报告人：徐照学 研究员 河南省农业科学院畜牧兽医研究所 所长 国家肉牛牦牛产业技术体系 岗位专家 2015年 6 月 胚胎移植在良种牛快速扩繁中的应用 报告人：徐照学 研究员 河南省农业科学院畜牧兽医研究所 所长 国家肉牛牦牛产业技术体系 岗位专家 2015年 6 月

一、牛胚胎移植技术 1、胚胎移植的意义 充分发挥优良母畜的繁殖潜力，提高繁殖效率 缩短世代间隔，加快遗传进展 代替种畜的引进 保存品种资源 可使不孕母畜获得生殖能力

牛是单胎动物，自然状态下一胎只能产一犊，若按照牛繁殖年龄10岁计算，其一生最多只能留下7－8个后代，对奶牛而言，只能留下3－4头母犊，而利用胚胎移植技术可以克服自然条件下动物繁殖周期和繁殖效率的限制，其繁殖后代的速度是自然状态下的十几倍甚至几十倍，从而快速增加良种牛的数量。因此，世界上许多畜牧业发达的国家都利用胚胎生物技术快速扩繁良种牛。

2、牛胚胎移植技术程序 供体牛的选择 同期发情 超数排卵 胚胎采集 检胚 胚胎的冷冻保存 胚胎的解冻 移植胚胎

(1)供体牛的选择 供体牛就是生产胚胎的优良母牛。胚胎移植所产后代的遗传背景，一半是由供体母牛决定的，所以供体牛选择是胚胎移植技术的重要环节。确定供体牛前需作必要的检查，进行严格的选择。对供体牛资源要进行调查，依据调查资料，进行血统、生产性能和体型审查，运用各种科学方法做出综合评定，选出符合要求的个体。要求供体具有重要育种价值、经济性能优越、生殖机能正常、对超数排卵有良好反应的健康母体。概括起来，主要包括以下7个方面：

品种优良：符合本品种标准，血统、体型外貌和生产性能全优，遗传性稳定、谱系清楚 符合育种方向：供体母牛各个经济性状的表现值及遗传力应与育种方向一致 体质健康 年龄适宜 繁殖性能 排卵成绩 性情温顺

(2) 同期发情 供、受体同期发情处理有以下三种方案： （1）一次前列腺素法：对处于发情周期第10天左右的供、受体牛一次肌肉注射氯前列烯醇2～4ml（0.32-0.64mg,按牛体重大小）诱导发情。 （2）二次前列腺素法：注射一次氯前列烯醇2～4ml后11天左右再次肌注氯前列烯醇2～4m1。 （3）阴道栓加前列腺素（CIDR+PG）法：在任意一天放入含有孕酮的阴道栓，10天左右取出阴道栓，同时肌注4m1氯前列烯醇。 受体牛同期发情要比供体牛早一天进行。 前列腺素处理法只有当母牛在发情周期第5～18天，有功能黄体时期才能产生催情反应。对于周期第5天以前的黄体，前列腺素并无溶解作用。

（3）超数排卵 超数排卵简称超排，就是在母牛发情周期的适当时间注射促性腺激素，使卵巢产生比自然生理条件下更多的卵泡并排卵。牛一个情期一般只有一个卵泡发育成熟并排卵，授精后只产一犊。超排处理 后，卵巢上同时可有多个 卵泡发育，一次可生产几 个甚至几十个胚胎，充分 发挥良种母牛的繁殖潜力。

超排方案： 超排处理一般方法为在发情周期的第9～13天开始, 每日肌注 FSH 2 次，采用递减法，连续 4 天，超排的第 3 天下午或第4天上午注射前列腺素，注射前列腺素48小时后对发情牛进行第 1 次人工授精，间隔 12 小时进行第 2 次人工授精。

（4）胚胎采集 胚胎采集即胚胎回收，又称冲胚、采胚、冲卵或采卵，是将一种专用的冲胚管按照一定的方法送入到子宫角前端，用专用的溶液将早期胚胎从母牛的子宫中冲出来。 冲胚一般在输精后6～7天进行，采用二路式导管冲胚管。二路式导管冲胚管是由带气囊的导管与单路管组成。导管中一路用于气囊充气，另一路用于注入和回收冲胚液。

冲胚程序: ①用2％普鲁卡因或利多卡因5毫升，在荐椎与第一尾椎结合处或第一尾椎与第二尾椎结合处施行硬膜外腔麻醉，以防止子宫颈紧缩及母牛努责不安。②洗净外阴部并用酒精消毒。③用扩张棒扩张子宫颈，用黏液抽吸棒抽吸子宫颈黏液。④通过直肠把握法，把带钢芯的冲胚管慢慢插入子宫角，当冲胚管到达子宫角大弯处，由助手抽出钢芯5厘米左右，继续把冲胚管向前推。当钢芯再次到达大弯处时，再把钢芯向外拔5～10厘米，继续向里推进冲胚管，直到冲胚管的前端到达子宫角前1/3处为止。⑤从充气管向气囊充气，使气囊胀起堵着子宫角，以防止冲胚液倒流，固定后抽出钢芯，然后向子宫角注入冲胚液，每次20～50毫升，冲洗5～6次，并将冲胚液收集在带漏网的集卵杯内。为充分回收冲胚液，在最后一、两次时可在直肠内轻轻按摩子宫角。最后一次注入冲胚液的同时注入适量空气有利于液体排空。⑥两侧子宫冲完后，将气球内的空气放掉，把冲卵管抽回至子宫体，直接从冲卵管灌注稀释好的抗生素和前列腺素，再拔出冲胚管。

冲胚现场

冲胚示意图

（5）检胚 将集卵杯放置在显微镜下，检出其中的胚胎，对胚胎按级别和标准加以评级，装入细管内进行鲜胚移植或冷冻保存。方法是：将集卵杯静置5～10分钟，待胚胎沉底后，在实体显微镜下先在低倍镜下检查胚胎数量，然后在高倍镜下观察胚胎质量。最后装管进行鲜胚移植或冷冻保存。

检胚

（6）胚胎的冷冻保存 不进行鲜胚移植的胚胎需进行冷冻保存，胚胎的超低温冷冻保存概括起来可分为程序化冷冻保存和玻璃化冷冻保存 。

（7）胚胎的解冻 以胚胎快速冷冻法为例，解冻时，从液氮罐中取出冷冻胚胎细管，在空气中停留5～10秒，于35℃水浴中轻轻摆动10～15秒，用干酒精棉球擦干，剪断封口，保证切口平整，装入移植枪。

（8）移植胚胎 移植胚胎一般在发情后第六至第八天进行。移植前需进行麻醉，通常用2％普鲁卡因或利多卡因5毫升，在荐椎与第一尾椎结合处或第一尾椎与第二尾椎结合处施行硬膜外腔麻醉，防止子宫颈紧缩及母牛努责不安。将装有胚胎的吸管装入移植枪内，用直肠把握法通过子宫颈插入子宫角深部，注入胚胎。应将胚胎移植到有黄体一侧子宫角的上1/3～1/2处，如有可能则越深越好。要求操作人员要在短时间内将胚胎移植到位，移植冻胚时原则上不超过10分钟。

移植胚胎示意图

3、 胚胎移植受体牛的选择 受体牛是移植胚胎的母体，移植后的胚胎要在其体内着床、生长发育直至足月分娩，因此，受体牛的选择及处理对胚胎移植的效果起着至关重要的作用。在受体牛的选购、处理及移植时应注意以下3个方面：

（1）受体牛的购买 品种 年龄（胎次） 性情 营养状况 健康状况

（2）受体牛的处理 作进一步的兽医检查 净化子宫 加强饲养管理 检查生理状况 受体牛的同期化处理

（3）受体牛的最后确定 根据发情时间确定受体牛移植顺序 根据胚胎的发育阶段选择受体： 同一时间处理的供体牛，甚至同一供体牛，胚胎的发育阶段不尽相同，在选择受体牛时，还要根据胚胎的不同发育阶段和受体牛的不同发情、排卵时间灵活搭配，尽量缩短胚胎发育时期和受体牛子宫环境的同步差。 根据黄体发育状况确定是否移植

受体牛的最后确定

4、进行胚胎移植应注意的事项 牛胚胎移植是一个系统工程，影响其成功的因素很多，其中涉及的每个技术环节都十分重要，一个步骤的大意，都会造成胚胎移植的失败，只有严格、认真、规范地做好每个环节的工作，尽可能地排除一切对胚胎移植的不利因素，才能确保胚胎移植的成功。进行胚胎移植应注意的事项 主要有以下几点：

（1）适当的输精次数 （2）配种时严禁用手触摸卵巢 实践证明，超排供体牛输精并非次数越多越好。因为精液是由蛋白质组成的，本身就是一种抗原，输进母牛体内以后必然激发其产生抗体，来排除这些异物。多输精1次就增加1倍的抗体量。所以在正常情况下以输精1～2次，输精间隔时间以8～12小时为宜。 （2）配种时严禁用手触摸卵巢 检查超排效果不能在输精时去摸卵巢的卵泡来判定，而是在冲胚前（或前一天）直肠检查牛的卵巢黄体个数来确定，通过检查可判断能冲出的胚胎个数。

（3）严格的无菌操作 整个冲胚过程中，使用扩张棒、粘液抽吸棒、冲胚管、注射器以及吸冲胚液、灌注冲胚液等过程属于无菌操作。 移植胚胎时要严格遵守无菌操作规程，以防生殖道感染。输精枪和移植枪在每次使用后要进行彻底清洗，干燥后用环氧乙烷气体消毒或干燥灭菌，对条件不具备的也可在每次输精后清洗干净输精器械，使用前一定要用75%酒精彻底消毒，待酒精彻底挥发后再使用。 （4）选择好移植季节

（5）冲胚液的量要把握好 尤其是第一次冲胚液的量要把握好，如果量太大，会将胚胎及液体从输卵管冲出，造成输卵管的损伤。 （6）超排药品的使用剂量要准确 当用量过大时，不但影响胚胎生产的数量，还会影响胚胎的质量。 （7）冲胚之前抽取子宫颈粘液，有利于胚胎的回收和检出。 （8）及时消除直肠空洞造成的操作障碍，便于对子宫的准确把握。

二、提高牛胚胎移植效益的操作方案 提高牛胚胎移植的规模化、商业化运作的经济效益，不仅仅依靠胚胎的生产和移植技术水平的提高，还需制订系列的操作方案。要从供体牛的选择与处理、提高胚胎生产效率、提高移植受胎率、降低胚胎生产成本和受体牛成本等方面，分析制订提高牛胚胎移植效益的操作方案。

1、供体牛的选择及处理方案 （1）供体牛的选择方案 严格选择供体牛。尤其是繁殖系统的健康状况。泌乳高峰期的奶牛，处于营养负平衡状态，对超排激素的反应不敏感，还可能与高蛋白日粮有关，超排效果往往不是很理想，不能作为供体选择。 利用育成母牛生产胚胎。母牛的初配年龄一般比性成熟晚4至7个月，以体重达到成年体重的70％时为宜。利用这一阶段，可以安排两次体内胚胎的生产，一般不会影响正常的配种程序。 利用遗传性能好但产奶性能较差的牛生产胚胎。如因乳房炎而淘汰的病牛约占总淘汰率的10%，可以作为供体牛使用，降低胚胎生产成本。

（2）对供体牛进行营养调控 供体的营养状况直接影响胚胎的质量和数量。营养供应量能够影响牛卵泡的生长和卵母细胞的质量和数量，因此，制订统一的饲养规程有助于得到大量均衡一致的优质胚胎。日粮配方能够显著改变体内尿素和氨的循环水平，而且，瘤胃中可降解氮的过剩或营养失调能引起胚胎成活力下降，因此，应选择一种不会产生过量瘤胃氨的日粮，从而避免卵泡内卵母细胞接触高浓度的有杀伤力的细胞毒素。

（3）供体牛子宫的净化处理和隐性子宫炎的检测 由于患隐性子宫内膜炎的母牛常不表现临床症状，直肠检查及阴道检查也不容易发现异常变化，发情周期正常，发情时子宫排出的分泌物较多，有时分泌物略微浑浊。对初步选择的供体牛要进行普遍的子宫净化。进行同期发情后，进行隐性子宫炎的检测，呈阳性的不能作为供体。

2、提高体内胚胎生产效率的操作技巧 （1）冲胚之前抽取子宫颈粘液 在冲胚胎时，如果子宫颈粘液或血凝块粘堵在冲胚管出水孔处，使冲胚液积在子宫内排不出导致冲胚失败。在子宫内充满积液的情况下，再注入冲胚液，还会导致冲胚液从输卵管冲出，对输卵管造成损伤。在冲胚前对母牛子宫颈的粘液抽取，一是减少粘液堵塞冲胚管造成的冲胚液回流不畅，从而提高胚胎的回收率；二是可以保证冲胚时冲出的溶液清亮透明利于检胚。

（2）及时消除直肠空洞造成的操作障碍 在进行冲胚和移胚时，发生直肠充气是一种较为常见的现象。由于手术前打了麻药后，直肠灵敏度降低，根本不能自行排气，在有空气进入直肠时容易造成直肠充气，形成空洞。此时，导致直肠壁很硬，不能准确把握子宫，无法继续工作，这时就需要用牛直肠抽气装置进行人工排气。

（3）制订细致的操作规范 在制订各项操作规范的时候，要准确到位，可操作性强，并强调注意事项，以免造成不必要的损失，尤其要注意以下事项： ①超排药品的使用剂量要准确。当用量过大时，不但影响胚胎生产的数量，还会影响胚胎的质量。 ②输精的次数要适当。超排供体牛输精并非次数越多越好，因为精液是由蛋白质组成的，本身就是一种抗原，输进母牛体内以后必然激发其产生抗体，来排除这些异物。多输精1次就增加1倍的抗体量，所以在正常情况下以输精2次为宜，输精间隔时间10～12小时。

③配种时严禁用手触摸卵巢。检查超排效果不能在输精时去摸卵巢的卵泡来判定，而是在冲胚前（或前一天）直肠检查牛的卵巢黄体个数来确定。 ④冲胚液的量要把握好。尤其是第一次冲胚液的量要把握好，如果量太大，会将胚胎及液体从输卵管冲出，冲胚无法进行，也会造成输卵管的损伤。

3、利用活体采卵技术进行胚胎的工厂化生产 活体采卵间隔时间的安排。母牛每周采卵1～2次。可间隔3～4天进行连续的采卵，对于正常母牛，无需使用激素；但是当母牛采卵数少于6个时，可用外源激素进行适当调节,通常的做法是每14天使用一次外源激素。每周两次的卵子收集要比间断性的采卵效率高，连续采卵会提高母牛的采卵数量与质量。 种公牛冻精的选择。先用提前鉴定的公牛精液与从屠宰场收集的卵子进行实验，用这种方法来判断精液是否可以成功受精，是否可以产生优质胚胎。这一步非常重要，因为人工授精良好的公牛精液不一定在体外受精时也表现良好。

活体采卵操作 卵丘-卵母细胞复合体 体外受精胚胎

4、提高移植受胎率的操作方案 （1）合理安排受体牛的移植程序 根据发情时间确定受体移植顺序。在进行大批量的胚胎移植时，需要根据受体牛发情、排卵时间的先后进行排序，发情、排卵早的先选，发情、排卵晚的后选，尽量缩小受体与供体的发情同步差，最长不超过±24小时。 根据胚胎的发育阶段选择受体。同一时间处理的供体牛，甚至同一供体牛，胚胎的发育阶段不尽相同，在选择受体牛时，还要根据胚胎的不同发育阶段和受体牛的不同发情、排卵时间灵活搭配，尽量缩短胚胎发育阶段和受体牛子宫环境的同步差。

（2）严格执行移植操作程序 移植胚胎时要严格遵守无菌操作规程，以防生殖道感染。移植枪在每次使用后要进行彻底清洗，干燥后用环氧乙烷气体消毒或干燥灭菌，在条件不具备时可在每次输精后清洗干净移植枪，使用前一定要用75%酒精彻底消毒，待酒精彻底挥发后再使用。 在移植胚胎时，切忌对受体牛子宫内膜造成损伤，使子宫内膜上皮脱落，甚至有出血发生。内膜上皮细胞、红细胞、白细胞等进入宫腔，反射性地引起子宫自净功能活动增强，胚胎会同组织碎片、各种细胞等一起被排出子宫；同时，进入宫腔的血液中，血清是有活性的，对胚胎也有毒害作用，因此受胎率肯定要大大降低；血凝块堵塞移植枪出口，可能会机械性地影响胚胎自移植枪进入子宫；若胚胎被凝固的血块包裹，会造成胚胎死亡。

（3）综合多种因素制订移植双胚的方案 为了降低胚胎移植受体牛的成本，提高胚胎移植的经济效益，在进行双胚移植时，要综合胚胎性控率、胚胎着床率、受体牛成本、胚胎价格等多种因素制订移植双胚的方案。 对于胚胎雌性控制率在90%以上的胚胎，不需考虑胚胎的着床率和受体牛的成本，都可以进行双胚移植。对于雌性控制率70%左右的胚胎，是否同时移植2枚，要根据胚胎的价格、受体牛的成本、胚胎着床率、公母犊的价格差别等因素来确定。对于遗传潜力非常好的牛，通过活体采卵生产的体外非性控胚胎，甚至也可以考虑进行双胚移植。

谢谢！