第七章 干细胞 第一节 干细胞概述 第二节 胚胎干细胞的研究 第三节 成体干细胞的研究 第四节 在再生医学中的应用

第一节 干细胞概述 一、干细胞（stem cell）的概念 二、干细胞的特征 三、干细胞的分类 四、干细胞分化发育的途径 五、细胞因子

一、干细胞概念 具有自我更新、高度增殖能力的细胞，能产生表现型和基因型和自己完全相同的子细胞，同时还能分化为祖细胞。即这些细胞可以通过细胞分裂维持细胞群的大小，同时又可以进一步分化成各种不同的组织细胞，从而构成有机体各种复杂的组织和器官。

二、干细胞的一般特性 发育的全能性或多能性 无限的自我更新能力 长的生命周期及相对慢的增殖速度 极强的再生能力 易操作性

1、发育的全能性或多能性 ES细胞具有发育全能性，适当条件下，在体外长期培养或冻存，也不影响。小鼠ES在实验室已培养10多年。人类ES细胞在体外已传代250代。 组织干细胞以前一直以为只能分化出来源组织的细胞类型，目前的研究已发现可分化成来源以外组织的细胞。如骨髓间质干细胞，可分化为星形胶质细胞、神经细胞、少突胶质细胞、血细胞、肝细胞、肌细胞等。但多数组织干细胞是单能性的，如生精干细胞。

2、无限的自我更新能力 成体组织的干细胞群相对稳定，干细胞通过不对称分裂方式在完成组织细胞更新补充的同时，也使干细胞池保持稳定。如果在干细胞水平出现DNA复制错误，这些变异的遗传信息将随着不对称分裂而扩大到整个干细胞群，导致异常分化和细胞功能紊乱。

3、长的生命周期及相对慢的 增殖速度 不同组织干细胞自我更新速度不同，如小肠和造血系统的上皮细胞更新速度较快，约12小时。但肝干细胞只在受损伤较重的情况下，才激活和分裂。神经干细胞长期存在在神经组织中，不知道它的功能是什么。 在机体稳定状态下，组织细胞数量的保持和补充主要是定向祖细胞。干细胞只是在必要时分裂补充定向祖细胞。相对祖细胞，干细胞分裂速度慢。

4、极强的再生能力 多数干细胞都有参与组织再生和修复的能力。个别干细胞如神经干细胞在体外诱导实验中具有分化潜力，但在体内，就没有这个能力，认为缺乏干细胞分化的环境和条件，所以中枢神经系统损伤后不能修复。

5、易操作性 干细胞容易在体外培养，为各种遗传操作创造了条件。如基因转移、基因打靶等都不影响干细胞的发育潜力。如利用ES细胞做为外源基因的载体。

三、干细胞的分类 以细胞分化能力来分： 1、单能干细胞 2、多能干细胞 3、全能干细胞 以细胞来源分： 1、胚胎干细胞（ES、EG） 2、组织干细胞（成体干细胞）

1、单能干细胞 只能向一种细胞分化或密切相关的两类细胞分化。如皮肤上皮干细胞。 这个概念以后是否能存在？

2、多能干细胞（pluripotent stem cell） 具有分化出多种组织细胞的潜能，但不能形成完整有机体。如小肠干细胞可分化为上皮细胞、腺细胞等。骨髓造血干细胞可形成12种细胞。

3、全能干细胞（totipotent stem cell） 能分化成各种细胞，形成一个完整的有机体潜能。如受精卵和胚胎干细胞。

四、 干细胞分化发育的途径 干细胞——定向祖细胞——分化细胞

干细胞具有无限的自我更新能力，但分裂不频繁，数量保持稳定。 定向祖细胞增殖能力有限，有一定的分化潜力，是干细胞最终形成某种分化细胞的祖先细胞（progenitor cell）。 分化细胞的分化标记基因全部表达，没有继续分裂能力，寿命较短。也有例外如神经细胞寿命长。  

干细胞 祖细胞 分化细胞 是否表达分化标记蛋白 没有 开始具备 有 增殖能力 无限 有 无 自我更新能力 无限 无 无 干细胞 祖细胞 分化细胞 是否表达分化标记蛋白 没有 开始具备 有 增殖能力 无限 有 无 自我更新能力 无限 无 无 产生分化后代的能力 有 有限 无 参与受损组织的再生能力 长期有 暂时有 无

五、干细胞不对称分裂 不对称分裂：干细胞分裂产生2个细胞，1个为干细胞，另一个为祖细胞，然后由祖细胞产生分化细胞。如多数无脊椎动物。 对称分裂（群体不对称分裂）：从单个干细胞看，干细胞分裂产生2个细胞，或者都是干细胞，或者都为祖细胞，为对称分裂。但从干细胞群体看，平均每个干细胞仍为不对称分裂，如哺乳动物。

六、细胞因子与干细胞微环境 细胞因子在传递细胞与胞外基质间、细胞与细胞间的信息中起重要作用。细胞因子有干细胞因子（SCF）、白细胞介素(ILs)、干细胞生长因子(CSF)、表皮细胞生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)等。

1999年Goodell分离出小鼠肌干细胞，体外培养5天后，与少量的骨髓间质细胞一起移植入小鼠中，结果肌干细胞分化为各种血细胞。这个现象称为干细胞横向分化，认为是周围环境影响的结果。干细胞微环境（干细胞壁户，Niche）对细胞分化起很重要的调控作用

第二节 胚胎干细胞的研究 一、胚胎干细胞的概念 二、胚胎干细胞的研究历史 三、胚胎干细胞的分离培养、建系技术 四、定向诱导分化 第二节    胚胎干细胞的研究 一、胚胎干细胞的概念 二、胚胎干细胞的研究历史 三、胚胎干细胞的分离培养、建系技术 四、定向诱导分化 五、胚胎干细胞系基本特征

一、胚胎干细胞的概念 从早期胚胎内细胞团（inner cell mass,ICM）（大约140个细胞）分离来的（ES细胞）或从生殖嵴分离的原生殖细胞（EG细胞），经体外抑制分化培养，所获得的具有保持未分化状态的无限增殖能力的细胞，这些细胞在适宜的条件下，能够分化成各种类型的细胞、组织。

二、胚胎干细胞的研究历史 20世纪80年代初，英国剑桥大学Evans和 Kaufman以及美国Martin实验室独立从小鼠囊胚分离可在体外培养的正常干细胞，名为EK细胞。开创了ES细胞生物学研究的新时代。在此后胚胎干细胞在其他动物的分离和建系却受挫折，到80年代后期才有所突破。 20世纪90年代美国Matsui等从小鼠9天的胚胎生殖嵴建立了生殖细胞系，称EG细胞系，以后其他动物也相继建立ES和EG细胞系。 1998年美国威斯康星大学的Thomson等利用36枚新鲜或冻存的人工体外受精的胚胎，获得人的ICM细胞，建立了5株ES细胞系，以后从流产的胎儿培养出EG细胞系。这两个细胞系的建立和应用可能涉及社会和伦理问题，应当引起重视。1981-2000年，建立猪、牛、兔、绵羊、山羊、鱼、仓鼠、恒诃、河猴、人ES细胞系。

三、胚胎干细胞的培养、建系技术 1、抑制分化培养 2、ES细胞的分离培养 3、EG细胞的分离培养

1、抑制分化培养 由于早期细胞离体后极易发生分化，所以首先阻止其分化，确保全能性是关键。细胞分化抑制物是饲养层细胞、条件培养基和分化抑制因子，抑制分化培养方法有2种。 1）饲养层细胞培养法 2）无饲养层细胞培养法

饲养层培养法 分离的细胞生长在小鼠饲养层上（一种用射线照射或者加入有丝分裂抑制剂如用丝裂霉素处理的成纤维细胞层，成纤维细胞不能分裂，但能分泌LIF）。 操作比较麻烦，但成功率高，是早期培养的首选方法。

无饲养层培养法 在培养基中加入白血病抑制因子（LIF）、白介素6或条件培养基如2-3周龄幼年大鼠心肌细胞条件培养液。

2、ES细胞的分离培养 基本培养液：15%-20%小牛血清、0.1mmol/l旈基乙醇和双抗的DMEM液。 将囊胚接种到铺有饲养层的培养皿中，培养2-3天分离ICM细胞。 免疫手术法 常规培养法

3、EG细胞的分离培养 在解剖镜下取生殖嵴，接种到饲养层细胞上，细胞分裂增殖，消化后再培养。

四、定向诱导分化 细胞诱导分化是细胞与其微环境相互间复杂而精密协调的分子细胞学过程。60年代已知诱导现象。 谱系分化：经过谱系祖细胞、谱系定型细胞和终末分化细胞的分化全过程。会出现不稳定的过渡细胞。用于基础研究。 定向分化：控制ES细胞定向产生单一类型的终末分化细胞。用于细胞移植和治疗。 定向诱导的体细胞有：造血细胞、内皮细胞、神经细胞、肝细胞、脂肪细胞、软骨细胞、胰岛细胞、生殖细胞。

四、定向诱导分化 诱导物有两类： 1、诱导细胞可逆性的轻度损伤。如无机物、有机酸、醇、氨水或缺钙的盐水等。渗透压改变，造成神经细胞分化。 2、与被诱导的细胞表面受体结合而介导的细胞分化。类固醇激素、多肽生长因子。 诱导物浓度、时间、作用模式可导致不同分化，非常复杂，定向诱导是胚胎干细胞研究的热门话题。

五、胚胎干细胞系基本特性 体外无限增殖 体外产生分化细胞 体内产生畸胎瘤 巢状生长，有多能胚胎干细胞分子标记 染色体数目和核型正常 遗传可操作性 形成嵌合体实现种系传递

第四节 组织干细胞（成体干细胞） 一、组织干细胞概述 二、表皮干细胞 （ESCs） 三、骨髓干细胞 四、神经干细胞 五、成肌细胞 六、肝干细胞 七、成体干细胞研究中存在的问题 3

一、组织干细胞概述 1、概念 2、对组织干细胞的认识

1、概念 一群分布在成体组织中未分化的具有自我更新潜能的并负有构建和补充某种组织的各种类型的细胞的干细胞。

对成体干细胞的认识 传统观念：人体除血液、皮肤、消化管和肝有再生能力，其他组织没有再生能力；成体干细胞是专能的，只属于某种组织，即造血干细胞只能形成血细胞。 最新研究：成体干细胞的发育潜能可跨越组织和胚层界限如小鼠神经干细胞移植到经射线照射的骨髓，分化出血液细胞。此后发现可分化为肌细胞。表明微环境的改变，造成分化潜能的改变。

二、表皮干细胞ESCs ESCs的概念 ESCs的生物学特征 ESCs的鉴别与分离方法

ESCs的概念 存在于表皮内，一生均保持有增殖能力，可增殖分化为表皮中各种类型的细胞。 从再生能力角度：表皮中有表皮干细胞、短暂增殖细胞或祖细胞(transit amplifying，TA)、有丝分裂后(post-mitotic differentiating，PMD)细胞。

ESCs的生物学特征 自我更新增殖能力 慢周期性 对基底膜的黏附作用 形态学特点 定位

自我更新增殖能力 在体内表现为可增殖分化形成表皮的全层并维持自身的数量，在体外则表现为克隆性生长。

慢周期 体内表现为标记滞留细胞（label-retaining cell,LRC）。在新生动物细胞分裂活跃时掺入氚标记的胸苷，细胞在DNA合成的过程中摄取标记的核苷酸而将标记整合到 DNA中，由于干细胞分裂缓慢，这样的标记可以维持相当长的一段时间，因而可长期探测到放射性活性，如小鼠表皮干细胞的滞留标记可长达两年。

对基底膜的黏附作用 干细胞主要通过表达整合素实现对基底膜各种成分的粘附。各种整合素作为受体分子与基底膜各种成分相应的配体结合，如与层黏连蛋白结合的有整合素α1β1、α2β1、α3β1、α6β4，与纤连蛋白结合的有整合素α3β1，与胶原结合的有整合素α2β1。干细胞与基底膜粘附是干细胞维持其特性的基本条件。

形态学特点 超微结构均具有未分化细胞的特征；细胞体积小，细胞内细胞器稀少，RNA含量低，在组织结构中位置相对固定。

定位 定位隐蔽、安全，血供丰富，营养好。在没有毛发的表皮组织，ESCs与祖细胞（TA细胞）在表皮基底层呈片状分布，约占基底细胞总数的1%～10%。

ESCs的鉴别与分离方法 标记滞留细胞分析法 克隆分析法 细胞膜表面标志物 –整合素 细胞内标志物-角蛋白K15、K19

三、骨髓干细胞 造血干细胞 间质干细胞

造血干细胞 骨髓中造血干细胞是各种血细胞的前体细胞。因为细胞表面存在一些标志物，可运用流式细胞仪和磁性分选技术从骨髓中分离到足够数量的造血干细胞。若移植到不同的体内环境中，形成各种类的细胞。 外周血干细胞和脐血干细胞可取代骨髓移植。

间质干细胞 能分化为成肌细胞、成骨细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、肌细胞等，对组织修复应用前景较好。

四、成肌细胞 骨骼肌干细胞位于肌纤维周围，称肌卫星细胞。参与骨骼肌的修复。 体外培养发现还能产生血液的成分以及神经元和神经胶质细胞，具分化的可塑性。

骨骼肌修复过程 1、受损（冻伤、缺血等）的肌纤维出现程度不同的坏死； 2、巨噬细胞吞噬清除坏死细胞，但基底膜保留下来； 3、成肌细胞在一周内大量分裂，数量达到高峰； 4、成肌细胞沿残留的基底膜与合成肌小管，并分泌肌原纤维为幼稚的肌细胞； 5、在微环境的作用下，逐渐成熟。

骨骼肌再生的条件 基底膜的完整性； 受损肌肉的血供重建； 受损肌肉的神经支配。

五、神经干细胞 胚胎阶段神经干细胞位于大脑皮层、小脑等，成体中位于脑室的室管膜。单个室管膜细胞可形成神经细胞、神经胶质细胞等。但由于缺乏足够的正向刺激信号，神经干细胞无法产生大量的新生神经细胞。有人提出神经干细胞极少的分裂与记忆的形成和整合有关。在外界条件刺激下，如照射，神经干细胞能分化出各种血细胞。

六、肝干细胞 位于门管周围的卵圆形细胞，具卵圆形细胞核，细胞质少。 骨髓中也可见卵圆形细胞，并能分化为肝细胞。

七、成体干细胞研究中的问题 异质性 干细胞所处的环境 可塑性的调控 分化细胞的功能 体外的增殖

异质性 由于不同遗传机制而产生相同或类似的表型。是干细胞固有特性。如造血干细胞。肌干细胞能分化出肌肉和血细胞，其实是含有两类分化方向完全不同的干细胞所致。可塑性是否存在？

干细胞所处的环境 微环境：能容纳一个或多个干细胞并能控制其自我更新和分化的组织细胞和胞外基质的组合。是由各种调控活性成分组成的空间，细胞间保持的距离以及局部的近距离的调控正适合于细胞间的相互作用。是干细胞具有可塑性的重要原因之一。

可塑性的调控 对可塑性现象的解释： 机体中存在多种来源和不同分化方向的干细胞群，分别定向分化为来源地的组织。 机体中存在多能干细胞，在不同微环境的刺激下，向不同组织方向分化。 特殊信号刺激，可重新编程，改变分化方向。 两种不同来源的干细胞融合，形成其他组织类型的细胞。

在内源性调控机制研究中，一般认为转录因子在其中起重要作用。

分化细胞的功能 检测终末分化细胞的特定蛋白或标记的表达，很少研究分化细胞的功能。如帕金森病的研究，确实把体外培养的多巴胺能神经元植入脑内，可观察到被整合到脑组织，但不能证明这些神经元是否具完整的功能。

体外的增殖 尚没有成功的体外较长期保持未分化状态并能增殖的方法。 分离干细胞直接移植体内，在受损部位分化。 体外诱导成成熟细胞，然后移植到受伤部位。 上述两者都不成功。

第四节 在再生医学中的应用（自学） 哺乳类发育的体外模型 介导改造动物的基因 人体的基因和细胞治疗 组织工程的种子细胞来源

参考文献 张红卫主编，发育生物学（第2版）高等教育出版社。

讨论题 1、3种表皮干细胞检测方法 2、胚胎干细胞建系过程及关键技术 3、2种造血干细胞分离方法