活体成像技术实验设计与应用介绍

内容简介 技术简介 实验设计中的注意事项 应用介绍

一、活体成像技术简介

活体成像定义 定义: 活体状态下在细胞和分子水平上应用影像学方法对生物过程进行空间和时间上的定性、定量分析研究的一门科学。 Dr. Ralph Weissleder

细菌感染模型建立 建立一个细菌感染模型，小鼠左侧后腿部位肌肉注射金葡菌。 金黄色葡萄球菌

荧光标记探针靶向细菌 DPA作为靶头与Cy7连接后，尾静脉注射注入体内。 利用阳离子分子与细菌表面的负电荷静电结合 DPA-Cy7

荧光成像在细菌研究中的应用 Pre-injection Post-injection 6 h 12 h 18 h 21 h 活体成像的进行一般需要报告基因来进行，比如说发光荧光素酶或是荧光蛋白；但是在许多情况下，报告基因不适用，这就需要我们使用能够对细菌选择性靶向的一些外源合成探针。这篇文章研究的对象就是一种荧光成像探针，这种探针是连接了近红外染料的细菌亲和基团。这个亲和基团是一种合成锌（Ⅱ）络合物，它能够靶向到细菌细胞的阴离子表面。使用这个探针，我们对金葡菌感染小鼠腿部的小鼠模型（5X107个细胞）进行全身的近红外荧光成像。注射探针21h后，对ROI区域的分析比较显示，感染腿部信号与未感染腿部信号比值为3.9±0.5 ；离体比值为8；免疫组化分析确认探针靶向到了感染组织的细菌。研究表明，近红外分子探针适合对金葡菌感染定位的非侵入性活体成像的。 之后，随着代谢的进行，最后信号定位于金葡菌感染的部位。 Leevy, W. M.; Marquez, M.; Piwnica-Worms, D.; Smith, B. D. Bioconjugate Chem.2008,19,686–692.

活体成像的优点 终极方法 无损伤性 直观形象

活体成像技术的应用方向 药物材料研究 生命科学研究 新药评价 纳米药物 核酸疫苗 骨科材料 生物材料 肿 瘤 微生物 干细胞 心脑血管 肿 瘤 微生物 干细胞 心脑血管 疾病模型 应用领域越来越广泛

常用活体成像模式 功能成像 结构成像 生物发光 荧光成像 同位素 X光、白光成像 对象 细胞 细胞、分子 分子 动物或器官 优点 噪音低 应用广泛 影响小 结构清晰 缺点 构建繁琐 成本昂贵 噪音大 资质许可 无功能信息

功能成像（荧光）与结构成像（X光）的组合运用 X光成像 Kodak X-Sight 761 overlay

数码X光成像的精确定位 -结构成像与功能成像相结合

数码X光成像的精确定位 -结构成像与功能成像相结合 正面成像 侧面成像 Courtesy Dr. B. Bednar , Merck Co. Inc.

多模式活体成像 多模式活体成像：成像过程中至少同时采用一种结构成像和一种功能成像的组合成像方式。 例如： X光 ＋ 荧光成像 + 生物发光 + 同位素成像 结构成像 功能成像 CT ＋ PET+SPECT 多模式成像 结构成像 功能成像

多模式活体成像应用举例 ---生物发光、荧光与X光的组合运用 使用荷有4T1luc肿瘤细胞的小鼠模型；肿瘤细胞稳定表达生物素酶，通过生物发光技术显示肿瘤位置；用CY5.5近红外荧光染料标记VEGF(血管内皮生长因子)的单链抗体，静脉注射后，采用荧光成像技术显示抗体体内分布和代谢信息。 生物发光、荧光成像和X光成像组合运用的成功范例，已成为肿瘤等研究的经典方法 Nature Medicine Backer MV, et al., 2007. Vol13(4), April 2007. p504-9.

多模式活体成像应用举例 ---荧光与同位素成像的组合运用 多模式活体成像应用举例 ---荧光与同位素成像的组合运用 In111-DTPA-CCPM 小鼠前腿接种MDA-MB468乳腺癌，Cy7标记的CCPM纳米颗粒注射小鼠后不同时间点荧光成像。 CCPM是一种微球其内部包裹荧光染料，可以用作肿瘤细胞的特异性标示；DTPA是金属同位素螯合剂，用于同位素标记。采用乳腺瘤裸鼠模型，通过尾静脉注射111In标记的DTPA-CCPM分子，利用放射性同位素成像和近红外荧光成像技术，在不同时间点进行活体成像，观察染料分子在体内的分布与代谢情况。结果显示，这种染料分子可以特异性靶向到肿瘤细胞，并表现出良好的半衰期，展现了很好的药用前景，为肿瘤治疗研究提供新工具。 Zhi Yang, Chun Li, Biomacromolecules 2007，8（11）

多模式活体成像应用举例 ---发光、荧光与同位素成像的共定位 多模式活体成像应用举例 ---发光、荧光与同位素成像的共定位 利用近红外染料和放射性核素标记的环状RGD肽进行整合素受体阳性表达的肿瘤生物发光、荧光、Gamma闪烁成像和SPECT多模式成像。 2×105个4T1luc细胞皮下接种到小鼠的肩部。肿瘤最大直径长至5–10mm进活体成像研究，静脉注射111In-LS-308（环肽RGDyK的类似物）不同的时间点进行活体成像。 注：LS308：cypate-labeled cyclic RGD peptide，可特异性结合到肿瘤细胞表达的αvβ3整合蛋白;111In（放射性同位素铟）标记LS308 ；表达 luc的乳腺癌肿瘤模型；生物发光：hot; behind；NIR：rainbow;upfront；L：肝；K：肾脏；红色圆圈：肿瘤位置；视野：80mm,光圈：2.8，bining:2×2bining；激发：755，发射：830；IS4000MM 生物发光（ fire），近红外成像（ rainbow ），同位素成像（111In-LS308） Mol Imaging, 2009. 8(2): p. 101-10 18

1、荧光成像 基态 激发态 发射态 激发光 发射光 光能 光能

荧光成像应用 ‘标’悍的荧光 标记生物大分子：蛋白、抗体、多肽、核酸； 标记小分子化合物：小分子化合物； 标记细胞：肿瘤细胞、干细胞等； 标记纳米化药剂：脂质体、胶束等； 标记其他纳米材料：金属氧化物等; 标记细菌：各种感染模型; 标记脏器：ICG; ‘标’悍的荧光

荧光成像的关键因素—穿透率 小鼠不同部位的穿透率

650-850nm是活体成像的核心波段

波长对背景噪音的影响 420 ex / 790 em 440 ex / 790 em 460 ex /790 em 480 ex / 790 em 520ex / 790 em 540 ex / 790 em 570 ex / 790 em 590 ex / 790 em 600 ex /790 em 610 ex / 790 em 620 ex / 790 em 630 ex / 790 em 650 ex / 790 em 670 ex / 790 em 690 ex / 790 em 700 ex / 790 em 710 ex / 790 em 720 ex / 790 em 730 ex / 790 em White Light X-Ray 23

近红外成像-荧光成像的最佳选择 不同波长激光笔对大拇指的透光实验

2、生物发光 定义： 生物发光是荧光素酶（Luciferase）以荧光素（Luciferin）、三磷酸腺苷（ATP）和O2为底物，在Mg 2＋存在时发生酶促反应中产生光子的过程。 荧光素+ ATP+ O2→核黄素磷酸盐+醛化合物 核黄素磷酸盐+醛化合物→激发的络合物 激发的络合物→氧化核黄素磷酸盐+酸+水+光子 化学能→光能

生物发光的应用 细胞或细菌标记：肿瘤细胞、干细胞等记； 最新技术：生物发光与荧光蛋白双标 基因表达：以融合蛋白的方式标记内源性蛋白，研究基因表达情况； 蛋白相互作用：将荧光素酶基因分为两个片段，分别与要研究的两个蛋白融合表达，两种蛋白相互靠近后产生发光。

3、X-Ray 成像 0.0 mm 0.1 mm 0.2 mm 0.4 mm 0.8 mm 1.4 1.6 1.8 2.1 2.5 Bone/Soft Tissue Binning 1 x 1, Acq. Time 100 s 27

二、活体成像实验设计

活体成像实验设计 实验设计理论方面： 实验设计实践方面： 成像模式的选择：结构成像与功能成像组合 不同研究水平的相互组合：活体、离体、分子水平 实验设计实践方面： 染料的选择：类型、波长… 标记方法的选择：共价键、非共价键、脂质体… 荧光单一波长与多光谱分析选择: 近红外… 荧光素酶基因标记的细胞株

不同研究水平的相互组合 活体水平 离体脏器水平 细胞分子水平 三个水平一致的数据，才是更加真实有效的数据。

近红外荧光染料举例 类型 荧光染料 激发与发射波长(nm) 亲水染料 ICG 795/835 Cy系列（如CY7） CY7：743/770 Alexa 系列（如750） 750：749/775 疏水染料 DiR 748/780 稀土染料Er 980/655 Qdot Qdot800 450/800

报告基因的选择 成像模式 基因 激发与发射波长(nm) 说明 生物发光 Fluc 560 需要注射底物 Rluc 475 荧光 mKate2 588/633 近红外波段 TagRFP 555/584 红/橙 TagYFP 508/524 黄 TagGFP2 483/506 绿 注：荧光蛋白的信息来源于www.evrogen.com

动物麻醉方式的选择 注射麻醉： 腹腔注射：如戊巴比妥钠（1%，7 µ L/g） 气体麻醉： 小动物麻醉机：如异氟烷（2-5%）

注意事项： 小动物麻醉程度适度：麻醉过深加大死亡概率、剂量不足会出现抽搐 反复麻醉易导致死亡；注意麻醉动物的保温 小动物存在种属和个体差异，不同动物模型使用剂量不同 戊巴比妥等麻醉剂溶液长时间放置容易失去药效。

脱毛方法的选择 脱毛方式： 脱毛剂： 注意事项： 适量涂抹；清洗；适量配备；低温、 脱毛原因：荧光拍摄时毛发产生背景噪音 剃刀、电动剃毛器 化学脱毛剂 脱毛剂： 人用脱毛剂-带自发荧光 自配脱毛剂：8% NaS + 30% 无水乙醇 注意事项： 适量涂抹；清洗；适量配备；低温、 避光、密闭保存； 脱毛原因：荧光拍摄时毛发产生背景噪音 并影响光的穿透

生物发光成像时间点的选择 底物注射方式：一般通过腹腔注射打入底物(150µg/g)，偶尔也可原位注射; 生物发光时间：注射底物约一分钟后表达荧光素酶的细胞开始发光；十五分钟后强度达到最高； 发光持续时间：最高点持续约20～30分钟后开始衰落，约三小时后发光全部消失； 最佳检测时间：注射后12到25分钟之间; 麻醉时间：发光底物注射后7-8min开始麻醉; L O G O

荧光成像实验的注意事项 文献检索染料的激发发射波长和特点 体外用多光谱拍摄模式寻找最佳激发发射波长和最适浓度。使用黑色底透板拍摄（costar，货号3603），EP管对结果有一定影响 体外数据作为参考，在体拍摄预实验也要用多广谱拍摄再优化一下拍摄参数（光的穿透和背景噪音等的影响） L O G O

预实验的重要性 一、预实验前的工作： 二、预实验中的工作： 动物模型的建立：荷瘤模型、疾病模型… … 仪器兼容性：配套滤光片… … 待用的试剂和耗材：麻醉剂、脱毛膏、注射器、手术工具等… … 二、预实验中的工作： 了解动物：动物模型、荧光背景、麻醉、脱毛等 了解标记物：如荧光及发光强度、纯度、浓度 了解自己的实验操作能力：尾静脉注射 了解仪器：拍摄参数确定和程序设置 了解拍摄时间点：研究对象体内半衰期

正式实验的注意事项 注意对照的选择，特别是自身对照（给药前拍一下本底）和阴性对照，有条件的还要设置阳性对照 Protocol拍摄后应立即简单做一下叠加，以免动物小幅度爬动影响图像的叠加 动物有可能会排泄，所以看到明显的杂信号时，最好在那个部位用酒精等擦拭一下 拍摄不同脏器时，注意多选几个体位 注意离体脏器数据的收集，必要时固定、切片 L O G O

三、活体成像应用举例

荧光成像在纳米材料研究的应用 Medarova Z, et al., 2007. Vol13(3), March 2007. p372-7. 使用裸鼠动物模型，皮下接种稳转GFP和RFP的肿瘤细胞。所用纳米材料，共标记三种分子，一是CY5.5近红外荧光染料，二是抑制GFP表达的siRNA，三是协助靶向的一种跨膜多肽MPAP。静脉注射后48小时成像，结果显示，纳米材料已富集到肿瘤部位，GFP表达水平显著下降，但RFP表达未受影响。此实验揭示一种纳米材料可以承担多重生物反应作用，不仅可以进行活体成像，还可以携带药物进行肿瘤治疗。 Medarova Z, et al., 2007. Vol13(3), March 2007. p372-7.

纳米材料介导的肿瘤药物主动靶向

肿瘤药物靶向性实验 0h 2h 4h 6h 8h 12h 24h 32h 36h 48h 72h 58h

肿瘤药物靶向实体瘤实验 -生物发光、荧光和X光成像三重叠加 BLI NIRF Merge 肿瘤药物注射11h时生物发光、荧光与X光图像叠加 。

红色荧光蛋白RFP标记的前列腺癌 Zeng et al. Cancer Research, 2006, 9566-9575 45

生物发光在乳腺癌研究中的应用 X光成像 生物发光叠加X光

生物发光在肝癌研究中的作用 X-ray + luc White light + luc

局部高清晰成像，有效识别两个相距很近的肿瘤 生物发光在肺癌研究中应用 FOV 110cm FOV 3cm 局部高清晰成像，有效识别两个相距很近的肿瘤

小鼠眼部病毒转染的生物发光成像

小鼠关节高清晰X光成像 Bones 小鼠关节放大

X光大鼠爪子高清晰成像 最高分辨率达50线/毫米！

Visipaque进行小鼠心肾高清晰X光造影 Images Courtesy of USC Core Imaging Facility