实验三 PCR扩增目的基因 【目的要求】 1．掌握实验原理和实验基本过程； 2．了解PCR引物设计原则；学会设计PCR引物 ；

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1 实验三 PCR扩增目的基因 【目的要求】 1．掌握实验原理和实验基本过程； 2．了解PCR引物设计原则；学会设计PCR引物 ；

2 【实验器材】 PCR仪，台式离心机，微量移液器（20μl, 200 μl 1000 μl ）,0.2 μl Enpendorf管，电泳设备等 【实验材料】 大肠杆菌AKP基因DNA模板，引物，4dNTP，Taq酶，PCR缓冲液、无菌水，琼脂糖，DNA染料，电泳缓冲液等。 【实验内容】 PCR基础知识介绍； PCR的基本原理； PCR引物设计原则； PCR的基本过程及程序设计；

3 【实验原理】 1）合成待扩增区域两端已知序列，与模板DNA互补的寡核苷酸特异性引物，引物的序列决定扩增片段的长度；
2）PCR反应原理和反应过程 DNA的体外复制包括3个步骤：变性、退火和延伸，3个步骤作为PCR的一个循环，每当完成一个循环，一个分子的模板被复制为二个，产物量以指数形式增长。 变性 Denaturation 94~95℃，1min 复性 Annealing ~55℃,1min 延伸 Extension 70~72℃,1min 72 ℃ 延伸10min DNA扩增100万倍

4 【操作步骤】 1. 建立PCR反应体系（依次混匀下列试剂） DNA模板 1 引物1 1 引物2 1 4XdNTP Mix 2.5
组成成分 加入量（μl） DNA模板 引物 引物 4XdNTP Mix 10XPCR缓冲液 Taq酶 H2O 总体积

5 2. 将加好的管充分后，离心数秒，放入PCR仪上。
3. 编辑PCR反应程序，完成后启动PCR仪。 电泳 　PCR完成后，取6-8μl扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析，检查反应产物及长度。

6 [注意] PCR非常灵敏, 操作应尽可能在无菌操作台中进行。 吸头、离心管应高压灭菌, 每次吸头用毕应更换, 不要互相污染试剂。 加试剂前, 应短促离心10秒钟, 然后再打开管盖, 以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。 应设含除模板DNA所有其它成分的负对照。 思考题 　1.降低退火温度对反应有何影响？ 　2.延长变性时间对反应有何影响？ 　3.循环次数是否越多越好？为何？ 　4.如果出现非特异性带,可能有哪些原因？

7 对PCR的优化是必需的！！！  X

8 程序设计 开机 开机 进入菜单 94℃,5min 94 ℃,1min 72 ℃,1min 55 ℃,1min 72 ℃,5min

9 聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)
PCR是模拟体内DNA复制条件，应用DNA聚合酶反应，特异性扩增某一DNA片段的技术。 体外程序化的DNA合成技术。 devised by Kary Mullis in 1983 Mullis, K.B. (1993) The unusual origin of the polymerase chain reaction. Scientific American. 262 (4)

10 PCR Typically in the range of bp long.

11 PCR扩增

12 PCR特点及应用 特点：（1）特异性强，灵敏度高，稳定可 靠，快速； （2）微量的模板DNA即可扩增大量产物;
特点：（1）特异性强，灵敏度高，稳定可 靠，快速； （2）微量的模板DNA即可扩增大量产物; 缺点：（1）需靶DNA序列的信息； （2）产物短小，DNA复制不精确。

13 PCR应用 基因组DNA分析 genomic assay
克隆基因或基因片断 Cloning of genes or gene fragments 遗传病的诊断 Genetic diagnosis 亲子鉴定 Paternity testing 反转录PCR Reverse transcription (RT)-PCR 犯罪现场的法医分析 Forensic analysis at scene of crime 传染病的分析 Assays for the presence of infectious agents 遗传病的产前诊断 Prenatal diagnosis of genetic diseases 体外突变与DNA工程 In vitro mutagenesis and engineering of DNA 等位基因序列变化的分析 Analysis of allelic sequence variations

14 PCR反应中的成份 1. 引物：PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。
引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则： (1) 引物长度约为16-30bp， 太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长浪费。 (2) 引物中G+C含量通常为40%-60%,可按下式粗略估计引物的解链温度 Tm＝4(G+C)+2(A+T). (3) 四种碱基应随机分布，在3‘端避免连续3个G或C,因这样易导致错误引发。 (4) 引物3'端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二

15 位核苷酸对应,以减少因密码子摆动产生的不配对。 (5) 在引物内, 尤其在3‘端应不存在二级结构。
(6) 两引物之间尤其在3‘端不能互补, 以防出现引物二聚体, 减少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。 (7) 引物5‘端可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、地高辛等。通常应在5’端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。 (8) 引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构, 以免产生非特异性扩增,影响产量。 -OH OH- 3’

16 dNTP应用NaOH将pH调至7.0,并用分光光度计测定其准确浓度。dNTP原液可配成5-10mmol/L并分装,-20℃贮存。
2. 四种三磷酸脱氧核苷酸(4XdNTP) dNTP应用NaOH将pH调至7.0,并用分光光度计测定其准确浓度。dNTP原液可配成5-10mmol/L并分装,-20℃贮存。 一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200μmol/L。理论上4种dNTP各20μmol/L，足以在100μl反应中合成2.6μg的DNA。当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制TaqDNA聚合酶的活性。4种dNTP的浓度应该相等，以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。

17 3. Mg2+： Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大，它可影响酶的活性和真实性，影响引物退火和解链温度, 影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。通常Mg2+浓度范围为0.5-2mmol/L。在PCR反应混合物中，应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团， 例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+离子浓度的物质，以保证最适Mg2+ 浓度。

18 Determine your Mg2+ Concentration
mM 通常1～1.5mM MgCl2 是最佳选择，Mg2+ 的浓度受DNA的量、引物的量的影响，同时所扩增DNA的量受Mg2+ 的浓度的影响。

19 4. 模板： PCR反应必须以DNA为模板进行扩增, 模板DNA可以是单链分子，也可以是双链分子，可以是线状也可以是环状分子。模板影响PCR的主要因素是数量和纯度。一般对于单拷贝基因，这需要0.1μg的人基因组DNA，10ng的酵母DNA，1ng的大肠杆菌DNA。扩增多拷贝序列时，用量更少。模板量过多则可能增加非特异性产物。DNA中的杂质也会影响PCR的效率。 5. Taq DNA聚合酶： 一般Taq DNA聚合酶活性半衰期为92.5℃ 130min，95℃ 40min，97℃5min。现在人们又发现许多新的耐热的DNA聚合酶，这些酶的活性在高温下活性可维持更长时间。

20 灭活Taq DNA聚合酶的方法有： (1) PCR产物经酚:氯仿抽提,乙醇沉淀。 (2) 加入10mmol/L的EDTA螯合Mg2+。 (3) ℃加热10min. (4)目前已有直接纯化PCR产物的Kit可用。

21 6. 反应缓冲液： 反应缓冲液一般含10-50mmol/L Tris·Cl (20℃下pH ), 50mmol/L KCl和适当浓度的Mg2+。Tris·Cl在20℃时pH为 ,但在实际PCR反应中，pH为 。50mmol/L的KCl有利于引物的退火。另外，反应液可加入5mmol/L的二硫苏糖醇(DDT)或100μg/ml的牛血清白蛋白(BSA)，它们可稳定酶活性,另外加入T4噬菌体的基因32蛋白则对扩增较长的DNA片段有利。各种Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。