第六章 胚胎工程 “世界山羊之王” 波尔山羊

学习要求 要求：了解动物胚胎发育的基本过程和机制；系统了解体外受精，胚胎移植技术，胚胎分割技术，早期胚胎的体外培养，胚胎冷冻保存技术和动物的性别控制等工程技术。 重点：体外受精，胚胎移植技术，胚胎分割技术，早期胚胎的体外培养，胚胎冷冻保存技术和动物的性别控制 难点：胚胎发育的基本过程与机制

主要内容 6.1胚胎发育的基本过程与机制(自习） 6.2体外受精 6.3胚胎移植技术 6.4胚胎分割技术 6.5早期胚胎的体外培养 6.6胚胎冷冻保存技术 6.7动物的性别控制

胚胎工程 胚胎工程（embryo engineering）是指对配子和胚胎进行人为地干预，使其环境因素、发育模式或局部组织功能发生量和质的变化的综合技术。

胚胎工程在胚胎移植技术上发展起来的现代生物技术，主要包括体外受精，胚胎移植，胚胎分割，早期胚胎的体外培养，胚胎冷冻保存和性别控制等工程技术。

受精（顶体反应、多精受精的阻断、卵子的激活） 胚胎工程理论基础 精子成熟、获能 卵泡成熟、排卵 受精卵卵裂（桑椹胚、囊胚） 着 床 受精（顶体反应、多精受精的阻断、卵子的激活） 妊娠（胚胎发育） 分 娩 哺 乳

意义 1）发挥优良母畜的繁殖潜力,增加优良品种的数量 。 2）保存遗传资源 （对优良母畜或稀有哺乳动物有计划地保存胚胎，建立起“胚胎库” 。）

6.1胚胎发育的基本过程与机制 发育包括个体和系统发育。 个体发育：多细胞生物从单细胞受精卵到成体经历的一系列有序的发展变化过程。 系统发育：也称系统发展，是与个体发育相对而言的，它是指某一个类群的形成和发展过程。

但是胚胎的发育依然拥有相似的过程，能够分成受精、卵裂、（桑葚胚） 、囊胚、原肠胚、中胚层及体腔形成，胚层分化与器官形成等阶段。 动物的种类繁多，发育过程复杂； 但是胚胎的发育依然拥有相似的过程，能够分成受精、卵裂、（桑葚胚） 、囊胚、原肠胚、中胚层及体腔形成，胚层分化与器官形成等阶段。 受 精 卵 卵 裂 桑 葚 胚 囊 胚 原 肠 胚 胚 层 分 化 器 官 形 成 成 体

受精卵--囊胚--原肠胚--组织器官--幼体--性成熟--个体 6.1.1 胚胎发育的基本过程 受精卵--囊胚--原肠胚--组织器官--幼体--性成熟--个体 胚胎发育 胚后发育

1、生殖细胞的发生 （1）卵细胞内的生殖质决定生殖细胞的发育命运。 生殖质(germinal plasm): 卵母细胞中决定胚胎细胞分化成生殖细胞的细胞质成分。 在卵子发生中形成的一种特殊的细胞质成分；这种成分分布在卵或胚胎的一定部位，含有这种成分的细胞将发育为原始生殖细胞，再由它产生出生殖母细胞。

(2)生殖细胞向生殖腺的迁移 生殖细胞在生殖腺以外的地方先发育，然后进入生殖腺。 在生殖腺，生殖细胞经过有丝分裂而增殖，而后减数分裂分化为成熟的性细胞（精子，卵子）。

（3）生殖细胞的分化 卵子发生 ：由原始生殖细胞发育成卵原细胞，再由卵原细胞发育为成熟卵子的整个过程。 卵母细胞在发育过程 中具有显著的不对称 性。卵母细胞的一端 称为植物极(vegetal pole),相反的一端称 为动物极。 卵母细胞的减数分裂 是高度不对称的，最 后产生一个成熟的卵 细胞和三个极体 (polar body)。

精子发生 精子发生：由 精原细胞经 初级精母细胞、 次级精母细胞、 精细胞至成熟精子形成的过程。

2. 受精 受精(fertilization)是卵子和精子融合为一个合子的过程。它是有性生殖的基本特征，普遍存在于动植物界，但人们通常提到最多的是指的动物。

（1）精子成熟与获能 精子成熟：最初生成的精子，并不具有运动与受精能力，需经过一段时间的继续发育才能与卵子结合受精。 精子获能：是指精子获得穿透卵子透明带能力的生理过程，是精子在 受精前必须经历的一个 重要阶段。

（2）卵子成熟与排放 卵子成熟(oocyte maturation)卵母细胞成为卵子的过程。即卵母细胞受内外源因子的刺激,经历一系列变化, 成为具有接纳精子,进行雌雄两性原核结合，以及发育为正常个体等能力的功能卵的过程. 在卵子成熟过程中,卵母细胞完成分化,并具备了受 精后正常发育所必需的物质和信息贮备. 卵子排放：动物的卵或卵母细胞从成熟卵巢滤泡中排出的过程。

（3）顶体反应 顶体是覆盖于精子头部细胞核前方、介于核与质膜间的囊状细胞器。 顶体内的结合素（卵结合蛋白，bindin）可识别特异的糖基序列，以保证精子与卵的种特异性结合。顶体中含有顶体酶系统，有助于精子穿过卵的外围结构和精核入卵。

顶体反应：精子释放顶体酶熔蚀放射冠和透明带的过程。 顶体反应是受精的先决条件。

（4）多精受精的阻断 有两种机制保证了只有一个精子与卵细胞融合： 机制一是卵细胞质膜的快速去极化，这是由第一个精子与卵细胞融合引起的，这样可快速阻止其它精子与卵细胞的融合，这一反应称为多精受精的一级阻断。 实验证明，多精受精作用的阻断是由卵细胞的膜电位的改变引起的。

机制二是卵细胞的皮层反应。当精细胞与卵细胞的细胞质膜融合时，激活了卵细胞的磷脂酰肌醇信号转导途径，引起卵细胞局部胞质溶胶中Ca2+浓度的升高，导致定位于卵细胞质外周的皮层颗粒与卵细胞质膜融合释放内含物（酶类）；释放的酶类快速分布到整个卵细胞的表面，改变透明带的结构，使之变得“坚硬”，这样，精子就不能与卵细胞结合，从而提供了一种缓慢的二级多精受精的阻断作用。

（5）卵子的激活 卵子受到精子的刺激后，即发生一系列的生化反应，称卵子的激活(eggactivation)。 次级卵母细胞完成第二次成熟分裂 雌、雄原核形成 雌、雄原核融合 受精卵形成

3.卵裂 卵裂（cleavage）：受精卵经过多次连续迅速的细胞分裂，形成许多小细胞的发育过程。每次卵裂产生的子细胞称卵裂球（blastomeres）。 卵裂可分为两大类型：完全卵裂和不完全卵裂。 完全卵裂：卵裂面将受精卵完全分开，卵裂球大小相差不多 。 不完全卵裂：多黄卵进行这种卵裂，由于卵含大量卵黄，卵裂面不能通过整个卵，卵裂仅在卵的细胞质部分进行。

二细胞期 四细胞期 八细胞期 桑椹胚 早期胚泡 晚期胚泡 内细胞团 滋养层

4.囊胚 经过卵裂，受精卵被分割成很多小细胞（卵裂球），这些由小细胞组成的中空球形体称为囊胚。 囊胚的中间空间叫做囊胚腔； 囊胚腔其周围的细胞称为囊胚层

5.原肠胚 由原始的单胚层细胞发展成具有双层或三层胚层结构的胚胎，称为原肠胚（或神经胚）。 原肠胚是由囊胚细胞迁移、转变形成的，它由三层细胞层构成：外胚层(ectoderm)、中胚层(mesoderm)、内胚层(endoderm)。 原肠胚的特点可以概括为“一孔、二腔、三胚层”。 “一孔”指的是胚孔；“二腔”指的是缩小了的囊胚腔和新形成的原肠腔；“三胚层”指的是外胚层、中胚层和内胚层。

原肠胚的形成方式 原肠胚形成在各类动物有所不同，形成的方式有：内陷、内移、内转、分层、外包。

6. 中胚层和体腔 中胚层（mesoderm）指在三胚层动物的胚胎发育过程中，（原肠胚末期）处在外胚层和内胚层之间的细胞层。 中胚层发育为躯体的真皮、肌肉、骨骼及其他结缔组织和循环系统，包括心脏、血管、骨髓、淋巴结、淋巴管等；体腔末、内脏的浆膜和系膜，以及内脏中结缔组织、血管和平滑肌等；肾脏、输尿道、生殖腺（不包括生殖细胞）、生殖管和肾上腺的皮质部。

体腔 由动物的中胚层分离出脏壁和体壁，脏壁和体壁之间形成的空腔为体腔。

7. 胚层分化 三胚层形成之后，动物体的组织和器官开始分化。 胚胎发育中三个胚层的变化以内胚层最为简单，中胚层最为复杂，而外胚层则最为特异。

内胚层分化为消化管的大部分上皮，肝、胰、呼吸器官，排泄器官和生殖器官的一部分； 中胚层分化为肌肉，结缔组织、生殖和排泄器官的大部分； 外胚层分化为皮肤上皮，包括皮肤腺和其他皮肤衍生物，神经组织、感觉器官和消化管的两端。

6.1.2 胚胎发育的基本机制 胚胎发育变化中，细胞基因的表达起决定作用，并受内外环境因素的影响。胚胎发育机理是现代发育生物学中重大的研究课题。

1.细胞分裂 通常包括细胞核分裂和细胞质分裂两步。 细胞分裂是胚胎发育的基础，其余的发育机制都在细胞分裂过程中完成。

2.细胞分化 细胞分化（cell differentiation）是指幼稚细胞发育为具有某些特殊结构和功能的过程。 它是胚胎发育的中心问题。胚胎通过细胞分化形成不同的细胞类型。

（1）细胞分化是基因差异表达的结果 发育程序是基因程序的时空性选择表达程序。 在胚胎发育过程中，通过细胞间互作和选择性基因活化，不同部位的细胞获得各自不同的发育程序。 发育机制不等同于基因表达调控，还受到其它调控因子的影响。

（2）诱导可使细胞产生分化 诱导：发育过程中，胞外或者胞间信号可影响另一部分细胞的发育。 胞外信号可影响细胞的基因表达模式，进而导致细胞分化。

类固醇激素的作用机制——基因表达学说。 类固醇激素的分子质量较小，且是脂溶性的，可通过扩散或载体转运进入靶细胞，激素进入细胞后先与胞浆内的受体结合，形成激素－受体复合物，此复合物在适宜的温度和Ca2+参与下，发生变构获得透过核膜的能力。激素进入核内后，与核内受体结合形成复合物。此复合物结合在染色质的非组蛋白的特异位点上，启动或抑制该部位的DNA转录过程，进而促进或抑制mRNA?的形成，结果诱导或减少某些蛋白质(主要是酶)的合成，实现其生物效应。一个激素分子可生成几千个蛋白质分子，从而实现激素的放大功能。

（3）胚胎细胞命运的决定 决定：细胞内部状态的稳定变化以及基因活动模式的转变。 细胞命运的决定状态对细胞发育很重要。 细胞命运的决定受到环境因素以及其它细胞类型的影响。 随着细胞发育进程的推进，细胞的决定程度减小，细胞发育潜力受限增加。

基因表达的改变限制或者固定了细胞命运的决定，也即限制了细胞的发育潜力 调整型和镶嵌型胚胎 调整型：胚胎的细胞分化潜力远大于其正常命运。例如，脊椎动物； 镶嵌型：胚胎的细胞分化潜力远小于其正常命运。例如，软体动物，环节动物等

　细胞质中决定细胞命运的特殊信号物质称为决定子（determinant）。是执行位置信息的信号分子，广泛存在于各种动物的卵子胞质中。 细胞质的决定子的区域化和细胞的非对称型分裂导致细胞分化；

3. 模式形成 胚胎发育中，细胞按照一定的时空模式，在个体中精确有序地发育形成各种结构的过程 。 不同生物在不同的发育阶段具有不同的模式形成机制。 模式形成首先要建立胚胎主轴，然后决定个体的其他结构； 模式形成还包括细胞在不同胚层的分配。

4.形态发生 形态发生运动包括原肠形成和器官原基形成。 原肠形成是最剧烈的形态发生时期，所有的三胚层胚胎均发生。 形态发生是多细胞协调获得的结果，如细胞状态改变、胞间信号转导、细胞运动、细胞增殖、细胞凋亡等。 例如：手指的形成依赖于细胞凋亡。

5.生长 胚胎发育早期，细胞生长较少；中后期细胞生长加快，通过细胞增殖、细胞体积增大和胞外物质积累等实现。 细胞生长的差异导致组织器官的生长差异最终产生个体整体外形差异。

说明 上述5种发育作用并非独立。 一般认为，胚胎早期发育的模式形成导致胚胎形态的改变、细胞分化和生长。 实际的胚胎发育系统中，事件的发生顺序会有改变。

6.2 体外受精 体外受精(In Vitro Fertilization， IVF)或（external fertilization）是指哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。 基本原理：人工模拟体内环境，使初级卵母细胞成熟，使精子获能，完成受精。

受精（顶体反应、多精受精的阻断、卵子的激活） 胚胎工程理论基础 精子成熟、获能 卵泡成熟、排卵 受精卵卵裂（桑椹胚、囊胚） 着 床 受精（顶体反应、多精受精的阻断、卵子的激活） 妊娠（胚胎发育） 分 娩 哺 乳

意义：体外受精技术不仅应用于畜牧生产，同时也成为研究其他胚胎生物技术，如克隆、转基因、胚胎干细胞分离培养和性别控制等的重要辅助手段。

6.2.1 体外受精的研究历史 精子获能的发现开创体外受精的突破； 在小动物的精子获能方法和机制上新进展，试管动物相继产生； 1978年，试管婴儿诞生

1988年3月10日8时56分，中国首例试管婴儿在北京诞生。 1988年3月，北大第三医院张丽珠教授怀抱着刚刚降生的试管婴儿小萌珠 孩童 1990年3月，满两周岁的试管婴儿郑萌珠（中）和妈妈、爸爸在一起。

6.2.2 体外受精技术 该技术门类包括: 卵子采集与成熟培养 精子的采集与获能 体外受精 受精卵体外培养 试管胚胎的移植

1、卵母细胞的采集和成熟培养 （1）卵母细胞的采集 超数排卵技术—人为注射性激素促进卵巢多排卵； 活体卵巢采集---借助仪器直接活体吸取卵子； 屠宰后母畜卵巢采集

（2）卵母细胞选择 据卵母细胞的形态和胞质均匀程度，未成熟的卵母细胞分为ABCD4个等级，体外受精选用A和B级。

（3）卵母细胞的成熟培养 未成熟的卵母细胞置于成熟培养液继续培养至成熟（减数分裂第二次中期）

2、精子获能处理 精子获能：精子去掉表面抗原和去能因子，增加精子的质膜透性，以及质膜蛋白改变以便为顶体反应创造条件。 获能方法: 体内获能和体外获能。 体内获能指从交配母畜子宫提取精子；

体外获能:包括精子洗涤初选和获能处理 。 获能处理:利用钙离子载体等促进钙离子进入精子顶体，刺激精细胞酸碱度升高，诱发获能反应。

3. 体外受精 （1）常规体外受精 （2）与分离精子结合的体外受精 （3）显微受精（透明带注射和卵子胞质注射） 围绕在卵子周围的一层透明的膜状保护层。可启动顶体反应，在受精中起重要作用。

卵胞浆内单精子注射

卵细胞质内单精子显微受精ICSI 方法：在显微操作仪下，将整个精子或精子的头部注射到卵母细胞质内，完成受精。 特点：精子浓度、活动率对受精均无影响,可来自男性新鲜或冻融的精子，或来自附睾、睾丸穿刺取出的精子。 1994年，世界上第一例“ICSI婴儿”出生。ICSI受精率高达50%至70%。

4.受精卵的体外培养 受精卵需在培养液或输卵管发育至桑葚胚或囊胚，移植到受体后，才能正常发育。 发育阻滞：体外受精的胚胎在体外发育时经常停滞于某一阶段。

克服发育阻滞的方法： 一是通过改进培养液来改善营养条件； 二是利用体细胞共培养体系，提供胚胎发育所需。

受精卵分裂示意图

5.胚胎移植 选择繁殖力强体格健壮的母畜为移植受体。

6.3 胚胎移植技术 胚胎移植又称受精卵移植，是指将雌性动物的早期胚胎，或者通过体外受精及其他方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的其他雌性动物体内，使之继续发育为新个体的技术。

6.3.1胚胎移植研究史 首次成功是由英国剑桥大学的学者Walter Heape（1890）创造 。 20世纪60年代，英、法、加、美、日等国研究 20世纪 80年代中期以前，我国牛胚胎移植处于试验研究阶段。 80年代中期至90年代中期，我国牛胚胎移植技术进入发展提高阶段。

胚胎移植的意义 胚胎移植技术主要用于以下几个方面： （1）增加进口纯种畜和优秀个体的后代数。 用于纯繁扩群，增加种畜的数量。 （1）增加进口纯种畜和优秀个体的后代数。 用于纯繁扩群，增加种畜的数量。 （2）缩短家畜的改良周期，加速品种改良。

（３）用于单胎动物的育种，可缩短选择种牛的年限。如牛的MOET育种方案比后裔测定育种方法遗传进展快。 （４）移植产双胎，提高生产效率。对肉用家畜尤其有价值。同时移植双胚或双半胚或在配种后第7天前后移植一枚胚胎，可获得30%以上的双犊率。

（５）代替种畜的引进。 （６）保存品种资源。保存于具有优良遗传特性的家畜胚胎库、基因库，保护濒临灭绝的家畜和动物品种。 （７）用于一些疾病的诊断和治疗。 （８）发展家畜生物技术的研究手段。这项技术是胚胎分割、嵌合、核移植、体外受精和转基因动物等家畜生物技术不可缺少的技术革新手段，也可用于生物学和医学的研究。

6.3.2 胚胎移植技术程序 1.供体和受体母畜的准备 供体应该是良种母畜，不仅应具有较高的育种价值，而且应该有良好的繁殖机能。 每头供体需准备数头受体，受体母畜可选用非良品种的个体，但应具有良好的繁殖性能和健康状态，体况中上等。

2. 超数排卵处理 在母畜发情周期中的适当时间，注射促性腺制剂，使卵巢比自然生理状态下更多的卵泡发育并排卵，这种方法称超数排卵。 目前多采用FSH进行超排，连续注射3～5天，每天2次，剂量均等或递减，效果较好。

3. 同步发情 利用某些激素制剂人为地控制并调整一群母畜发情周期的进程，使之在预定时间内集中发情。

同期发情的意义 1)有利于推广人工授精 2)便于组织生产 ，节约劳动力和费用，对于工厂化养牛有很大的实用价值。 3)提高繁殖率 　　1)有利于推广人工授精 　　2)便于组织生产 ，节约劳动力和费用，对于工厂化养牛有很大的实用价值。 　　3)提高繁殖率 　　4)获取胚胎资源

4.人工受精 用激素进行同步发情处理后，人工输入精子。 经过超数排卵处理的母畜在观察到发情的当晚或次日晨进行人工输精两次 。

5.胚胎采集 常采用输卵管－子宫双冲洗法，可最大限度回收胚胎，常用的方法有： 1）外科手术回收法 ； 2）非手术回收法。

6.胚胎的检查与鉴定 显微镜下观察采集胚胎应该是：外观饱满、透明带完整、卵间隙小，卵裂球大小均匀，界限清晰，透亮充实，胞质均匀等。

胚胎质量鉴定

7.胚胎移植 手术法移植：全身麻醉，手术将子宫和输卵管拉出，用钝形针在移植部位刺一个小孔，小心地将胚胎输入。手术移植法移卵容易，损伤小。 非手术法移植胚胎：用带套管的移植器，借助人手将移植器尽可能达到子宫角，把卵注入有卵黄体的一侧子宫角内。

6.4 胚胎分割技术 胚胎分割就是把胚胎用显微手术分割为二，甚至分割为四或八，以获得同卵双生或多生的后代，也是胚胎克隆的一种方法。

胚胎分割的理论依据 大多数哺乳动物早期胚胎属调整发育类型，去掉早期胚胎的一半，剩余的部分仍发育成完整的胚胎。至少在8细胞前，每个分裂球都有相同的发育能力。 到晚桑椹胚时，胚胎发生初步分化，这时进行胚胎分割，可以重新发育到囊胚。

胚胎分割技术的意义（自学） 1）增加优秀遗传性状的动物数量，可提高胚胎移植技术的效率和效益。 2）一卵双生或多生的遗传上同质的后代，为动物遗传学、发育生物学、动物育种学等提供宝贵的实验材料。 3）胚胎分割技术与其他胚胎工程技术结合，为胚胎转基因和性别鉴定等提供胚胎活检方法。

6.4.1 胚胎分割的方法 1.显微针分割法：借助显微操作仪器的显微玻璃针分割胚胎，适于卵裂球阶段的胚胎。 2.显微刀分割法：借助显微操作仪器的显微刀分割胚胎，适于桑葚胚和早期囊胚阶段的胚胎。

3.结合透明带酶软化的显微分割法；分割前用链霉蛋白酶软化处理胚胎的透明带。 4.徒手分割法，显微镜下手持显微刀或玻璃针对胚胎进行分割。适于分割较大的胚胎。

6.4.2 分割胚的培养 1. 早期胚胎分割后，需先在体外或者体内借助透明带培养一段时间，等发育正常再移植到受体母畜体内，直到获得同卵双生后代。 2.晚期胚胎（桑葚胚以后），不需要透明带培养，可直接分割后移植到受体母畜体内，产下同卵双生后代。

6.4.3 胚胎分割存在的问题与前景 1.问题 （1）胚胎分割产生的后代初生体重轻； （2）胚胎分割产生的后代遗传性状并非完全一致。

2.前景 通过胚胎分割增加胚胎数目，移植后获得更多优良种畜； 利于性别鉴定和遗传病诊断； 增加受孕率。

6.5 早期胚胎的体外培养 哺乳动物的胚胎发育必须在体内完成， 如早期胚胎在体外培养必须克服发育阻滞等障碍。

6.5.1 早期胚胎的发育阻滞 胚胎的发育阻滞：体外受精的早期胚胎在体外发育中，经常停留在某一阶段不再发育的现象。 胚胎的发育阻滞的机制：与胚胎的母源基因调控向自身基因调控的转换有关。在早期胚胎发育的某一阶段，由于和体内培养条件存在差异，不清楚体外培养所产生的抑制因子(H2O2)，其它原因也很多，造成发育阻滞。

6.5.2 克服发育阻滞的方法 1.培养条件 （1）能量底物 培养基的能量底物主要是乳酸和丙酮酸，根据需要添加少量的葡萄糖。 （2）氨基酸 根据需要添加必需或者非必需的氨基酸。 （3）血清 注意添加不宜太早，否则有损害作用。利于细胞存活和生长。

（4）细胞因子 无血清培养液中可加，促进胚胎生长发育。 （5）抗氧化剂 按需要添加谷胱甘肽或维生素C等。

2. 共培养 胚胎与其他类型的体细胞（叫做饲养层细胞）共培养，有助于克服发育阻滞。

6.6 胚胎冷冻保存技术 胚胎冷冻保存：借助保护剂和降温措施，把胚胎长期保存在超低温状态。 1972年，超低温冷冻小鼠胚胎 1973年，超低温冷冻的牛胚胎解冻后移植成功 1977，快速冷冻 1985，玻璃化冷冻

6.6.1抗冷冻剂和冷冻保护溶液 -15到-50℃是胚胎冷冻和解冻的致死温度区，容易胞内结冰。要加入抗冷冻剂避免。 抗冷冻剂：分为 （1）细胞内液抗冻剂，如甲醇,甘油等； （2）细胞外液抗冻剂，如半乳糖,蔗糖等； 冷冻保护溶液：磷酸盐缓冲液（pH7.2-7.4）

6.6.2 胚胎的冷冻方法 1.常规冷冻法（快速冷冻法）p114 生产上常用此法。 2.一步冷冻法 冷冻前先用高浓度抗冻剂处理胚胎使之脱水，利于较快冷冻。 3.玻璃化冷冻法

常规冷冻法 洗涤胚胎、加入冷冻液、将胚胎移入细管、放入冷冻仪、逐步降温至-35~-38℃，投入液氮保存。

一步冷冻法 洗涤胚胎、加入冷冻液、将胚胎移入细管、将细管在液氮颈部预冷5min，投入液氮保存。

玻璃化冷冻 洗涤胚胎、加入冷冻液（分两步）、将胚胎移入细管、将细管在液氮颈部预冷5min，投入液氮保存。 高浓度冷冻保护剂和细胞间经一定时间平衡后，细胞体积可因脱水而减少30-50%，然后将之置入冷冻器材，再直接投入液态氮中使细胞瞬间玻璃化，在无冰晶形成下保存，以减少细胞内结冰造成伤害。

②冷冻与解冻方法 胚胎冷冻法有多种，主要介绍几种快速冷冻法: 第一，常规冷冻法。也称快速冷冻法，是目前实践中常用的方法。其步骤如下： --将采集的胚胎在含20%小牛血清的PBS中洗涤2次； --在室温下加入含1.4mol/L的甘油和20%小牛血清的PBS的冷冻液中平衡20min； --将胚胎和冷冻液装入0.25ml的细管中，封口，并在细管外作好标记，如日期、胚胎数、供体号等； --将细管放入冷冻仪中，在0℃平衡10min，以1℃/min的速度降至6℃--7℃，并在此温度下诱发结晶，并平衡10min，然后在0.3℃/min降温至于35℃--38℃，投入氮保存。 --从液氮中取出细管，立即投入到37℃水浴中，轻轻摆动，1min后取出即完成解冻； --用0.2-0.5mol/L蔗糖PBS液分两步或一步法脱除冷冻保护剂，使胚胎复水、移植。

第二，一步冷冻法。在冷冻前利用高浓度的抗冻剂使胚胎脱水，从而减少冷冻过程中细胞内冰晶的形成，胚胎在室温下脱水后，不需要特殊的降温程序，勇夺很短时间内完成冷冻过程。实用价值高。其具体步骤与常规冷冻法前三步相同，第四步将装胚胎的细管在液氮颈部预冷5min后投入液氮保存。解冻时，取出细管后，先在空气中平衡10s，再置于37℃水浴解冻；之后，去除冷冻保护剂量。

第三，玻璃化法。是1985年发展起来的一种快速冷冻胚胎的方法。玻璃化冷冻时，由于所用溶液在低温下变粘稠，不发生结晶而形成一种特殊的固化的“玻璃化” 状态，大大减少了冷冻伤害。 为了在一定冷冻速度下形成玻璃化，需要使用高浓度的可渗低温保护剂。将在0℃以上的抗冻保护液中平衡后的胚胎直接投入液氮中保存，简化了胚胎冷冻操作程序，大大缩短了冷冻时间，由传统的3h减少到40min，并且不需要复杂昂贵的冷冻仪器，实践中易于推广应用。

胚胎冷冻化保存的意义 是胚胎移植技术进入商业化的关键； 便于保存和引种优良种质资源； 便于国际间交流良种。

6.7 动物性别控制 是指通过人为干预，使得动物按照人的意愿繁衍所需性别后代的技术。 性别控制的意义：可提高动物生产的经济价值；可加快动物的遗传进程；

6.7.1 动物的性别决定 1. 哺乳动物性别决定依赖于Y染色体上的SRY基因，它使原始性腺发育为睾丸。SRY基因为开放的读码框架结构，可编码204个氨基酸肽键，其中之一是能编码80多个保守氨基酸框架的睾丸决定因子基因(TDF)。

6.7.2 性别控制的方法和技术 性别控制主要包括两个方面，即受精之前和受精之后。前者是通过对精子的体外干预，使在受精之时便决定了后代的性别。后者是通过对胚胎性别进行鉴定，从而获得所需性别的后代。

1.X与Y精子的分离 X-Y精子在物理和化学上存在差异，因此可以采用相应的方法分离。（p117） 沉降法：根据XY精子的体积和重量差别，使用具有一定粘稠度的分离液分离，上层是Y精子，下层是X精子，缺点：效果不稳。 离心法：X精子DNA含量大于Y精子， 因此X精子密度大。优点：时间短；缺点：条件要求精确。 电泳分离法：利用表面电荷差异，Y精子正电荷大于X精子，在负极集聚。 y

免疫学分离法：利用H-Y抗体检测精子质膜上所存在的H-Y抗原，依次分离两类精子。 最可靠的分离精子方法是根据X和Y精子的DNA含量存在差异的原理，利用改良的流动细胞测定仪分离X和Y精子。

2. 胚胎的性别鉴定 早期胚胎性别鉴定方法主要有细胞学方法、免疫学方法、分子生物学方法，各有利弊。 （1）细胞学法：是经典的鉴定方法。胚胎的核型为xx或xy，从胚胎取出部分细胞进行染色体分析或阻断培养在细胞分裂中期进行染色体分析，即可判定性别，该法优点是准确率可达100％，但采集细胞对胚胎有伤害，且获得高质量的中期染色体分裂相也较困难，不适用于实际生产。

（2）生物化学微量分析法 雌性胚胎中，与x染色体相关的酶的浓度和活度是雄性胚胎的2倍，藉此分析判断性别。

（3）免疫学法 利用H-Y抗体或H-Y单抗体检测胚胎中是否存在雄性特异性H-Y抗原，来鉴定性别。 A. 细胞毒性分析法：把H-Y抗体与补体加入培养液来培养胚胎，不能形成囊胚者为雄性，正常发育者为雌性。 B.间接免疫荧光法：利用含有H-Y抗体或H-Y单抗体的培养液培养胚胎，再加入荧光素标记的二抗，出现特异荧光为雄性，否则为雌性。 C.囊胚形成抑制法：含H-Y抗体的培养基可逆的抑制雄性桑葚胚发育为囊胚。

（4）分子生物学法 利用Y染色体的SRY基因鉴定胚胎性别； A. DNA探针法；从Y染色体上分离的特异性片段作为探针进行标记，与胚胎进行Southern杂交，阳性为雄性，阴性为雌性。 B. PCR扩增法：利用PCR扩增检测SRY基因的有无，有就是雄性。

3.利用激素控制性别 利用激素控制养殖鱼类的性别； 雄激素：17α2甲基睾丸酮； 雌激素：17β2雌二醇和雌酮。

6.7.3 性别控制的意义 1.临床应用 结合遗传病诊断，防止与性别关联的遗传病胎儿降生。 2.畜牧业生产 满足性别限制养殖业的需求，如奶牛场； 消灭减少与性别连锁的遗传病； 增加种畜选育强度，提高母畜繁殖效率。

胚胎分割技术的发展 20世纪30年代，Pincus首先证明2细胞兔胚的单个卵裂球可在假孕体内发育成体积较小的胚泡。 1942年，Nicholas证明2细胞兔胚单个卵球可发育成胚胎的能力。 1970年Mullen将2 细胞胚分割，首次获得小鼠同卵双生后代。 1974年Trounson获得羊的同卵双生后代。 1986年我国张涌利用胚胎分割获得小鼠后代，1987年获得山羊。 1986年窦中英获得分割胚牛犊。 1987年谭丽玲获得同卵双生牛犊。 1990年获得奶牛四分胎后代。