质量控制在保证疫苗的安全性和有效性中的作用 中国药品生物制品检定所

疫苗的适用人群 接种人群: 健康人 儿童

疫苗的分类 细菌类疫苗： 由细菌、螺旋体或其衍生物制备而成，包括： 减毒活疫苗：卡介苗、人用炭疽和人用鼠疫疫苗等 灭活疫苗：霍乱菌体疫苗、钩端螺旋体疫苗等 亚单位疫苗：脑膜炎球菌多糖疫苗、伤寒Vi多糖疫苗等 重组DNA疫苗：重组疟疾疫苗、重组幽门螺杆菌疫苗等

疫苗的分类 病毒类疫苗： 由病毒、衣原体、立克次体或其衍生物制备而成，包括： 减毒活疫苗：乙型脑炎减毒疫苗、麻疹疫苗、风疹疫苗、OPV等 灭活疫苗：乙型脑炎灭活疫苗、出血热疫苗、狂犬疫苗等 亚单位疫苗：重组乙肝疫苗等 重组DNA疫苗：重组乙肝疫苗等

疫苗的分类 联合疫苗 由两种或两种以上疫苗抗原原液配制而成的具有多种免疫原性的疫苗。 例如： 吸附百白破联合疫苗 麻风腮三联疫苗

疫苗的两个要素 安全性 适用人群为健康人群，因此，安全性为首要考虑的要素 有效性 本报告中安全性只涉及质量控制保证疫苗的安全性，不 涉及疫苗内在原因产生的副反应问题。 有效性 有效性是指应用该疫苗后，使个体达到预防感染该病原 的能力 由于疫苗主要由病原体或大分子物质（蛋白、多糖等）组成，存在较多的可变因素。在生产过程中进行严格的质量控制有助于保证疫苗的安全性和有效性，另外，保证疫苗质量的连续性。 疫苗的质量控制涉及疫苗生产的全过程，遵守GMP原则，符合药典中通则和个论的要求。

内 容 第一部分：疫苗质量控制中的安全性 第二部分：疫苗质量控制中的有效性

第一部分：疫苗质量控制中的安全性 一，起始原材料，须符合药典中要求，重点考虑： 1.菌毒种 1.1生产用菌毒种、人和动物细胞、DNA重组工程菌及工程细胞被批准 1.2种子批系统(原始种子批、主种子批、工作种子批) 乙型脑炎灭活疫苗:乙脑病毒P3株 乙型脑炎减毒活疫苗:乙脑病毒SA14-14-2减毒株 1.3生产用菌毒种 例：减毒活疫苗，毒种的安全性考虑要点包括： 神经毒力（猴体试验或其它敏感动物） 毒种传代稳定性（突变、返祖），结合有效性制订毒种代次

病毒性疫苗 原始种子 病毒种子批系统 主种子 工作种子 来源、历史清楚 鉴别试验验证确定为该病毒 病毒增殖滴度达到要求 免疫原性达到要求 原始种子和主种子要求冻干保存于－20℃； 工作种子可以液体保存于－60 ℃以下，一般不超过2年； 建立的台帐实物一致 各种子批标签： 1、病毒名称 2、代次 3、数量 4、批号 5、制备日期 6、病毒滴度 原始种子 病毒种子批系统 主种子 工作种子 来源、历史清楚 鉴别试验验证确定为该病毒 病毒增殖滴度达到要求 免疫原性达到要求 从原始种子 主种子工作种子的传递不超过规定 无细菌、霉菌和支原体污染 无外原因子污染 中国药品生物制品检定所

起始原材料质量控制 2.生产用基质 2.1 原代细胞：健康的动物脏器组织或胚胎(猴肾、地鼠肾等),重点为外源因子、逆转录酶等因素 生产活疫苗时，应来自无特定病原体(SPF级)动物 2.2传代细胞：一定稀释倍数传代,人或动物肿瘤组织或正常组织传代或转化,悬浮/载体培养 制订三级细胞库，外源因子、致瘤性检定（限定代次） 2.3人二倍体细胞：鉴别、核型检查等 2.4重组细胞: 外源因子、稳定性

病毒性疫苗 原代细胞 地鼠肾细胞 沙鼠肾细胞 鸡胚细胞 兔肾细胞 牛肾细胞 WHO对地鼠外源病毒检测的要求 猴肾细胞 中国药典（三部 2005版） 灭活疫苗的动物细胞应来自封闭式房所内饲养的动物，并须检测与使用动物相关的特殊病毒 原代细胞 地鼠肾细胞 沙鼠肾细胞 鸡胚细胞 兔肾细胞 牛肾细胞 猴肾细胞 WHO对地鼠外源病毒检测的要求 pathogenic for hamsters 淋巴瘤病毒 乳突淋瘤病毒 多瘤病毒属腺病毒 逆转录病毒 淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒 呼肠孤病毒－3型 小鼠肺炎病毒 小鼠微小病毒 仙台病毒 汉滩病毒 鼠脊髓灰质炎 小鼠肝炎病毒 基里姆大鼠 SV-5 Toolans H-a 中国药品生物制品检定所

病毒性疫苗 我国目前用原代细胞生产的疫苗： 1 、乙型脑炎灭活疫苗 地鼠 2、乙型脑炎减毒活疫苗 地鼠 3、狂犬病疫苗 地鼠 1 、乙型脑炎灭活疫苗 地鼠 2、乙型脑炎减毒活疫苗 地鼠 3、狂犬病疫苗 地鼠 4、森林脑炎疫苗 地鼠 5、肾综合征出血热疫苗 地鼠 、沙鼠 6、麻疹减毒活疫苗 鸡胚 7、风疹减毒活疫苗 兔 8、腮腺炎减毒活疫苗 鸡胚 9、黄热病减毒活疫苗 鸡胚 10、脊灰疫苗 猴 11、轮状病毒疫苗 牛肾 12、流感疫苗 鸡胚 中国药品生物制品检定所

病毒性疫苗 1、冻存于液氮 2、一式两份保存 3、细胞库台帐与实物一致 4、细胞管标签： 细胞名称 细胞批号 细胞代次 细胞数/ml 管号 二倍体细胞 2BS MRC-5 传代细胞 Vero CHO 1、冻存于液氮 2、一式两份保存 3、细胞库台帐与实物一致 4、细胞管标签： 细胞名称 细胞批号 细胞代次 细胞数/ml 管号 制备日期 原始细胞库 细胞库的建立 主细胞库 工作细胞库 引进的细胞一般为主细胞和工作细胞库 鉴别试验 无菌试验 外源病毒（外源因子，特别是逆转录病毒） 染色体特性 致肿瘤性 中国药品生物制品检定所

病毒性疫苗 Vero细胞用于疫苗生产的优缺点 优点： 1、传代细胞系，几乎可以取之不竭 2、已经全面检定，其特性符合人用疫苗的生产， 优点： 1、传代细胞系，几乎可以取之不竭 2、已经全面检定，其特性符合人用疫苗的生产， 细胞库一经建立，细胞质量可高度控制 3、该细胞生长条件要求不高，容易培养繁殖； 4、可用生物反应器大规模生产 5、大多数病毒能在该细胞系中复制繁殖 6、疫苗生产不要动物 缺点： 1、由于是传代细胞系，有一定的致肿瘤性； 疫苗必须纯化，且细胞DNA含量须达到标准 2、目前不适合活疫苗的生产 中国药品生物制品检定所

病毒性灭活疫苗 二倍体细胞 具有正常二倍体（2n）染色体的数目，核型正常； 在培养条件下，不能无限期的分裂繁殖； 无肿瘤原性，保留原体内细胞特性。 常见的二倍体细胞： WI-38 IMR-90 MRC-5 2BS KMB-17 二倍体细胞代次的计算： 以细胞群体倍增为计算单位，当一瓶细胞长满达到一 定数量时，进行细胞传代使一瓶分种为二瓶，到该二瓶细 胞长满分别达到原来的细胞数量时为一代，如1：4传代即 为二代。 中国药品生物制品检定所

起始原材料质量控制 3. 动物原性材料 牛血清、胰酶等，进行必要的外源因子检测，不允许从疯牛病疫区进口此类原材料 4. 其它材料 4.1 化学试剂（灭活、裂解、纯化、稳定剂等） 应使用药用级 例：某企业的稳定剂成份导致异常毒性不过关 4.2 生产用水 4.3 抗生素， 严禁使用青霉素或β-内酰胺类抗生素 将来要求在细胞维持液中不得添加抗生素

二、生产过程中控制，必须符合GMP原则 1. 生产条件严格控制，例如： 1.1 活疫苗培养温度：OPV疫苗中温度升高时，病毒容易返祖，导致猴体神经毒力试验不过关。 1.2 灭活温度及时间：对灭活疫苗至关重要，尤其是采用野毒株生产疫苗时。1955年发生在美国的“卡特门”事件，未充分灭活的脊灰疫苗导致60名儿童和89名接触者发生脊髓灰质炎。 1.3 病毒裂解剂浓度、温度及时间：流感裂解不充分，在小年龄儿童中导致副反应增加 1.4 纯化设备及条件：防止纯化能力下降后增加疫苗的副反应

三、生产材料产生的残留物质检测 考虑DNA残留量 考虑残留DNA片段大小 2. 传代细胞的宿主蛋白残留量 安全性考虑 制品纯度考虑 正在建立Vero细胞残留蛋白含量检测方法 3. 原代细胞宿主成份 如：鸡胚卵清蛋白 4. 内毒素 来源：生产材料中含有，容器具引入 总的来讲，制品纯度越高，上述残留成份越少，疫苗的安全性越高

四、生产工艺中引入的 残留物质检测 1. 培养基中成份:不使用人血清,可用人血白蛋白 2. 牛血清残留(致敏物质) 3. 生产工艺中采用的化学试剂 灭活剂：甲醛等灭活试剂 裂解剂：Tween80, TritonX100,乙醚等 防腐剂：硫柳汞，苯酚，2-苯氧乙醇 佐剂：氢氧化铝 特点：大多数为限度实验 某些检测项目为生产过程中的控制，或在原液中进行检测，在成品中不含有检测项目，企业应建立可靠的检测方法并进行充分验证。如乙醚检测，如采用人工嗅觉法则不可靠，而HPLC或气相法则更加准确。

异常毒性试验与疫苗的安全性 异常毒性试验主要用于检测疫苗中与制品无关的任何毒性，如错误添加、混淆等导致的明显的毒性。 限于剂量和动物数量，该试验不能充分反应或代替疫苗的安全性。欧美国家要求工艺验证后，一般不再进行该项目常规检测。 疫苗中的不安全因素在大量人群使用时得以体现 只有进行严格的生产过程控制，采用可靠、准确的检测方法才能保证疫苗的安全性 我国在异常毒性检测中发现一些问题，如疫苗稀释液渗透压或冻干保护剂成份导致的注射后瞬间反应。

肾综合征出血热细胞培养疫苗 成品 检定项目 质量标准 半成 品配 制前 原液 检定 残余牛血清蛋白含量 (ng / 剂) ≤ 50 抗原含量 (血凝, ELISA) 1:64 Vero细胞DNA残留 10ng 灭活试验 盲传三代荧光检测应阴性 成品 检定 物理检查 桔红色混浊液体,久放 可形成能摇散的沉淀 化学 PH值 7.2 – 8.0 氢氧化铝含量 (mg/ml) ≤ 0.70 硫柳汞含量 (mg/ml) ≤ 0.10 无菌试验 应无细菌生长 细菌内毒素 ≤ 100 EU 异常毒 性试验 小鼠 小鼠应键在, 体重增加 豚鼠 豚鼠应键在, 体重增加 （效力实验） 四只家兔的中和抗体均应≥1：10 热稳定试验 37℃ 1 周后测四只家兔中和抗体均应≥1：10 中国药品生物制品检定所

疫苗的有效性 研发阶段：主要依赖于临床试验，在双盲、随机对照试验中确定 生产阶段：依靠严格的生产和质量控制保证疫苗质量（包括有效性）的连续性

临床试验流程 V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 联苗1组: 联苗2组: 对照组: 2 月 3月 4月 5月 6月 2 月 3月 4月 5月 6月 18-19月 19-20月 3.5ml 3.5ml 3.5ml 3.5ml 联苗1组: 3.5ml 3.5ml 3.5ml 3.5ml 联苗2组: 3.5ml 3.5ml 3.5ml 3.5ml 对照组: 联苗 1组：2-3-4月龄+18月龄 对照组：IPV+DTaP+Act-Hib (3-4-5月龄＋18月龄) 联苗 2组：3-4-5月龄+18月龄 三种疫苗在不同部位同时接种

第二部分：疫苗质量控制中的 有效性 1. 生产用菌毒种：核心问题 1.1 与预防疾病的对应关系：不同血清型 第二部分：疫苗质量控制中的 有效性 1. 生产用菌毒种：核心问题 1.1 与预防疾病的对应关系：不同血清型 1.2 菌毒株的免疫原性：药典中规定对主种子进行免疫原性检查，多数活疫苗规定在人体中检查。 如：麻疹毒株主种子批，接种健康易感儿童至少30名，抗体 阳转率不低于95％。 1.3 毒种传代次数：尤其是减毒活疫苗，不同代次的免 疫原性有差别。例如：OPV疫苗，毒种传代次数有 严格限定。 1.4 毒种保藏条件，一般为冻干或低温保藏。

2. 生产用基质 传代细胞和人二倍体细胞应建立细胞库系统，有效保证生产疫苗质量的连续性。 3. 生产中控制 培养条件：培养基、血清等的细胞增殖能力 收获次数：限定收获次数，细胞老化导致繁殖的病毒滴度变化 中间品的保藏条件：防止抗原聚合，病毒滴度下降 包装材料：抗原吸附在容器上

4.1不同的疫苗生产工艺 细胞工厂 转瓶机 生物反应器

4 6 8 10 12 14

4.3 应用生物反应器 进行狂犬病毒的灌流培养

4.4 细胞密度与微载体密度的关系 表：不同微载体密度细胞培养生产病毒效果比较 5 ~0.3×107 13 7.2 6.7 15 4.4 细胞密度与微载体密度的关系 表：不同微载体密度细胞培养生产病毒效果比较 微载体密度 (克/升) 收获终细胞密度 (个/ ml) 有效收获时间 (天) 最高滴度 (LD50/ml) 平均滴度 5 ~0.3×107 13 7.2 6.7 15 ~1.0×107 17 7.6 7.0 25 ~1.5×107 19 7.9

4.6 30L生物反应器=2000个3L转瓶 设备及配套设施先进 全自动、封闭式生产 应用连续灌流收获技术 细胞密度高达1.5 x107 病毒产量同比提高5倍以上

4 连续柱层析纯化系统 有效去除杂质蛋白 有效去除残余DNA 抗原回收率80%以上 批间差异非常小

----------------------------------------------------------------- 3.4 连续多批成品效价 平均效价 6.72 注册标准 4.5 国家标准 2.5 出厂效价(注册标准)≥4.5IU/剂 2006年平均出厂效价 6.9IU/剂(热稳定试验4.3IU/剂) 2007年平均出厂效价 6.5IU/剂(热稳定试验5.3IU/剂） 2008年平均出厂效价 7.2IU/剂(热稳定试验6.2IU/剂） -----------------------------------------------------------------

3.6 质量分析与检测 抗原检测 酶标仪 无菌检查 细胞检查

疫苗有效性的保证 鉴别试验：证明为本疫苗，防止混淆，尤其是多价疫苗 有效成份含量 1. 活疫苗滴度：尽量采用冻干剂型，液体疫苗时需有合适的保护剂 例如：OPV液体疫苗中添加1mol/L 的MgCl, -20°C冻存保藏 2. 灭活疫苗中抗原含量 采用可靠的方法准确测定：基于抗原抗体的含量测定采用平行线法 效期末标准：临床试验确定的抗原含量 放行标准：结合稳定性考核数据在效期末标准上适当增加抗原 含量，保证效期末标准 例如：流感疫苗中有效成份标示量为15ug/剂, 稳定性考核一年 下降2ug /剂, 则企业放行标准应为17 /剂。 3. 制品的装量：附加量保证可抽出体积

流感疫苗血凝素趋势图

重组乙型肝炎疫苗

稳定性： 效力试验参考品： 原液和半成品：制订储藏条件下的效期 成品：进行稳定性检查 对冻干减毒活疫苗：热稳试验，热稳后滴度达到效期末标准 水分含量测定：水分含量影响稳定性，应低于药典中标准 效力试验参考品： 效力试验是疫苗有效性的核心，基于生物活性测定方法的高变异性，在效力测定时必须包含有明确含量标示（以及变异范围）的参考品，以便： 1. 证明该次测定有效 2. 对待测样品进行标定 3. 监测效力试验方法和参考品的变化趋势 若企业采用自制参考品，应对国际参考品或国家参考品进行校正，采用多次测定数值进行统计分析，确定含量及变异范围，并保藏在合适条件下，制订参考品的趋势图，监测参考品的变化。

脊灰国家参考品滴定趋势图

疫苗有效性总结 临床试验确定 生产中进行控制保证疫苗的有效性 包括：剂量探索 免疫原性：有替代指标时 保护效果：最有说服力的证据 上市后监测：大量人群应用后的实际效果 生产中进行控制保证疫苗的有效性 包括：保证生产的连续性 准确的效力试验方法 稳定性

生物制品批签发 定义 生物制品批签发，是指国家对疫苗类制品、血液制品、用于血源筛查的体外生物诊断试剂以及国家药品管理当局规定的其他生物制品，每批制品出厂上市或进口时实行强制性资料审查、实验室检验后决定是否签发上市的管理制度。 生物制品批签发是一项重要的科学的生物制品管理制度。 －国家食品药品监督管理局第11号令：生物制品批签发管理办法

生物制品批签发 我国实行批签发的法律基础 中华人民共和国药品管理法（第四十一条） 中华人民共和国药品管理法实施条例（第三十九条） 疫苗流通及预防接种管理条例(第十七条) 生物制品批签发管理办法 进口药品管理办法

生物制品批签发 批签发产品的销售 《疫苗流通和预防接种管理条例》第十七条规定: 疫苗生产企业、疫苗批发企业在销售疫苗时，应提供由药品检验机构依法签发的生物制品每批检验合格或者审核批准证明复印件，并加盖企业印章。 疫苗批发企业经营进口疫苗的，还应当提供进口药品通关单复印件，并加盖企业印章。 疾病预防控制机构、接种单位在接收或者购进疫苗时，应当向疫苗生产企业、疫苗批发企业索取前款规定的证明文件，并保存至超过疫苗有效期2年备查”。

我国批签发实施过程 生物制品批签发 准备阶段 试行阶段 正式实施阶段 2001年12月我国开始试行批签发（EPI 5种制品） 2002年12月颁布了《生物制品批签发管理办法（试行）》 2003年1月15日开始正式实行批签发 2004年6月颁布了《生物制品批签发管理办法》 2006年1月1日对所有疫苗实施批签发管理 2007年12月31日对所有血液制品实施批签发管理

生物制品批签发 执行批签发机构 国家食品药品监督管理局主管全国批签发工作。 由国家药品监督管理当局指定药品检验机构承担批 签发检验和资料审核。 中检所、北京、上海、广东、四川、湖北、吉林、甘肃

2008年疫苗批签发概况 概况 6亿人份 34个品种 31家企业 3064批 不合格15批(200多万份)

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