第六章 动物人工繁殖

为什么要进行动物人工繁殖？ 大熊猫是我国的国宝，是国家一级保护动物，系濒危物种。 野外大熊猫到了圈养环境中繁殖率非常低，78%的雌性大熊猫不孕，90%的雄性大熊猫不育。 我国20世纪末实行了大熊猫人工繁殖计划。

“水中大熊猫”是什么？ 中华鲟是中国特有的古老珍稀鱼类和世界现存鱼类中最原始的种类之一，距今有一亿四千万年的历史，被誉为“活化石”和“长江鱼王”。 具有溯河洄游的习性。每年7—8月，黄海、东海的成体，溯江而上，到上游的宜宾一带产卵繁殖后代。 葛洲坝、三峡大坝阻断了洄游路线。

对于人类，世界范围内不孕夫妇占10％左右，需要建立人工助孕技术。 “试管婴儿之父”获诺贝尔 生理学或医学奖

动物人工繁殖的技术方法

主要内容： 体外受精动物（试管动物、试管婴儿） 核移植动物（克隆动物） 关键问题： 体外受精动物的培育：精子获能与卵细胞成熟培养、体外受精方法、性别控制的原理与方法 核移植动物的培育：核移植、重组胚的激活

第一节 体外受精

一、定义 体外受精：将哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中（温度、湿度、气体、渗透压、酸碱度等）完成受精过程的技术。 体外受精动物：也称试管动物，是指将供体的精子和卵子在体外受精，体外培养胚胎发育到一定阶段通过胚胎移植移入受体完成发育出生的动物。 与人工授精的区别

世界上首批试管动物 1959年，张明觉以家兔为实验材料，从一只交配后12h的母兔子宫中冲取精子(即体内获能的精子)，从另外两只超数排卵处理母兔的输卵管中收集卵子，精子和卵子在体外人工配制的溶液中完成受精过程。然后，正常卵裂的36枚胚胎被移植到6只受体的输卵管中，其中4只妊娠，并产下15只健康仔兔，这是世界上首批试管动物。它们的正常发育标志着体外受精技术的建立。

二、意义 发挥优良母畜的繁殖潜力 促进家畜改良的速度 保存遗传资源

三、知识回顾

受精1天后才开始卵裂。 8细胞之前，分裂球之间结合比较松散。 接形成致密的球体16细胞期，内部1-2个细胞属于内细胞团，将来发育为胚胎，而其外周细胞变为滋养细胞。 动物的胚胎在64细胞以前为实心体，称为桑椹胚。 继续分裂成由100多个细胞组成的早期胚泡。细胞团内部空隙扩大，成为充满液体的囊胚腔，此时的胚胎称为囊胚。囊胚的大小仍和受精卵相似，但细胞已经增殖到上千个。

四、试管动物培育流程 （1）精子采集与体外获能、卵子采集与成熟培养 （2）体外受精 （3）胚胎体外培养 （4）胚胎移植：是指将受精卵或发育到一定阶段的胚胎移植到与供体同时发情排卵、但未经配种的“受体”母畜输卵管或子宫的技术 （5）体内发育、出生

1、精子的采集与体外获能处理 采集：精子上游法采集，在精液上面加入少量培养液，有活力的精子游到表面，收集。 精子获能：指精子获得穿透卵子透明带能力的过程。 精子的顶体反应：遇到卵子时，精子头部“顶体”脱落，顶体酶释放，使卵子的放射冠和透明带溶解，精子进入卵细胞，达到受精的目的。

精子获能：是精子获得穿透卵子透明带能力的生理过程，是精子在受精前必须经历的一个重要阶段，在生育上具有重要的意义。

体内获能： 雄性精液中含有“去能因子”（大多为糖蛋白），附在精子表面，是顶体酶的抑制剂，抑制了精子的受精能力。 “去能因子”的清除主要依靠宫颈、子宫及输卵管液中的β-淀粉酶、胰蛋白酶、 β-葡糖苷酶、唾液酸酶等，水解糖蛋白等“去能因子”，使精子顶体酶活性恢复，具有受精能力。

体外获能： 1951年，美籍华人张明觉和澳大利亚人Austin同时发现了哺乳动物的精子获能现象。 20世纪60年代初至20世纪80年代中期，人们以家兔、小鼠和大鼠等为实验材料，进行了大量基础研究，在精子获能机理和获能方法方面取得很大进展。

人工使精子获能有两种方法： 培养法：是用人工配制的获能液 化学诱导法：是用一定浓度的肝素或钙离子载体诱导

2、卵子的采集与成熟培养 采集方法： 离体卵巢采卵：是从屠宰母畜的卵巢采集 活体采卵：从活母畜的卵巢采集卵母细胞（优良品种） 需要对卵母细胞进行选择 超数排卵：人为注射外源促性腺激素，促使卵巢排出较正常情况下更多的成熟卵子。

B超活体采卵

成熟培养：卵母细胞需要在体外培养成熟才能进行受精。 培养液：氨基酸、维生素、激素、供能物质、大分子营养物质等。 常用：TCM199培养基，添加孕牛血清、促性腺激素、雌激素、抗生素等。

温度和气相： 牛、猪、羊和马等家畜一般为38～39； 要求在含5％C02的空气，100%相对湿度。 培养时间： 牛、羊：一般为22～24h； 马为30～36h； 猪为40～44h。

3、体外受精 精子发生顶体反应时，精子顶体外膜与其相贴的卵细胞膜发生多点融合而破裂，继而出现小孔。 顶体酶就是通过这些小孔释放出去，使卵细胞周围的卵丘细胞分散并去除放射冠，分解透明带。 精子顶体内膜与卵细胞膜相互融合，最终雄性原核和雌性原核合二为一，完成受精过程。

几个精子同时分解透明带，但只有一个精子能穿过透明带进入卵子内，当第一个精子进入后，透明带的穿透性就立即发生变化，从而阻止其他精子穿越透明带。 充满活力的精子

精子试图进入卵子 经过种种障碍的精子终于与卵子相遇 精子的头进入卵子

受精后8天。分裂发育为几百个细胞。

共同培养：一般将成熟的卵母细胞和获能的精子在一个合适的体外环境条件下共同培养一段时间，就能完成体外受精。 受精过程所采用的培养液与动物细胞培养用培养液类似，但需添加一些特殊物质，如肾上腺素、亚牛黄酸、肝素等，它们有助于精子穿卵和促使原核的形成。

精子和卵子常在小滴中共培养，每滴大约10万个精子，2-3个卵细胞，放入5% CO2，37℃培养箱进行培养。 受精成功观察：将含有受精卵的培养皿放置于倒置显微镜下，卵细胞内出现两个雌雄原核，标志着受精成功。

体外受精方法： 卵浆内精子注射法：用微注射器将单个精子直接注射入卵子内。 该技术可排除透明带甚至质膜对精子入卵的阻碍作用，故对精子的死活及其完整性无严格要求，因此，该技术对动物受精机理研究、男性不育的治疗以及野生动物保护等方面具有重大意义。

4、受精卵的体外培养 受精卵需在体外培养发育至桑椹期或囊胚期才能进行移植。目前人们还不能在体外模拟子宫内的环境供胚胎继续发育。通常情况下，移植的较佳时期是发育至8-16细胞期的胚胎。 培养液成分：水、无机盐、有机盐、维生素、氨基酸、激素、核苷酸、血清等

发育阻滞：体外受精的早期胚胎在体外发育中，往往会停止在某一阶段不再发育，这种现象称为发育阻滞。 是胚胎体外培养的主要障碍。 形成原因复杂。

5、胚胎移植 将胚胎移植到另外一头与供体同时发情排卵、但未经配种的母畜（称为“受体”）的相应部位（输卵管或子宫角）。 这个来自供体的胚胎能够在受体的子宫着床，并继续生长和发育，最后产下供体的后代。这就是通常所说的“借腹怀胎”。 可采用手术法（羊、兔等小动物），也可采用非手术法（牛、马等大动物）。

手术法:将同期化处理后的受体动物仰面固定在手术床上，全身麻醉，腹部切口，将一侧卵巢上有黄体发育的子宫远端拉出，将吸有胚胎的胚胎移植管插入穿刺孔，小心将胚胎输入。这种方法移卵容易、损伤小、成功率较高。 非手术法:使用类似于人工授精的专用输胚枪，将其直接插入排卵侧子宫角内，注入胚胎。

6、体内发育、出生 胚胎移植后处理与观察：胚胎移植后需补充黄体酮，目前多采用注射法给予黄体酮。 胚胎移植后14天，可由验尿或抽血确定是否妊娠。

三、试管婴儿 精子与卵子在体外受精，培养发育成早期胚胎，再植回受体子宫内发育出生的婴儿。 1978年，世界首例试管婴儿在英国诞生

1980年6月澳大利亚首例试管婴儿诞生； 1981年12月美国首例试管婴儿诞生； 1983年10月日本首例试管婴儿诞生； 1985年4月我国台湾首例试管婴儿诞生； 1986年12月我国香港首例试管婴儿诞生。 1988年3月10日,我国大陆第1例试管婴儿诞生于北京医科大学第三附属医院妇产科,其创始人为张丽珠教授。

1988年3月，北大第三医院张丽珠教授怀抱着刚刚降生的试管婴儿

试管婴儿技术的发展： 根据各种技术出现的时间次序，可分为常规试管婴儿、单精子注射技术、胚胎遗传病诊断技术、卵浆置换技术。 这些技术无优劣之分，均有各自的适应症。

第一代试管婴儿（即常规试管婴儿）： 从女性体内取出卵子,于器皿内培养后,加入经处理的精子,待卵子受精后,继续培养,至分裂为2～8-cells时,再转移到妇女子宫内着床、发育成胎儿、分娩。

主要针对女性因素所致的不孕问题。各种原因导致的输卵管不通或功能障碍（输卵管切除、输卵管阻塞、盆腔严重粘连及输卵管结扎再通术手术失败等）； 排卵障碍； 子宫内膜异位症； 男方少、弱精子症；不明原因的不育； 免疫性不孕。

第二代试管婴儿： （1）在显微操作仪下，将整个精子或精子的头部注射到卵母细胞质内，完成受精； （2）在显微操作仪下，用注射针将一个或多个精子直接注入到透明带下卵周隙中使之受精妊娠，排除了由于透明带或卵质膜所形成的受精障碍。 解决因男方输精管堵塞、损伤、弱精、少精等因素造成的不育者。

第三代试管婴儿（胚胎移植前遗传学诊断技术） 指在胚胎移植前，取胚胎的遗传物质进行分析，诊断是否有异常，筛选健康胚胎移植，防止遗传病传递的方法。

案例： 如果夫妇双方都携带遗传病基因，如地中海贫血，那么试管里孕育的可能就是个带病的孩子。按照之前的技术手段，只能让女方先怀孕，在怀孕7--8周和4--6个月这两个阶段，分别抽取绒毛和羊水来检测胎儿是否健康，如果不健康则选择引产，这样会对女性身体造成很大的伤害。

夫妻双方都是地贫基因携带者，那么有1/4的几率生出重症地贫的孩子，同时也有1/4的几率生出健康的孩子。此时要做的就是通过技术手段挑出这“健康的1/4”。 正常怀孕的妇女体内只有一个胚胎，可是通过试管婴儿技术，能一次产生多个胚胎。在胚胎发育的第三天，医务人员会从每个胚胎中都挑出一个细胞来进行检测，选出健康的那个胚胎，再移植到女性的体内。

主要技术环节： （1）超数排卵 （2）精子体外获能处理； （3）卵子采集及成熟培养； （4）卵子与精子的体外受精； （5）受精卵的体外培养； （6）试管胚胎的移植。

超数排卵： 雌性动物卵巢上拥有数万个卵母细胞，待出生后卵细胞数量就不再增加。不断退化，消失，自然排卵只占极少一部分。

人超排所用的外源激素： 促卵泡素（FSH）：负责卵泡的生长发育 ； 雌激素（E2）：刺激垂体，增加LH分泌； 促黄体素（LH）：在和少量的FSH的协同作用下，引发排卵。 孕酮（P4）：一方面抑制卵泡发育，同时刺激子宫内膜生长，为胚胎着床和维持妊娠作准备。

孕马血清促性腺激素(PMSG):一种糖蛋白激素，功能类似于FSH和LH的综合作用，可有效引起卵巢中多个卵泡同时发育并成熟、排卵。 人绒毛膜促性腺激素（hCG）: 主要功能是促进排卵黄体转变为妊娠黄体。

第二节 人工授精

将采集的精子注入发情处理的母体内完成受精过程。 意义： 提高优良种公畜的价值，充分发挥其生殖潜力； 加速品种改良； 减少饲养头数，降低饲养成本； 防止疾病传播；提高母畜受胎率……

思考： 人工授精动物与体外受精动物有什么区别？

三、细胞核移植 概念：将一种动物的细胞核，移入到一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，该胚胎最终发育成完整的动物个体。 利用核移植技术得到的动物称为克隆动物。 注 核 重组细胞 去 核

哺乳动物核移植的类型 胚胎细胞核移植 较容易 体细胞核移植 较困难

早期胚胎细胞具有全能性。 胚胎细胞核移植技术： 使用的核供体细胞来自胚胎细胞； 在动物克隆、细胞治疗、组织工程、发育生物学等领域的研究与应用中具有重要作用。

体细胞核移植技术： 用哺乳动物特定发育阶段的成体细胞作为核供体，不经过有性繁殖过程，进行体外重构，并通过重构胚胎的胚胎移植，从而达到繁殖同基因型个体。

降低培养液中的血清浓度（10% 0.5%），使培养细胞因缺乏血清生长因子而不能分裂，停在休止期（G0），过一定时间后再加入血清，细胞就开始同步生长分裂了 。

第一步 取妊娠期的6岁母绵羊（Finn Dorset白品种母羊）的乳腺细胞作核供体细胞，用血清饥饿法使其与供体卵细胞处于同种发育状态。

第二步 　　注射促性腺激素，促使母羊（苏格兰黑面母绵羊）排卵，28--33小时取其未受精卵，快速去核，放入10%FCS（胎牛血清 ）、1%FCS和0.5%FCS连续5天，使其进入G0期做受体细胞。 卵母细胞的细胞质中含有某种特定的因子，可以使移植核中所含有的基因表达程序发生重新排列，使已经分化了的细胞重新回到分化过程的起点，同受精卵一样开始个体发育过程。

第三步 　　乳腺细胞与无核卵放入同一培养皿中，在微电流的作用下，将乳腺细胞融入卵中，形成一个含有新的遗传物质的卵细胞。

第四步 　　新的卵细胞植入羊的结扎的输卵管内，6天后发育为桑椹胚或囊胚（8--16个细胞）。

第五步 　　将此早期胚胎移入假孕母羊子宫中，产下多利，即为6岁母羊的复制品，也为白色。

生物学意义： 它证明了一个已经完全分化了的动物体细胞仍然保持着当初胚胎细胞的全部遗传信息，并且经此技术处理后，体细胞恢复了失去的全能性形成完整个体。

多利是世界上首例利用成年哺乳动物体细胞作为供体细胞繁殖的克隆羊，即成体母羊的复制品。它的成功提示我们：在培育体细胞成为核供体之前，利用“基因靶”技术精确地诱发核基因的遗传改变或精确地植入目的基因，再用选择技术准确地挑选那些产生了令人满意变化的细胞作为核供体，从而生产出基因克隆体。也就是说，我们可以按照人的意志去改选、生产物种。

克隆技术存在的问题 理论问题： 分化的体细胞克隆对遗传物质重编（细胞核内所有或大部分基因关闭，细胞重新恢复全能性的过程）的机理还不清楚； 克隆动物是否会记住供体细胞的年龄。 克隆动物的连续后代是否会累积突变基因。

实践问题： 克隆动物的成功率还很低； 生出的部分个体表现出生 理或免疫缺限； 即使是正常发育的“多莉” 也被发现有早衰迹象。

伦理道德问题 我是谁？

动物克隆技术的应用： 生物医药方面 利用转基因动物生产一些用途广泛且昂贵的药物，如α-1抗胰蛋白酶、血清白蛋白、抗凝血酶等，若通过无性繁殖技术使这些转基因动物进行繁衍，其经济意义将是不可估量的。

医学方面 可培育出为人类器官移植提供来源的特殊动物品种，甚至直接克隆出人体心、肝、肾、耳等组织器官，供临床使用，这样可避免异体器官移植可能出现的排斥反应。

畜牧业方面 可以选育遗传性状稳定的良种家畜，不仅省时省力，而且还加快了繁殖速度。 物种保存方面 有利于保存和发展具有优良性状的动物品种，挽救濒危珍稀野生动物，维持生态平衡。

医学上运用

四、胚胎分割 采用机械方法将早期胚胎切割成2等份,4等份或8等份等,经移植获得同卵双胎或多胎的技术。 优势:可成倍增加胚胎数量

微注射到山羊的ESC α-抗胰蛋白酶基因 羊奶 冻干机 α-抗胰蛋白酶 胚胎 分割 提高了1400倍 从转基因山羊的羊奶中提取α-抗胰蛋白酶药物.每升羊奶可提取35克.如原来用生物提取的方法,每公斤原料只能生产0.1克，此提高了350倍.

原理： 大多数哺乳动物的胚胎在发育早期，去掉一个早期胚胎的一半,剩余的部分仍可以发育为一个完整的胚胎。 对小鼠胚胎分割的实验认为,在32细胞期的胚胎仍具有调整能力,但到64细胞期的胚胎就逐渐失去这种能力。

胚胎分割操作流程 胚胎获取 手术法：开腹从输卵管中获取2--8细胞期胚胎 非手术法：经阴道、宫颈插管，从宫腔内冲洗晚期胚胎 胚胎分割 分割胚的培养 体外培养 体内培养 分离胚的移植 胚胎分割操作流程

注意：要将内细胞团均等分割，若不均等分割会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。

来自同一胚胎的后代具有相同的遗传物质，因此，胚胎分割技术可以看做是无性繁殖或克隆。 .分割多图

五、性别控制 人为干预并按人们的愿望使雌性动物繁殖出所需性别后代的一种繁殖新技术。 受精之前：通过在体外对精子进行干预 受精之后：通过对胚胎性别鉴定

动物性别控制的意义：育种、商品生产 对人类来说,通过精子性别的选择,可以避免怀孕一个与X相关隐性遗传疾病的婴儿.而与X相关的隐性疾病至今已有370多种。

小结