南京医科大学组织胚胎教研室 江苏省生殖医学重点实验室 周作民 人胚胎干细胞研究进展 南京医科大学组织胚胎教研室 江苏省生殖医学重点实验室 周作民

干细胞的基本概念 胚胎干细胞系的建立过程 胚胎干细胞研究的进展情况 胚胎干细胞的研究意义 胚胎干细胞研究的困难及解决办法

人体发生过程： 受精 卵裂 受精后72h 受精后5-7天 精子+卵子 合子 卵裂球 桑椹胚 囊胚 滋养层胎盘及胎儿附属结构 精子+卵子 合子 卵裂球 桑椹胚 囊胚 滋养层胎盘及胎儿附属结构 囊胚 内胚层消化道、呼吸道上皮和腺体；肝；胆；胰。 内细胞群 中胚层结缔组织；血液；肌肉；骨骼；泌尿生殖系统 外胚层体表结构；神经系统

干细胞的基本概念 1、定义：具有自我复制的能力，在一定条件下能够分化成各种功能细胞。 2、分类： （1）全能干细胞，包括：胚胎干细胞（embryonic stem cells, ES细胞） 　　　　　　 生殖干细胞（embryonic germ cells, EG细胞） 　　 具有全能性，能够分化成全身200多种细胞类型， 进一步形成机体的任何组织和器官。 （2）多能干细胞：具有分化成多种细胞和组织的潜能，但却失去了发 育成完整个体的能力。 （3）专能干细胞：只能向一种或密切相关的两种类型的细胞分化。

横向分化： 　　部分干细胞在特定条件下可以转化为其它细胞，如肌肉干细胞在特定条件下可以分化为各种血细胞系。

胚胎干细胞的性质 衍生自囊胚的内细胞团或原始外胚层的细胞； 永生化(immortal)； 能维持稳定的正常的二倍体染色体结构； 有稳定的发育潜能，能被诱导增殖或分化； 能参与胎儿所有组织的发育过程； ，即能持久地在未分化状态下进行无限的对称分裂即自我增殖。 ，即正常的二倍体核型。在体外保持未分化的状态 ，即使在长期体外培养之后，仍具有形成三个胚层细胞的能力，即全能性 ，如在体外长期培养的小鼠胚胎干细胞注入宿主囊胚腔内，使其与宿主囊胚的内细胞群混合，再将宿主囊胚植入假孕小鼠的子宫内。小鼠胚胎干细胞参与各种组织细胞的发育，形成嵌合体小鼠

胚胎干细胞系的建立过程

1、干细胞来源： (1) 发育良好的囊胚，从中分离内细胞群细胞ES细胞 (2) 从5-9周的胚胎生殖腺中分离出人的EG细胞（embryonic germinate cells） (3)恶性胚胎肿瘤或畸胎瘤细胞 （embryonal carcinoma, EC) (4) 生殖克隆（治疗性克隆）：体细胞核转移（SCNT） 　　去核卵细胞 + 体细胞核 克隆 囊胚 分离内细胞群 ES细胞

2、胚胎干细胞的分离 酶消化后培养 免疫方法去处滋养层细胞 流式细胞仪分离法

3、培养条件： (1) 特殊的培养液：用DMEM培养液，其中胎牛血清的浓度和质量很重要，还要加非必须氨基酸；β-巯基乙醇。 (2) 以人或胚鼠的成纤维细胞为饲养细胞。 (3) 必须加入LIF，抑制细胞分化。

4、胚胎干细胞的鉴别 　　胚胎干细胞具有以下特点： (1) 细胞内碱性磷酸酶活性高 (2)端粒酶活性高 (3) 不被Hoechst33342 和Rhodamine123染色 (4) 细胞膜表面有特殊的标记：SSEA-3, SSEA-4, 　 TRA-1-60, TRA-1-81 (5) 能分化成三个胚层的细胞，将胚胎干细胞植 　 入免疫缺陷小鼠皮下可产生畸胎瘤 (6) 可诱导分化为各种成体干细胞

干细胞特性

干细胞诱导分化的常用方法 （1）加入诱导细胞分化的因子或化学物质， 如VGEF、bFGF 、DMSO和RA等 （2）将ES细胞与特定的细胞共培养 （3）将某种分化诱导因子的基因转入ES细 胞内

鉴定干细胞的常用方法： （1） 细胞形态与结构 （2）细胞功能 （3）细胞表面的特殊标志 （4）细胞内特异基因的表达

造血干细胞的鉴定： （1） 细胞形态 ：集落呈非贴壁生长，细胞形态较小 （2）细胞表面标志：flk-1（Fetal Liver Kinase 1); L/TAL-1； CD34；GATA-1； （3）基因表达：TAL-1；GATA-2 ；βH1；β主要珠蛋白

内皮细胞 : （1）细胞形态：扁平贴壁状态 ；Weibel-Palade小体；广泛胞内连接；大量吞饮泡 （2）细胞标志：血小板内皮细胞粘附分子PECAM-1或CD31；细胞粘附分子整合素αvβ3 ；CD34 ；JAM(Junctional Adhesion Membrane) ；MECA-32以及MEC-14，7抗原 （3）特异基因表达：flk-1；flt-1 ；tie-2

心肌干细胞： （1）细胞结构：细胞内含糖原颗粒，大量线粒体以及广泛的未形成成熟肌原纤维的粗丝和细丝 （2）细胞功能：节律性收缩 ；心肌特异离子流。利用膜片钳技术可检测L型Ica，Ina，Ito，Ik，Ik1，Ik，ACH和If （3）基因表达：α及β心肌球蛋白重链

神经干细胞 : （1）细胞形态：胞体很小，从胞体伸出许多长的神经突 （2）细胞功能：电压控制性Na+，K+，Ca2+通道；神经递质的受体 （3）细胞标志：TH（酪氨酸羟化酶），微管相关蛋白tau，MAP2，β微管蛋白3（TuJ-1），GFAP（胶质原纤维酸性蛋白），巢蛋白，突触泡蛋白以及NF-L（68KDa的神经丝蛋白），NF-H（200KDa的神经丝蛋白），NF-M（160KDa的神经丝蛋白）；Nurr1和Ptx3（中脑多巴胺能神经元的标志） （4）特异基因表达：5天的EBs中有NF-L，NF-M和突触泡蛋白的表达，2天后表达编码神经聚糖（脑特异蛋白多糖）的基因，6天后表达编码微管相关蛋白tau的基因。也有检测发现分化细胞中有Brain-3，谷氨酰胺受体亚单位GluR-4和GluR-6，递质合成酶TH和GAD67，GAD65，GFAP和NF-L的表达

胰岛细胞 : 细胞标志：GATA-4（胚胎和胚外内胚层的标志），HNF3β（胚胎内胚层的标志）；胰岛素淀粉样多肽IAPP；葡萄糖转运蛋白-2（Glut-2） ； 胰岛β细胞的特征及特定标记物：胰岛GK和GLUT2（葡萄糖转运子）；转录因子IPF1/PDX1和NgN3（Neurogenin3）

2002年3月，美国麻省理工学院的科学家宣布，他们首次利用人体胚胎干细胞培育出毛细血管，证明了胚胎干细胞技术在治疗心血管疾病等领域的应用潜力。 目前已有报导ES细胞能在适当条件下分化为心肌细胞，胰岛细胞，血管内皮细胞，肝细胞等。

1999年12月，美国《科学》杂志公布了当年世界科学进展的评定结果，干细胞的研究成果列在举世瞩目耗资巨大的人类基因组工程之前，名列十大科学进展首位。

解决胚胎来源有限的途径： 未成熟卵的体外成熟 ，采用第3~5代的小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)。第三代至第五代的MEF生长和分泌分化抑制因子等各种因子的能力最旺盛，并且含杂细胞少，比较纯净。饲养层细胞向培养液中分泌促进ES细胞的增殖和抑制ES细胞自主分化的因子，如白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor,LIF） ，故它能有效地促进胚胎干细胞增殖并维持其未分化的二倍体状态和全能性。经丝裂霉素C处理，阻断其有丝分裂，但不会马上死亡，可在体外存活一段时间并保持分泌各种因子的。制备的饲养层须是细胞连成一片，无间隙。因为MEF产生的抑制分化因子一部分分泌到培养液中，还有一部分锚定在细胞外基质上，通过与胚胎干细胞的接触而起到作用。无间隙的饲养单层保证了胚胎干细胞都能与饲养层细胞接触而达到最佳效果。制备的饲养层在5天内使用，时间过长，处理后的饲养层细胞会衰退死亡，效果下降，以致影响胚胎干细胞的生长。 体外培养人胚胎干细胞的基本原则是，最大限度地抑制分化，维持其全能性，同时促进其快速增殖及维持其正常的二倍体核型。 胚胎干细胞的体外培养条件： 1. ES细胞增殖所必须的营养物质。在胚胎干细胞的体外培养和传代中，必须添加细胞增殖所必需的蛋白质、核酸等，如胎牛血清，非必须氨基酸，各种嘌呤和嘧啶。本实验采用高糖的DMEM作为胚胎干细胞分离和培养的基础培养基。高糖的DMEM有助于囊胚的贴壁，内细胞团的增殖及胚胎干细胞集落的形成。其中添加β-巯基乙醇，可以保护细胞内酶和蛋白质中的巯基不被氧化，从而促进胚胎干细胞的贴壁及克隆形成。巯基 2.维持ES细胞的未分化状态和多能性，主要包括在培养液中加入LIF同时使用饲养层。

避免免疫排斥的方法 （1）Knock-out 胚胎干细胞的组织相 容性抗原 （2）Knock-in 受者的组织相容性抗原 （3）与同一来源的造血干细胞一同移植 （4）受者的体细胞核移植

ES细胞研究的趋势 改善ES细胞的体外培养条件，建立更有效更简便的获得ES细胞的方法。 定向诱导分化成特定类型细胞，用于临床疾病的治疗，并解决免疫排斥和潜在的致肿瘤的问题。 成体干细胞的横向分化的能力以及与胚胎干细胞的比较，成体干细胞能否替代胚胎干细胞？