 抗体，或称裸抗体 OKT-3，美国FDA批准的第一个单克隆抗体。 抗CD3，用于治疗和预防急性肾移植排斥反应。
根据其人源化的程度，又可分为鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人源抗体
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鼠源单抗的缺点 ①鼠源单抗为异种蛋白质，会引起机体免疫系统对它的免疫排斥反应，又称为人抗鼠抗体（Human anti-mouse antibody, HAMA）应答，重复使用甚至可导致病人严重的过敏性休克。 ②鼠源单抗通常不能有效激活机体的 生物效应功能，如补体依赖的细胞毒及抗体依赖的细胞毒作用。 ③由于HAMA反应的存在,鼠单抗在人体内往往被快速清除，其半衰期也较短。
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鼠源化单抗的人源化 抗体分子的结构示意图
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鼠源 人源化 （移植） 嵌合 全人
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鼠源单抗的人源化 人鼠嵌合抗体 嵌合抗体(Chimeric antibody)
20 世纪80年代中期开始研制第一代人源化抗体，即简单的嵌合抗体，是用人源抗体恒定区取代鼠单抗恒定区而构建的人-鼠嵌合抗体。 但由于嵌合抗体可变区（V）约占整个抗体的30%，鼠源性抗体V 区中的框架区（FR）仍残留一定的免疫原性，可诱发HAMA 反应。
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人源序列：2/3 鼠源序列：1/3 Reopro，anti-glycoprotein (GP) IIb/IIIa receptor
美罗华（Rituximab）作为第一个用于肿瘤治疗的基因工程抗体，就是由鼠可变区和人恒定区组成的嵌合抗体。
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人源化抗体，CDR移植抗体
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CDR移植抗体（CDR grafted antibody）
CDR 移植抗体或改型抗体(Reshaped Ab)，是更为完全的人源化抗体，抗体中除了3个互补决定区(CDR)是鼠源的外，其余全部是人源结构。仅保留鼠抗体CDR区，而将骨架区（FR）全部或部分替换成人抗体的相应部分，这种改型抗体的人源成分达90%以上。改型抗体的免疫原性得到显著降低。 每一抗体分子Fab段的轻、重链可变区具有6个抗原互补决定区(CDR)。CDR1、CDR2 和CDR3之间有一个起结构稳定作用的框架区（FR），即以FR分隔而起支架作用,共同形成CDR平面可直接接触抗原，决定抗体的特异性，FR只是作为支持CDR的支架，而且其立体构象极为保守。 鼠源性单抗的CDR序列替换人IG分子中的CDR序列，可使人的IG分子中具有鼠源单抗的抗原结合特异性，可消除免疫原性。
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FR1 VH VL CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4 人源化抗体
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人源序列：90% 鼠源序列：10% Zenapax，抗CD25 ，从而阻断了后者与白介素 2 (ＩＬ 2 )的结合 ,抑制激活状态下Ｔ淋巴细胞的增殖 ,减少免疫应答致急性排斥反应的发生 ,临床可用于抑制肾移植术后急性排斥反应 国家I 类癌症治疗新药“泰欣生”，即重组人源化抗人表皮生长因子受体单克隆抗体，采用了先进的“CDR 移植”技术，人源化程度达到95%以上，具有更高的安全性和更低的毒性。 Ig分子中参与构成抗原结合部位的区域是H和L链V区中的互补性决定区（CDR区），而不是整个可变区，如果用鼠源性单克隆性抗体的CDR序列替换人Ig分子中的CDR序列，则可使人的Ig分子具有鼠源性单抗的抗原结合特异性，抗体分子中鼠源部分只占很小比例，可基本消除免疫原性。
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全人源化单抗 （噬菌体表面展示技术） 即用PCR 技术从生物体内扩增出整套编码人抗体的基因序列，克隆到噬菌体载体上，并以融合蛋白的形式表达到噬菌体表面，从而可以方便地利用抗原-抗体特异性结合进行筛选、和扩增。 此项技术不仅可以获得具有人体性质的单抗，而且利用抗原直接从库中筛选出所需基因，实验周期短，过程较简单，这是人源抗体制备技术的重大突破。采用噬菌体展示技术制备完全人源化的单抗已较成熟。
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Humira（anti-TNF-alpha），噬菌体展示技术，减轻各种程度的成人风湿性关节炎症状，抑制关节结构性破坏进程，并能够与其他药物联用。
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Humira (anti-TNF-α) Humira是采用噬菌体展示技术获得的第一个全人抗体。
噬菌体展示技术筛选所得单价单链可变区片段（scFv）包含了重链可变区与轻链可变区，经过抗体亲和力成熟获得高亲和力scFv。通过工程手段构建二价完整抗体，含有无FcR结合活性Fc区。
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Humira是首个获准治疗RA的完全人源化单克隆抗体。与鼠源性及嵌合抗体相比较，人源化抗体可减少影响安全性及有效性的免疫应答。
Humira由Cambridge Antibody Technology公司及BASF公司共同开发的，雅培公司于2001年3月获得Humira的授权。 Humira的一个主要卖点是使用方便。Humira每隔一周自助皮下注射一次，而Enbrel则需每周两次。Remicade只需每8周给药1次，但是给药途径是静脉灌输。 Humira的价格与Enbrel相当，较Remicade便宜25-30%。
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转基因小鼠 转基因小鼠（Transgenetic mouse）
利用转基因小鼠生产人抗体的途径是通过基因敲除技术，使小鼠自身的基因失活，并导入新基因，创造出携带人抗体重轻链基因簇的转基因小鼠。这种转人抗体基因小鼠所携带的人DNA片段具有完备的功能，可以有效地进行同种型转换和亲和力成熟。任何靶抗原均可被用来免疫该小鼠，使其产生高亲和力的人抗体。 利用转基因技术，将人的germline configuration immunoglobin genes构建到小鼠基因组中，再用目的抗原免疫转基因小鼠。 小鼠产生体液免疫反应，生成突变型的、具有一定亲和性的secondary repertoire B cells，可供进一步筛选。 按常规方法如杂交瘤融合技术制备分离出单克隆抗体，并且可从个方面对单抗进行筛选，如体外方法：包括生化、生理和生物活性法；体内活性：动物模型法。 临床实验。 噬菌体表面展示技术:B cells of the primary and secondary repertoire 的基因重排。 重排基因可以直接在噬菌体中表达，或者与其它融合蛋白的基因序列一起在噬菌体粒子中表达。 表达的可能是整个抗体，也可以是抗体片段。 表达产物可以在体外优化以提高亲和力。
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Vectibix（anti-huEGFR），转基因小鼠技术，第一适应证为经过标准化疗治疗失败的转移性结肠直肠癌。
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Vectibix (anti-huEGFR)
Vectibix是安进(Amgen)公司联合Abgentix公司第一个通过XenoMouse技术研发的全人单克隆抗体。 将人表皮生长因子受体(EGFR)注射入XenoMouse体内后，筛选出分泌高亲和力anti-EGFR IgG的B淋巴细胞，后将此株细胞与中国仓鼠卵巢细胞(CHO)融合构建表达。
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Vectibix通过与EGFR结合，从而抑制表皮生长因子的促血管生成作用。
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人源化抗体的表达系统 大肠杆菌表达系统 酵母表达系统 人源化抗 体的表 昆虫杆状病毒表达系统 哺乳动物细胞表达系统 达系统 植物细胞表达系统
转基因动物表达系统
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抗体片段（小分子抗体）
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抗体片段出现的原因: 1.完整抗体分子量约150kDa，从血管扩散到实体瘤的效果差，体内清除的速度慢； 2.抗体片段具备完整抗体特异性结合抗原的能力，但体内清除的速度快，容易进入实体瘤内部； 3.更适用于免疫成像和化疗； 4.有利于原核发酵。 Fab（fragmentofantigenbinding，Fab抗原结合片段）片段由H链Pd段和完整L链通过二硫键形成的异二聚体，仅含一个抗原结合位点。 Fv（fragment Of variable，Fv可变区片段）是由L链和H链V区组成的单价小分子，是与抗原结合的最小功能片段。用适当的寡核苷酸接头将L链和H链的V区连接起来，使之形成单一的多肽链，称为单链抗体(single chainFv，ScFv) 单区抗体(singledomainantibody，SdAb单独重链可变区仍可保留与抗原结合的能力，而且保持了完整抗体的特异性，称为单区抗体，它的亲和力低于完整的Fv。单区抗体大小只有完整IgG分子的1／12，故更容易穿入细胞，到达完整抗体不能接近的部位。
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成功上市的抗体片段 商品名 抗体类型 主治疾病 Myoscint 重组小鼠IgG2-kappa Fab偶联放射性标签DTPA
诊断、定位心肌损伤——心脏造影 Verluma 重组小鼠IgG2b Fab片断 肿瘤组织造影剂 ReoPro 重组人鼠嵌合Fab片断 治疗经皮冠状动脉介入病人，抑制血小板聚集 Lucentis 重组人源化的IgG1-kappa单克隆抗体Fab片断 治疗年龄相关的新生血管造成的视网膜黄斑变性 Cimzia 重组人源化Fab'片段 PEG修饰 减轻克罗恩氏病的症状和体征
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双特异抗体和多价抗体
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抗体偶联物，或称免疫偶联物 由抗体或抗体片段与“弹头”药物连接而成。可用作“弹头”的物质有放射性核素、化疗药物与毒素。这些“弹头”物质与抗体连接，分别构成放射免疫偶联物、化学免疫偶联物与免疫毒素。 2000年惠氏产品 Mylotarg（卡奇霉素吉妥组单抗 ） Calicheamicin(卡奇霉素)与人源化抗体的偶联物 用于治疗急性复发性髓性白血病
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商品名 抗体类型 主治疾病 Mylotarg 重组人源化的IgG4-kappa单克隆抗体偶联calicheamicin
用于治疗急性复发性髓性白血病 Zevalin 重组小鼠IgG1-kappa单克隆抗体用连接螯合剂 Tiuxetan 与放射性钇－ 90 ( Yttrium-90 )颗粒相连 治疗复发性或难控制的低水平B细胞或囊泡B细胞非霍奇金淋巴癌 Bexxar 重组小鼠IgG2a单克隆抗体及其碘131偶联物 治疗对Rituximab抵抗或化疗后复发的，转移的或非转移的CD20+、囊泡非霍奇金淋巴癌
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抗体药物发展现状 自1986年第一个抗体药物OKT-3上市以来，抗体药物经历了20年的发展。
抗体药物经历了早期10年的低谷期，1996年开始进入快速发展的轨道。 在人源化抗体技术成熟后，进入临床试验的药物中抗体药物增长率显著高于小分子药物的增长。
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2007第三季度超级“重磅炸弹”药品排名榜 所谓超级“重磅炸弹”药品是指“单季”销售额超过或接近10亿美元的药品。
目前市场上销售的年销售额超过10亿美元的“重磅炸弹”药品约90个。 其中超级“重磅炸弹”约22个，化学药12个和生物制药（包括重组蛋白和单克隆抗体药物，不包括疫苗和生化提取药物）10个。
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表中单克隆抗体药物共有5个，占了50%。肿瘤和自身免疫性疾病是单克隆抗体药物市场的主流。
排名 药品名称 公司 销售额 (亿美元) 适应症 1 Enbrel 安进/惠氏 13.68 类风湿等免疫性疾病 2 Rituxan 罗氏/基因泰克/Biogen 13.49 类风湿，非何杰淋巴瘤 3 Remicade 强生/仙灵葆雅 12.46 4 Neulasta/Neupogen 安进 11 癌症及化疗感染 5 Herceptin 罗氏/基因泰克 10.14 肿瘤 6 Avastin 8.92 7 Aranesp 8.18 贫血 8 Humira 雅培 8.03 9 Lantus 赛诺非 7.58 糖尿病（胰岛素） 10 Procrit 强生 6.8 肾性贫血 总计 100.25 表中单克隆抗体药物共有5个，占了50%。肿瘤和自身免疫性疾病是单克隆抗体药物市场的主流。
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抗体药物广阔的市场前景使得此类研发也逐渐进入鼎盛时期。
分析表明美国食品与药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）近期批准抗体药物的速度高于新小分子化合物药物的速度。 特别是抗肿瘤药物方面——抗体药物增长率高达21%，而新小分子化合物药物的增长率仅为5%。
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人源化抗的优势很明显。原因： 1.相对于全人源抗体，人源化抗体的研究制备技术更成熟； 2.有关统计显示，全人源抗体的免疫原性只是比人源化抗体略低，因此人源化抗体得到了获得了研究人员的认可。
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我国上市的自行开发的单抗药物 批准日期 药物名称 生产单位 2002-12-18 注射用鼠抗人T淋巴细胞CD3抗原单克隆抗体
武汉生物制品研究所 抗人白细胞介素-8单克隆抗体乳膏 东莞宏逸士生物技术药业有限公司 碘[131I]肿瘤细胞核人鼠嵌合单克隆抗体注射液 上海美恩生物技术有限公司 碘[131I]美妥昔单抗注射液 成都华神生物技术有限责任公司 尼妥珠单抗注射液 百泰生物药业有限公司
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抗体药物发展趋势 在2001与2002年间，嵌合抗体的销售占了整个抗体药物市场的70%。
到了05年人源化抗体和全人源抗体统治了抗体生产线，鼠源性单克隆抗体由于副作用大，代谢快，除了部分放射性元素偶联的此类单抗以达到诊断、治疗目的外其余逐渐退出市场。 07年9月正在进行临床研究中43个是人源化抗体，28个是全人源抗体，同时抗体偶联药物发展势头迅猛。
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07年9月正在临床试验的抗体药物针对疾病种类 肿瘤治疗抗体与AIID治疗抗体仍然是主流，虽然在10年内只有Palivizumab一种抗病毒感染抗体药物获得批准，Reichert等[18]预期随着大量的候选抗体进入临床研究（见图5），以及广泛的临床需要，抗感染类抗体药物有很大的发展潜力。值得一提的是全人抗体药物因自身极低的免疫原性在AIID治疗中有着其他种类的抗体无法比拟的优势，因此全人抗体药物在临床试验中的数量明显高于其他类抗体药物。 关节炎和免疫紊乱类疾病（Arthritis, Inflammation and Immune Disorder, AIID） 在未来的研究中，肿瘤治疗抗体与AIID(关节炎和免疫紊乱类疾病 )治疗抗体仍然是主流。虽然在10年内只有Palivizumab一种抗病毒感染抗体药物获得批准，预期随着大量的候选抗体进入临床研究，以及广泛的临床需要，抗感染类抗体药物有很大的发展潜力。
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抗体药物面临的问题和挑战 可能存在严重不良反应 抗体药物的专利保护弱 患者的顺应性低 抗体药物的价格昂贵并且产能不足
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可能存在严重不良反应的原因 抗体药物靶标功能研究不详尽 靶标分布地点不明确 药物本身与非靶标的交叉作用认识不全面
前期抗体药代动力学研究采用动物替代人 2006年由德国公司TeGenero研制的用于治疗免疫功能低下的anti-CD28抗体TGN1412，在经历狗、恒河猴活体试验安全后进入I期临床。使用了动物实验千分之一的剂量，6位健康受试者均出现了严重的淋巴细胞耗竭现象，并陷入昏迷，最终一位病情严重者不得不进行截肢。 使用Adalimumab治疗纤维化齿槽炎伴随系统性硬化症，病人病情出现致命恶化。
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抗体药物的专利保护弱 只要针对同一靶标，抗体药物就会具有相似的疗效； 使抗体序列突变获得亲和力相似或更高的抗体，就可视为完全创新的产品；
大部分药物靶标是全球科学家的公共成果，公司几乎不可能以靶标为专利申请的保护对象。 同样是抗CD20嵌合抗体，美国专利局就批准了两个专利 XOMA公司的专利(美国专利 )和IDEC公司的专利(美国专利 B1) 这两个专利轻重链的CDR1和CDR2完全相同，骨架区几乎完全一样，只是在CDR3区有一两个氨基酸的区别。
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患者的顺应性低 抗体药物均是蛋白质结构，因此采用静脉注射或皮下注射的方法，用药次数频繁的药物会增加病人的痛苦。
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抗体药物的价格昂贵并且产能不足 美国FDA批准的26个抗体药的生产方式 Lucentis (anti-VEGF-A), Fab, 2006
因此如何使用更加廉价的表达系统替代原有表达系统，或者如何提高细胞表达水平也是各国研究者与公司竞相研究的课题。 美国FDA批准的26个抗体药的生产方式 Lucentis (anti-VEGF-A), Fab, 2006 Cimzia (anti-TNF-alpha), Fab, 2008
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第二节 疫苗与佐剂 东晋葛洪狂犬病治疗：杀所咬犬，取脑敷之，后不复发。 宋真宗 宰相王达之子患天花，峨眉山道人取其患处结痂，自体接种治愈。发展成预防天花的人痘接种法。从感染天花后的恢复期病人或症状较轻的病人身上，取水泡，脓疱，痘痂内容物研成粉末，给健康人吸入，预防天花，是史上最早用疫苗来预防疾病的记录。
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疫苗的发展 疫苗的发展经历了三代革命： 第一代疫苗即传统疫苗，以牛痘疫苗和减毒的狂犬疫苗为代表，主要由病原体（致病体）的死亡或减毒的个体或致病体的某一部分构成。直接将无毒或者减毒的病原体接种到人体，使之产生特异性的免疫反应，起预防疾病的作用。 第二代疫苗是基因工程疫苗，主要是利用基因工程技术，将分离得到的具有强烈免疫原性的抗原蛋白基因，装入到表达载体中，通过宿主细胞表达重组抗原蛋白，以分离纯化的重组蛋白作为疫苗。由于这类疫苗不含有完整病原体中除具有免疫原性的蛋白质以外的其它成分，也不存在减毒的病原体由于突变而恢复毒性的可能，因此，与第一代疫苗相比，这类疫苗的安全性较高。
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1990年，Wolf等在把阳离子脂质体包装的重组质粒注入小鼠肌肉进行基因治疗试验时，以裸露的DNA作为对照。意外发现裸露的DNA也能被小鼠的骨骼肌细胞吸收，并在小鼠的注射部位产生了外源蛋白质，而且小鼠对这种外源蛋白质产生了专一的免疫反应。1992年，Tang等将含有人生长激素基因的质粒导入小鼠表皮细胞后，在小鼠的血清中检测到抗人生长激素的抗体。DNA疫苗的出现，开辟了疫苗的新途径，也标志着疫苗第三次革命的到来。
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基因工程疫苗
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开展基因工程疫苗的研究开发的原则和对策 (1)不能或难于培养的的病原体如乙型肝炎病毒(HBV)，EB病毒(Epstein-Barr病毒，EBV)，巨细胞病毒(CMV)，人乳头瘤病毒(HPV)，麻风杆菌，疾原虫、血吸虫等。 (2)有潜在致癌性或免疫病理作用的病原体，前者如1型嗜人T淋巴细胞病毒(HTLV-I)，人免疫缺损病毒(HIV),单纯疱疹病毒(HSV)等。后者如呼吸道合胞病毒(RSV),登革热病毒(DGV)，肾综合征出血热病毒(HFRSV)； (3)常规疫苗免疫效果差，如霍乱和痢疾菌苗；或者反应大，如百日咳和伤寒菌苗。 (4)能大大节约成本，简化免疫程序的多价疫苗，如以痘苗病毒，腺病毒，卡介苗或沙门氏菌为载体的多价活疫菌；
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基因工程亚单位疫苗 其表达系统可以是酵母，也可以是哺乳动物细胞，若无需糖基化的多肽疫苗甚至可在大肠杆菌等原核细胞中表达。如HRSAg在CHO/酵母中表达，可预防已肝。霍乱弧菌肠毒素B在E.coli中表达来预防霍乱、腹泻。
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基因工程载体疫苗
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核酸疫苗 核酸疫苗（Nucleic Acid Vaccines）使用能够表达抗原的基因，即核酸制成的疫苗，包括DNA和RNA疫苗。研究较多的是DNA疫苗。通过DNA重组技术把编码病原体保护性抗原的基因克隆入真核表达载体中。 构建核酸疫苗的载体主要有重组质粒型载体和病毒载体（包括逆转录病毒）。尤以前者较多。重组了目的基因的质粒经细菌扩增后，提取质粒DNA并加以纯化，即可制成核酸疫苗用于免疫接种。 进入机体的核酸疫苗不与宿主细胞染色体整合，但它能够表达保护性抗原蛋白，刺激机体产生特异性免疫应答，进而使机体产生特异性抗感染免疫力。
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DNA疫苗（DNA vaccine）又称基因疫苗（genetic vaccine）或核酸疫苗（nucleic acid vaccine），是指将编码某种抗原的外源基因与质粒载体重组，构建出真核表达载体，通过肌肉注射等途径直接导入动物细胞后，能利用宿主细胞的蛋白质合成系统合成外源抗原蛋白，并诱导宿主细胞产生对该抗原的体液和细胞免疫应答，尤其是能诱导产生具细胞毒杀伤功能的T淋巴细胞，以达到预防和治疗疾病的目的。
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(一)DNA疫苗的制备 选择要表达的基因 载体的选择 质粒抽提和疫苗制备 体外真核细胞的转染 测定体内的抗体反应 实验动物模型 免疫途径
免疫程序 攻击和免疫保护力检定 保护力的相关性指标
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（二）DNA疫苗的接种途径 1．裸DNA直接注射入肌肉、皮下、粘膜处或静脉内；
2．脂质体包裹DNA后直接注射，通过脂质体与细胞膜的融合摄入DNA，减少了对DNA的破坏； 3．把DNA基因用基因枪注入组织体内，以引起免疫反应； 4．一些细菌作载体，而该细菌属于组织细胞内的特异亲和性但无害的常居菌，将DNA带到亲合性部位后，细菌裂解释放DNA，产生免疫应答。
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（三）DNA疫苗的优点 DNA疫苗与传统疫苗相比具有很多优点，主要表现在：
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4．有些病原体在感染机体后可通过改变自身的抗原结构而逃避免疫系统的攻击，选择某一病原体编码的抗原蛋白所对应的保守核苷酸序列制成DNA疫苗，可以对同一种病原体的不同突变型产生交叉免疫；
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（四）DNA疫苗临床试验 从1995年开始，美国FDA已批准了6种DNA疫苗的临床试验，包括艾滋病，流感，单纯疱疹，乙型肝炎，疟疾和癌胚抗原DNA疫苗。其中疟疾DNA疫苗在人体产生的免疫反应比较好，虽然抗体的免疫反应几乎为零，但是大部分的疫苗接种者都产生了特异性的细胞免疫反应，尤其是能诱导出显著的CTL反应
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（五）DNA疫苗中存在问题 DNA疫苗作为一种外源ＤＮＡ，进入宿主细胞后，一旦整合到人类的基因组中，就可能使细胞癌基因激活或抑癌基因失活，导致细胞发生恶性转化和癌变。通过大量动物实验的研究表明，进入细胞内的质粒ＤＮＡ分子是以游离状态存在于细胞质中，未发现复制和整合现象。 1．诱导机体产生抗ＤＮＡ抗体，造成自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮。最近研究证实，裸露的双链ＤＮＡ分子在机体内很难引起抗ＤＮＡ抗体反应。 2．产生免疫耐受，出现无免疫性现象。这主要是由于外源蛋白质的表达量过低，长期刺激使机体免疫系统新产生的免疫细胞不断耐受的结果。 3．外源蛋白长期在体内表达，可能打破机体原有的免疫平衡状态，产生难以预测的后果。
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基因缺失减毒活疫苗 如狂犬病毒发生TK缺失（第一代），再发生gp3区缺失（第二代）HSV-1的α22缺失。
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蛋白工程疫苗
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遗传重组疫苗
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合成肽疫苗
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抗独特型抗体疫苗
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微胶囊可控缓释疫苗
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疫苗评价体系 疫苗要求： 安全、有效、有极强的免疫原性和极弱或无毒副反应； 能诱导产生持续性免疫力，并能阻止免疫缺陷病毒的出现或延缓出现；
有效的疫苗不仅可以诱导出中和抗体，还可以产生细胞介导的细胞免疫应答，才能阻止感染的建立或阻断游离或与细胞结合的病毒传播。
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重要基因工程疫苗国内外的研发状况
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AIDS疫苗 人类获得性免疫缺陷综合征（AIDS）简称艾滋病。是一种由病毒引起的全身性传染病，该病由人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染而引起，导致被感染者免疫功能的部分或完全丧失，CD4+细胞数目减少，继而发生机会性感染、肿瘤等，临床表现多种多样。该病传播速度快、病死率高，且目前无法治愈，引起了各国政府和社会的关注。面对HIV仍在全球不断蔓延的严竣形式，国际社会已达成需优先发展艾滋病疫苗的共识。科学家们自1987年第一个艾滋病疫苗进入临床试验以来，投入了大量精力和时间对艾滋病疫苗作了广泛深入的研究。
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（一）研制艾滋病疫苗的可行性 疫苗已成功用于其他病毒性疾病的预防 有些实验性HIV疫苗可以保护非人类灵长动物免患艾滋病或艾滋病样疾病
一些候选HIV疫苗在I/II期临床实验中能诱导免疫应答并被证明是安全的 某些人可以出现病毒诱导的免疫应答，保护他们不受HIV感染，如高度暴露的未感染人群 所有感染者在发病前都可在一段时间内控制HIV感染，一小部分感染者甚至15年仍没有发病，如长期不进展者。 低病毒载量感染者的临床进展缓慢，因此在一段时间或一生中有助于控制感染者的病毒载量的疫苗可能会使感染者保持健康，防止向他人传播 用抗HIV抗体或抗SIV抗体被动接种猩猩猕猴在一定条件下可预防HIV感染。
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（二）已研制的艾滋病疫苗 1．合成多肽疫苗 2．基因工程亚单位疫苗 3．病毒样颗粒疫苗 4．核酸疫苗 5．活载体疫苗（最有前景）
6．灭活疫苗 7．减毒活疫苗
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三、疫苗佐剂 佐剂（adjuvant）,能加强抗原的免疫原性和免疫保护效果的物质。70多年前在疫苗的研制中开始使用免疫佐剂，如在提纯的白喉类毒素中加入硫酸铝钾，随后加入氢氧化钠当类毒素通过离子的相互作用而结合于此种凝胶后，能产生比游离的类毒素更好的免疫原性。以氢氧化铝和磷酸铝为代表的铝佐剂仍然是唯一被批准合法使用的人用疫苗佐剂。 评价佐剂质量的优劣或能否适用于人用疫苗的主要因素有： 促进免疫反应的能力； 副作用的大小； 价格和成本 其中最关键的的因素又是副作用的问题。
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1、无机佐剂 铝佐剂 磷酸钙佐剂 2、油剂 1）福氏佐剂与福氏不完全佐剂 2）MF59 3、细菌或细菌产物佐剂 1）霍乱毒素和大肠杆菌不耐热毒素 2）重组百日咳毒素的佐剂作用 3）B群流脑杆菌的外膜小体 4）卡介苗 5）细菌脂多糖 4、其他 1）植物佐剂 2）人工合成佐剂（脂质体、免疫刺激复合物） 3）细胞因子佐剂 4）核酸佐剂
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常用的疫苗佐剂 1、无机佐剂 铝佐剂：部分纯化的蛋白抗原，破伤风类毒素或白喉毒素在磷酸根或碳酸氢根存在下沉淀出的含磷酸铝的混合物，是唯一广泛使用的人用疫苗佐剂。 缺点：不能冻干 制备的凝胶批间差异大 不能加强细胞毒淋巴细胞活性 注射部位有红斑，结节，硬肿 铝盐易在体内蓄积，特别是脑部，有可能导致脑病的发生。 磷酸钙佐剂 十二水磷酸氢二钠与二水氯化钙的等摩尔混合物。成功用于白百破，脊灰炎，卡介苗，麻疹，乙肝，HIV等疫苗 不引起IGE抗体反应。
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2、油剂 1）福氏佐剂与福氏不完全佐剂 完全佐剂由密度较小的矿物油及死的分枝杆菌和乳化剂组成。不完全佐剂去除了分枝杆菌的低毒剂。
在抗体效价和免疫持久性方面远高于铝佐剂 ，不良反应严重，只用于动物免疫。 2）MF59 相同量的抗原，比铝佐剂抗体效价高3-50倍。
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3、细菌或细菌产物佐剂 1）霍乱毒素和大肠杆菌不耐热毒素 2）重组百日咳毒素的佐剂作用 3）B群流脑杆菌的外膜小体 4）卡介苗 5）细菌脂多糖
127
脂质体佐剂
129
免疫刺激复合物
130
细胞因子佐剂
131
核酸佐剂 对DNA疫苗的研究发现，核酸本身也有佐剂 作用。 常使用表达与免疫相关的细胞因子的核酸载体为佐剂
132
第三节 基因治疗 基因治疗（Gene therapy ） ：指应用DNA重组技术，将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病,以达到治疗的目的。 为达到这一目的，实施相应的策略。
133
（一）基因修正 用DNA重组技术设法在原位修复患者细胞中有缺陷的基因，使细胞恢复正常功能而达到治疗遗传病的目的。
为较理想的基因治疗策略，由于存在某些问题，目前正在努力之中。（未实现）
134
（二）基因置换(gene replacement)
指将特定的目的基因导入特定细胞，通过定位重组，以导入的正常基因取代基因组内有缺陷的基因，不涉及基因组其它改变。（未实现）
135
必要条件 导入基因及其产物有详尽了解 外来基因能有效导入靶细胞 导入基因能在靶细胞中长期稳定驻留 导入基因有适度表达 基因导入的方法与所用载体对宿主安全无害
136
（三）基因添加（gene augmentation）
导入外源基因使靶细胞表达本身不表达的基因。 导入正常基因 缺陷基因未删除，导入的正常基因整合到基因组中并表达，从而补偿缺陷基因功能 导入靶细胞本来不表达的基因 例如将某种细胞因子基因导入肿瘤细胞，利用其表达产物进行治疗
137
（四）基因失活（ gene inactivation）
采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因使之不表达，以达到治疗的目的 常用的方法是采用反义核酸或反义核酸加核酶。此类基因治疗的靶基因往往是过度表达的癌基因或病毒基因
138
基因治疗的方法 ①必须分离出具有特定功能的特异性基因；②必须能够获得足够数量的携带有该基因的载体和细胞；③必须建立一条有效的途径将该外源基因导入体内、转染靶细胞；④转染并进入宿主细胞的目的基因必须能产生足够量的产物，可以维持适当长的时间，且不产生有害的副作用。 基因治疗的关键性步骤---- 目的基因的获得与转移
139
一）目的基因的获得— 正常基因的分离与克隆 基因治疗首先获得目的基因通常从基因组中分离 基因克隆 ↓ 定 位 表 达 评价表达情况
140
二）外源基因的转移 通过不同方法，将目的基因转移至受体细胞。
141
1）物理方法 （1）电穿孔法（electroporotion）将细胞置于高压脉冲电场中，通过电压使细胞产生可逆性的穿孔。周围基质中的DNA可渗进细胞，进而表达。 瞬间 细胞 细胞膜核膜通透性增加 高压脉冲 DNA渗入细胞
142
（2）显微注射法（microinjection ）
利用显微操作把目的基因直接注入靶细胞或细胞核
143
例：转基因动物的制备 重组基因 DNA 微注射 （体外） 小鼠受精卵 回植 假妊娠 仔 鼠 动物模型：转基因鼠
仔 鼠 动物模型：转基因鼠 (每个鼠细胞中都含有外源基因，按孟德尔方式遗传)
145
clone sheep Dolly 体细胞 提取 核 重组细胞 回植 Dolly 卵细胞 去核 细胞
146
（3）微粒子轰击法 利用亚微粒的钨和金能吸附DNA，并将其包裹起来形成微粒，通过物理途径获得高速度，微粒瞬间既可进入靶细胞，达到转移目的基因的目的，而不损伤靶细胞。 该方法可使目的基因在皮肤、肝、胰、胃及乳腺等细胞中表达。
147
(4)磷酸钙沉淀法 目的基因与磷酸钙等物质混合，形成沉淀的DNA 微细颗粒，易通过细胞膜进入细胞内，并整合到受
体细胞基因组中，在适当条件下得以表达。
148
磷酸钙+DNA → 混合微细颗粒 ↓ 沉淀反应20~30min 细胞在沉淀物中暴露 5~24h 方法简单，但转化效率低。
149
(5) 脂质体法（liposome） 应用人工制备的类似细胞膜的膜性结构——脂质体，人工方法使磷脂在水中形成磷脂双层包裹目的基因，包装外源基因，再与靶细胞融合，外源DNA导入靶细胞，使其表达 DNA 细胞融合 转化细胞 PEG 仙苔病毒 DNA 脂膜
150
(6)同源重组法 同源重组（homologus recombination）:外源基因和染色体上的基因在同源序列间发生重组而插入染色体。
将外源基因定位导入细胞的染色体上。 单交换 双交换
151
(7)病毒介导基因内转移（Viral mediated transfer）
是通过病毒为载体（vector），将外源基因通过重组技术与病毒重组，然后去感染受体细胞 感染细胞 重组病毒
152
有逆转录病毒载体，腺病毒载体，腺相关病毒载体，单纯疱疹病毒载体,猿猴空泡病毒40（SV40载体）,痘苗病毒载体，杂合病毒载体 。经改造，删除编码功能蛋白基因，保留顺式作用区（与复制，整合，转录，包装有关），无致病性
153
逆转录病毒(RNA) 常用的病毒载体 DNA病毒 1) 逆转录病毒（retrovirus） 目前应用最多、最成功. 病毒感染细胞后，其基因组RNA 经逆转录产生双链DNA拷贝，插入宿主染色体形成前病毒（provirus），前病毒转录产生的正链既是病毒RNA，再与前病毒编码的外壳蛋白包装成新的病毒颗粒。
154
逆转录病毒载体优点： ①高效感染宿主细胞，转染率可达100% ②病毒基因和所载的外源基因都可能表达
③宿主范围广，可同时感染大量细胞并长期存留
155
逆转录病毒载体用于基因治疗的安全性 逆转录病毒感染的可能性：不能完全排除 污染的可能性：操作过程污染
逆转录病毒在靶细胞基因组的整合：随机整合
156
缺 点 ②病毒随机插入靶细胞基因组中，因病毒具有强大的启动子和增强子，能使插入点附近的基因过度表达或失活，插入的 外源基因可能不适当的表达；
缺 点 ①病毒基因容量有限，一般只能插入7kb左右片段； ②病毒随机插入靶细胞基因组中，因病毒具有强大的启动子和增强子，能使插入点附近的基因过度表达或失活，插入的 外源基因可能不适当的表达； ③逆转录病毒有致癌作用，可能使受体细胞癌变。 根据逆转录病毒的缺点，人们有目的地将其改造，保留其优点，除去癌基因和病毒基因，保留LTR和包装信号。
157
8）受体载体转移法 将含有目的基因的重组质粒和某些细胞表面受体能识别的特异性多肽（配体）形成复合物，通过细胞内吞途径达到转移基因的目的。制成配体多聚赖氨酸复合物，利用配体与细胞膜受体的识别作用，被吞噬入细胞。 复合物 重组质粒 配体 细胞膜
158
靶细胞的选择 靶细胞是指接受外源Gene的细胞 选择靶细胞的原则是： 1）必须较坚固，便于体外培养和进行遗传技术 操作；
2）易于由人体分离又便于输回体内 3）具有增殖优势，生命周期长（能存活几月至 几年，或整个生命周期） 4）易于受外源遗传物质转化。 5）有组织特异性；细胞易获得；体外易培养；植入体内易成活
159
常用的靶细胞 1、生殖细胞基因治疗 2、体细胞基因治疗 目前仅限于体细胞，严禁使用生殖细胞作靶细胞
160
1、生殖细胞基因治疗 将正常基因转移到患者生殖细胞（精细胞，卵细胞，早期胚胎）使其发育成正常个体。为理想的治疗方法，从根本上治疗遗传病，使其有害基因不能在人群中散播。
161
但还存在某些问题： 1）靶细胞的遗传修饰至今尚无实质性进展； 2）基因转移效率不高，只能用显微注射方法；
3）只适用于排卵周期短而次数多的动物，很难适用于人类。 （但目前辅助生殖技术的发展较为有效的解决了获取卵细胞的办法。一次可获取少者3-5个，多者十几个。）
162
2．体细胞基因治疗 somatic cell gene therapy
将正常基因转移到体细胞，使之表达基因产物，以达到治疗的目的。但有害基因能遗传给后代。
163
措 施： （1）正常基因转移至体外培养的体细胞，有效 表达后，再回输到体内。 （2）正常基因导入靶细胞，定位整合到染色体
措 施： （1）正常基因转移至体外培养的体细胞，有效 表达后，再回输到体内。 （2）正常基因导入靶细胞，定位整合到染色体 上，准确的替换异常基因，是理想的措施。 （3）随机整合，非特定座位，只要有效的表达 即可达到治疗的目的。 （4）体细胞基因治疗理论上不必矫正所有的体 细胞。
164
存在的问题 对特定座位基因转移，目前还存在较大困难； 随机插入可能引起后代的基因突变。
165
造血细胞 由于造血干细胞量少难培养，因此，对骨髓细胞的基因转移实验主要是将基因转移到未分离的骨髓细胞，如果转移4个月后骨髓和淋巴细胞组织内仍有转移基因的存在或表即认为转染成功。
166
皮肤成纤维细胞 肝细胞 血管内皮细胞 淋巴细胞 肌肉细胞 肿瘤细胞
167
5、反义核酸技术 反义技术（antisense technology）是指人工合成或生物合成的DNA或RNA，它们能与RNA互补，是抑制与疾病发生的基因表达的一种手段，它能封闭基因表达，具有特异性且操作简单，可用于治疗由于基因突变过度表达所致的肿瘤和遗传疾病。它主要包括反义RNA、反义DNA和核酶(ribozymes)三大技术。
168
反义基因治疗 DNA DNA RNA RNA 反义RNA 阻断表达
169
反义RNA（antisense RNA） 指能与靶分子mRNA序列互补的RNA片段， Antisense RNA可与mRNA配对成双链，也可与引物RNA互补从而抑制翻译和复制过程。通过碱基对氢键的作用与靶mRNA形成双链复合物而影响基因的转录、翻译和加工过程，从而调控基因的表达。 从理论上分析，反义RNA应该属于负调控方式，其作用的环节是转录后mRNA从胞核到胞浆的转移阶段和翻译起始阶段；目前，用于基因治疗的方法主要是受体介导的Antisense RNA转移技术。
170
反义RNA（antisense RNA） 应用前景 安全性高 Antisense RNA设计和制备方便 有剂量调节效应
171
核酶（ribozyme） 核酶(ribozyme) 是1986年Cech提出的，指的是一类具有酶催化活性的RNA分子，能催化生化反应，但在催化时需保持如“榔头”结构的特殊构象，作用方式是酶解特异靶分子mRNA，酶活性都较低。可以在预选位点剪切RNAs的反义RNAs，又称为催化RNAs，RNA催化剂，酶RNA。 核酶又称催化RNA，俗称"基因剪刀"。它是天然的具有催化能力的RNA分子，在许多生物过程中都起着重要作用，如RNA的自我裂解，自我剪接，肽键的形成及染色体DNA终端的合成等。尤其重要的是它能够特异性催化RNA剪切。
172
一个核酶分子可以裂解与之结合的靶向mRNA，将其释放，然后再裂解其它靶向RNA；而一个反义RNA分子只能“自杀性”地阻止一个RNA分子发挥生物活性。所以与反义RNA相比，核酶药物具有治疗剂量小，药物毒性小等优点。 同时，由于病毒基因组的变异很快，所以病毒对大部分针对单一靶向的治疗方法会很快地产生耐受性，而将多种针对不同RNA靶向序列的核酶同时用于抑制病毒RNA，病毒就较难产生耐受性。
173
核酶的设计：用于基因治疗的核酶分子由三部分组成，中间是保守序列（能够组成酶活性的结构域），两端为引导序列（guide sequences）。引导序列随靶序列的碱基组成而变
导入方法：外源导入、内源导入
174
基因治疗实例 －腺苷脫氨酶缺乏症 生理：腺苷脱氨酶是一种细胞内酶，在核酸代谢中起重要作用，使淋巴细胞中的脫氧腺苷脱氨成为脱氧肌苷，最后代谢为尿酸，排出体外。 病理：腺苷脫氨酶缺乏－脫氧腺苷不能脱氨－脱氧腺细胞内堆积－淋巴细胞死亡－机体免疫功能缺乏。
175
治疗基础 腺苷脱氨酶基因位于20号染色体长臂 1983年腺苷脱氨酶基因被克隆 应用逆转录病毒可将该基因送入缺乏腺苷脱氨酶基因的淋巴细胞
新输入的腺苷脱氨酶基因可在原来没有此基因的淋巴细胞中表达
176
治疗步骤 抽取病人骨髓，分离淋巴细胞 將病人淋巴细胞与携带腺苷脱氨酶基因的逆转录病毒载体混合培养，使腺苷脫氨酶进入淋巴细胞
清洗淋巴细胞，去除多余病毒载体。应用抗性基因等方法选择阳性细胞，检测细胞内外腺苷脱氨酶含量
177
治疗步骤 确定腺苷脱氨酶在淋巴细胞有满意表达后，将带有此基因的淋巴细胞输回患者体内 密切观察病人各项免疫指标的变化，必要时加以调整和重复
经如上治疗后，患病女童免疫功能基本恢复。以后又连续进行了多次输入
178
ADA-Gene + vector （逆转录病毒）
重组分子 患者T Ly C IL-2刺激C分裂 导入 细胞生长分裂 10天 Gene表达 回输患儿体内 1~2月治疗一次, 10个月 患儿体内ADA水平达正常人的25%
179
黑色素瘤的基因治疗实例2 肿瘤Gene治疗是人们十分关注的问题，进行了广泛的探索。研究发现，肿瘤浸润淋巴细胞——TIL，它积聚肿瘤部位，并在该处持续存在而无副作用，利用此特点协助治疗肿瘤。
180
例：细胞因子基因治疗和肿瘤坏死因子基因治疗
①IL-2 Gene ②TNF-Gene （白介2） （肿瘤坏死因子） 逆转录病毒载体 导入 TIL（体外培养的自体细胞） 回植患者体内 TIL进入自体肿瘤部位，提高细胞因子杀伤肿瘤细胞 的作用。
181
自杀基因的基因治疗实例3 原理：即用（逆转录）病毒载体将编码某种酶的基因（自杀基因）转染到肿瘤细胞中，此酶可将一种无害的药物前体转变为细胞毒复合物，进而杀伤肿瘤细胞（肿瘤细胞不能复制而死亡）。这种基因载体只能在特定的组织或肿瘤中表达，而正常细胞中不表达。
182
如： 自杀基因 + 病毒载体 转染 重组载体 药物前体 无毒 Gene→酶→ ↓ 药物复合物 有毒 细胞死亡
183
单基因疾病的基因治疗可能会成为今后的突破点；多基因疾病困难更大。
肿瘤基因治疗，方法五花八门，各有特点。有纠正抑癌基因缺陷；有抑制癌基因过度表达；有导入细胞因子；有导入自杀基因；有导入耐药基因。 前景诱人，困难很大，方法不成熟。
184
基因治疗需具备下列条件 选择适当的疾病，清楚疾病的发病机理，Gene的结构和功能。 被纠正的基因已克隆，并清楚Gene表达与调控机制与条件。
选择适当的受体细胞并在体外有效表达。 安全有效的基因转移方法，以及供利用的动物模型。
185
导入基因的持续性和高效表达 如何提高基因的持续高效表达，从下列几方面考虑： 1、选择高效的基因转移方法；
2、选择适当的受体细胞（生命周期长的细胞） 3、选择适当的载体（广泛表达或特异性表达的载体，以使Gene高效表达）
186
Gene治疗与社会伦理道德 体细胞Gene治疗符合伦理道德，没有争议。
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