第22章 免疫学检测技术的基本原理 第一节 体外抗原抗体结合反应的特点及影响因素 第二节 检测抗原和抗体的体外试验 第三节 免疫细胞功能的测定

第一节 体外免疫反应的特点及影响因素※※ (一)抗原抗体反应的特点 高度特异性 特异性越强，亲和力也越高； 高度特异性 特异性越强，亲和力也越高； 表面化学基团之间的可逆结合 抗原抗体结合除了空间结构互补外，主要以氢键、静电引力、范德华力和疏水键等非共价结合。不如共价键稳定，易受温度、酸碱度和离子强度的影响而解离，解离后抗原抗体仍具有原有特性； 适宜的抗原抗体浓度和比例 决定抗原抗体结合后能否出现肉眼可见的反应； 抗原抗体反应的2个阶段 第1阶段是抗原抗体特异性结合，可在数秒钟至几分钟内完成；第2阶段是小的抗原抗体复合物靠正负电荷吸引形成较大复合物，所需时间从数分钟至数日不等。

(二)抗原抗体反应的影响因素 电解质 抗原抗体等电点分别为pH3-5和pH5-6，在中性或弱碱性条件下表面带有较多负电荷，适当浓度的电解质会使它们失去一部分负电荷而相互结合； 温度 通常为37℃，适当提高反应温度可增加抗原与抗体分子的碰撞机会，但56℃以上可使抗原或抗体变性失活； 酸碱度 抗原抗体反应的最适pH值在6-8之间，pH值过高或过低均可直接影响抗原抗体的理化性质。当pH值接近等电点时，抗原抗体多带正负电荷相等，由于自身吸引而出现凝集，导致非特异性反应。

第二节 检测抗原和抗体的体外实验 抗原抗体反应 凝集反应 间接凝集 直接凝集 沉淀反应 双向免疫扩散 单向免疫扩散 免疫比浊 免疫电泳 蛋白芯片技术 免疫标记 胶体金 免疫印迹 化学发光 同位素 酶 荧光

Ag-Ab反应的原理 特异性 亲和力和亲合力 结合力的表示方法 Ab Ag 高亲和力 低亲和力 低亲合力 高亲合力

Ag-Ab反应的可见性 Ab 过剩 Ag 过剩 比例适当，交联成网络

1.凝集反应 直接凝集反应 细菌、细胞等颗粒性Ag或表面包被抗原的颗粒状物质与相应Ab在电解质存在的情况下结合，出现肉眼可见的凝集团现象。 常用于菌种鉴定或ABO血型鉴定 玻片法 直接凝集反应 常用于检测抗体的滴度或效价，见于临床诊断伤寒或副伤寒所用的肥达氏反应和诊断布氏菌病所用的瑞特试验。 试管法 1:2稀释待测血清 1:4 1:8 1:16

间接凝集反应 将可溶性Ag/Ab先吸附在某些颗粒载体上，形成致敏颗粒，然后再与相应Ab/Ag进行反应产生凝集，叫间接凝集反应。如将溶血毒素O吸附于乳胶颗粒上的抗“O”试验、人IgG作为Ag吸附于乳胶颗粒上的类风湿因子检测。 凝集反应常用于溶血性疾病的诊断： Y Y + Y Y + Y 病人的RBC 体内anti-Rh 由于抗体多属于IgG，分子量较小，抗体与红细胞间的结合力不能克服细胞间的排斥力，不出现凝集 体外加入抗人IgG 出现凝集现象，叫直接库姆试验 Y + Y + Y 正常人O型血的Rh+的RBC 患者血清内的游离anti-Rh 体外加入抗人IgG 出现凝集现象，叫间接库姆试验

2.沉淀反应 毒素、组织浸液及血清中的蛋白等可溶性抗原与相应抗体反应后，出现肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。沉淀反应可在液体中进行，也可在半固体琼脂凝胶中进行。 Ag Ab in gel 单向免疫扩散 用于确定抗原浓度 免疫比浊 过量Ab Ab Ab Ab Ag1 Ab Ag2 Ag3 Ag4 双向免疫扩散 鉴定多种抗原是完全相同、部分相同或完全不同

沉淀反应—免疫电泳 存在于不同区域的抗原与抗体结合，在比例适宜处形成沉淀弧。沉淀弧的数量、位置和形状与标准品相对比，可分析样品的成分及其性质。

3.免疫标记技术 免疫酶测定法 免疫荧光技术 放射免疫测定法 免疫胶体金技术

①免疫酶测定法 夹心法ELISA 间接ELISA BAS—ELISA 利用生物素和抗生物素蛋白为桥梁 微粒捕获酶免疫分析技术 将已知特异性抗体致敏的免疫微粒与生物素、亲和素、酶相结合，最后酶作用于荧光底物发光，通过检测荧光强度判断未知抗原的含量。 a） b）

免疫组化技术 定位、定性、定量检测

②免疫荧光技术

③放射免疫测定 用放射性核素标记抗原或抗体进行的免疫测定。将同位素的敏感性与抗原抗体结合的特异性结合起来，具有重复性好、准确性高等优点，广泛应用于激素、药物等微量物质的检测。常用的有131I、125I。 ④化学发光免疫技术 将化学发光分析和免疫反应相结合而建立的一种新的免疫分析技术。最常用的发光物质是鲁米诺。 灵敏度高、简便、可实现自动化分析。

⑤免疫胶体金技术 用胶体金颗粒标记Ab/Ag，以检测未知Ag/Ab的方法。 氯金酸在还原剂作用下，可聚合成特定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液，因静电作用而呈稳定的胶体状态。 该技术可应用于免疫组化(光镜下检查)和免疫层析快速诊断。

⑥免疫印迹法-Western blotting

4.蛋白质芯片技术 又称为蛋白质微列阵，指固定于支持介质上的大量蛋白质构成的微列阵。根据蛋白质分子间特异性结合的原理，可实现快速、准确、高通量的检测。

第三节 免疫细胞功能的检测 淋巴细胞及其亚群的分离 免疫细胞 功能测定 磁珠分离法 T细胞功能测定 B细胞功能测定 细胞毒试验 吞噬功能测定 细胞因子检测 免疫吸附分离法 T细胞增殖试验 抗体含量测定 51Cr释放法 硝基蓝四氮唑试验 生物活性检测法 流式细胞术 迟发型超敏反应的检测 乳酸脱氢酶释放法 巨噬细胞吞噬试验 免疫学检测法 溶血空斑试验 肽—MHC四聚体技术 细胞染色法 凋亡细胞检测法

外周血单个核细胞的分离 稀释 血液 淋巴细胞分离液(葡聚糖-泛影葡胺r=1.078) 红细胞和 粒细胞 血浆 单 个核细胞 离心 单 个核细胞 (PBMC，包括淋巴细胞、DC和NK) 红细胞和 粒细胞 血浆

淋巴细胞及其亚群的分离 免疫吸附分离法 磁珠分离法 流式细胞术 肽—MHC四聚体技术

免疫吸附分离法 anti-CD4 加入淋巴 细胞悬液 弃上清

磁珠分离法

流式细胞术 荧光抗体标记混合细胞 喷嘴 细胞分选器 单细胞悬液 5000-10000个/秒 荧光 检测器

抗原肽-MHC四聚体分离技术 抗原肽 亲和素 非肽特异性CD8T 肽特异性CD8T anti-CD8 CD4T及B 肽-四聚体 MHC I 生物素 亲和素 荧光素 非肽特异性CD8T anti-CD8 肽-四聚体 肽特异性CD8T CD4T及B

二、免疫细胞功能的测定 T细胞功能测定 B细胞功能测定 细胞毒试验 吞噬功能测定 细胞因子检测 T细胞增殖试验 抗体含量测定 溶血空斑试验 51Cr释放法 硝基蓝四氮唑试验 生物活性检测法 迟发型超敏反应的检测 乳酸脱氢酶释放法 巨噬细胞吞噬试验 免疫学检测法 溶血空斑试验 细胞染色法 凋亡细胞检测法

T细胞受到特异性抗原或有丝分裂原刺激后发生增殖，可通过以下三种方法检测： 形态计数法：活化细胞体积增大、形态不规则、胞质增多、细胞核松散及出现较多核仁； 3H-TdR或125I-UdR掺入法：3H-TdR能掺入到合成的DNA中，用液体闪烁仪检测样品的放射活性，特点是灵敏可靠，但须特殊仪器，易有放射性污染。 MTT (四甲基偶氮唑盐)比色法： T细胞增殖试验 迟发型超敏反应的检测 外来抗原刺激机体产生免疫应答后，再用相同的抗原作皮试，可导致迟发型超敏反应，T细胞活化并释放多种细胞因子，产生以单个核细胞浸润为主的炎症，局部发生充血渗出，24-48h发生，72h到达高峰。阳性反应表现为局部红肿和硬结，反应强烈的发生水肿甚至坏死。细胞免疫正常者出现阳性反应，细胞免疫低下者呈弱阳性或阴性反应。常用于检测某些微生物感染。

可通过单项琼脂扩散法、ELISA、速率比浊法等测定标本中各类Ig的含量。 B细胞功能测定 抗体含量测定 可通过单项琼脂扩散法、ELISA、速率比浊法等测定标本中各类Ig的含量。 溶血空斑试验 4天后取出动物脾脏，在脾细胞悬液中含有抗SRBC的浆细胞 绵羊红细胞(SRB C)免疫动物 脾细胞与SRBC在适量琼脂糖液中混匀 加入新鲜补体，倒入平皿中培养 在抗体形成细胞周围出现溶解的透明区，即溶血空斑。1个空斑区代表1个浆细胞 通过记录溶血空斑的数目可知抗原特异性B细胞的数目

靶细胞被杀伤后，向体系中加入台盼兰，可进入膜破损的细胞内，将细胞染成蓝色。活细胞拒染而不着色。 细胞染色法 细胞毒试验 51Cr释放法 乳酸脱氢酶释放法 靶细胞被杀伤后，向体系中加入台盼兰，可进入膜破损的细胞内，将细胞染成蓝色。活细胞拒染而不着色。 细胞染色法

琼脂糖电泳法 TUNEL法 凋亡早期 凋亡晚期 坏死期 流式细胞术 Annexin V PI 凋亡细胞检测法 在细胞中加入末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)和生物素标记的核苷酸 TdT能在游离的DNA3’端缺口连接标记的核苷酸 加入亲和素-酶复合物，在DNA断裂处显色 正常细胞基因组DNA 凋亡细胞 凋亡早期 凋亡晚期 坏死期 流式细胞术 Annexin V PI

将待测mf与鸡红细胞混合温育后，鸡红细胞被mf吞噬，根据吞噬百分率确定mf吞噬能力。 吞噬功能测定 NBT在杀菌过程中产生反应性氧中间物，其中超氧阴离子能使被吞噬进细胞内的NBT还原成不溶性蓝黑色甲臜颗粒，沉积于胞浆中。光镜下计数NBT阳性细胞可反映PMN的杀伤功能。 硝基蓝四氮唑(NBT)试验 巨噬细胞吞噬试验 将待测mf与鸡红细胞混合温育后，鸡红细胞被mf吞噬，根据吞噬百分率确定mf吞噬能力。 吞噬百分率=吞有红细胞的mf/mf总数

荧光素标记抗体染胞内细胞因子，FACS分析 细胞因子检测 细胞增殖或增殖抑制法，如细胞因子依赖性或抑制性细胞株 生物活性检测法 细胞病变抑制法，如感干扰素抑制病毒感染性细胞损伤 夹心ELISA或ELISPOT 免疫学检测法 荧光素标记抗体染胞内细胞因子，FACS分析

酶联免疫斑点试验-ELISpot 检测B细胞产生的抗体 检测T细胞产生的CK

谢谢！