第四节 转基因技术 一、概念 通过一定方法把人工重组的外源DNA导入受体动物的基因组中或把受体基因组中的一段DNA切除，从而使受体动物的遗传信息发生人为改变，并且这种改变能遗传给后代的一门生物技术。

二、哺乳动物转基因技术的意义 （一）在基础生物学中 （二）在基础医学研究中 （三）在畜牧业中

三、哺乳动物转基因技术的研究概况 美国科学家Jaenisch等人在1974年最早把猿猴病毒害40（SV40）注入小鼠囊胚腔中，得到部分体组织中含有SV40DNA的嵌合体小鼠。 1980年，Gordon等把SV40DNA显微注射到小鼠受精卵的原核中，获得了两只转基因小鼠，创建了显微注射转基因方法。 1982年，Palmiter和Brinster用此方法把大鼠的生长激素基因导入小鼠受精卵，获得了成年体重是对照组小鼠2倍的“超级鼠”。

1987年，Simons等在转基因小鼠的乳汁中得到绵羊的β-球蛋白，1988年，该研究小组又从转基因绵羊的乳汁中得到了抗胰蛋白酶。

四、哺乳动物转基因技术的程序 (一)目标基因克隆和体外重组 　　目标基因是准备导入受体的DNA序列，目前获得目标基因的途径有三条： 　　1.人工合成 　　它是用DNA合成小片段碱基序列，一般不超过100个碱基。 　　2.互补DNA（cDNA）的克隆 　　通过提取组织中的mRNA，用反转录酶合成cDNA，建立cDNA文库，再克隆目标蛋白的cDNA。 　　

3.DNA克隆 　　首先建立动物的DNA文库，再通过基因克隆技术获得编码目标蛋白的基因，这是获得目标基因最常用的方法。 　　目标基因被克隆以后需与表达载体相连结，形成一个独立表达的调控单元，再通过扩增和纯化，使DNA达到一定浓度就可用于基因导入。

(二)外源基因的导入 外源基因的导入方法主要有五种： 1.显微注射法 　　它借助显微操作仪，把DNA分子直接注入到受精卵的原核中，通过胚胎DNA在复制或修复过程中造成的缺口，把外源DNA整合到胚胎基因组中。它是哺乳动物最常见的转基因方法，效果稳定，导入时不受DNA分子量的限制。但是，这种方法操作复杂，转基因效率低。

2.反转录病毒感染体 　　反转录病毒是双链RNA病毒，它侵染细胞后可通过自身的反转录酶以RNA为模板在寄主细胞染色体中反转录成DNA。在利用病毒载体转基因时，首先要对病毒基因组进行改造，将外源基因插入到病毒基因组致病区，然后用此病毒感染胚胎细胞，即可对胚胎细胞进行遗传转化。如果在第一次卵裂之前外源DNA整合到胚胎基因组中，可获得转基因动物，在第一次卵裂之后整合，会产生嵌合体，其第二代可能出现转基因动物。

3.胚胎干细胞法 　　 这种方法首先是用外源基因转化胚胎干细胞，通过筛选，把阳性细胞注入受体动物的囊胚中，生产嵌合体动物，当胚胎干细胞分化为生殖干细胞时外源基因可通过生殖细胞遗传给后代，在第二代获得转基因动物。这种方法可对阳性细胞进行选择，实现外源DNA的定点整合。缺点是第一代是嵌合体，获得转基因动物的周期较长。

4.精子载体法 　　　它是利用哺乳动物的获能精子能结合外源DNA的特性，通过受精过程把外源DNA导入受精卵，获得转基因动物。它的优点是方法简单，转基因效率高。缺点是效果不稳定，外源DNA分子可能会受到受精液中内切酶的作用而影响整合后的功能。

5.细胞核移植法 　　 这种方法是随着哺乳动物体细胞核移植技术的发展而建立的。首先用外源DNA对培养的体细胞或胚胎干细胞进行转染，然后选择阳性细胞作供体，通过细胞核移植，获得基因动物。这种方法是非常理想的转基因手段，因为它可与基因打靶技术结合，实现外源基因的定点整合，消除外源DNA随机整合带来的负作用。这种方法的转基因效率可达100%，大大降低转基因家畜的生产成本。但是，这种方法的广泛应用还依赖于体细胞克隆技术的发展，目前还难以实现。

（三）外源ＤＮＡ整合、转录及表达的分子检测 　　1.外源基因的整合检测 　　它是检测动物基因组中是否携带外源DNA。常用的方法是由用目标基因的一段序列作引物，用聚合酶链式反应仪（PCR仪），扩增目标DNA，再通过电泳初步检测是否含有目标基因。然后，用Souehern杂交检测PCR阳性个体是否含有目标基因，如果出现阳性，就可以断定为转基因阳性动物。

2. 外源基因的转录检测 它是用Northern杂交法对转基因动物某一组织的mRNA进行分析检测，出现阳性表明外源基因具有转录活性。 3 2. 外源基因的转录检测 　　它是用Northern杂交法对转基因动物某一组织的mRNA进行分析检测，出现阳性表明外源基因具有转录活性。 3.外源基因的表达检测 　　它是检测转基因动物组织中是否含有目标基因编码的外源蛋白质，常用的方法有酶联免疫法、免疫荧光法和Western杂交法。

(四)基因动物品系或品种的建立 　　 第一代转基因动物是半合子转基因动物，因为外源基因仅在一条染色体上稳定整合。只有通过选种选配，将两个半合子转基因动物成功交配，才能得到纯合子转基因动物，建立转基因动物家系，外源DNA才能在后代中稳定遗传

五、哺乳动物转基因技术存在的主要问题 （一）效率低，成本高 　　在家畜转基因研究中，显微注射后的胚胎不足1%能发育为转基因后代，小鼠和大鼠等实验动物的转基因阳性率也只有3%左右，而且转基因阳性动物中仅50%左右能表达外源基因。

（二）外源基因的随机整合和异常表达 人们对外源DNA整合机理的研究发现外源DNA是随机整合到胚胎基因组中。由于外源DNA自身的重排、突变或受到整合位点附近基因的影响，常出现异位和异时表达或者表达水平低，有的甚至不表达。有的外源DNA整合到胚胎的功能基因中，影响胚胎发育或导致遗传缺陷。这些问题的出现给转基因技术的发展带来了很大障碍。此外，外源DNA能否稳定遗传也是转基因技术面临的严重问题。

第五节 性别控制 　 动物的性别控制（sex control）技术是通过对动物的正常生殖过程进行人为干预，使成年雌性动物产出人们期望性别后代的一门生物技术。性别控制技术在畜牧生产中意义重大。 　　首先，通过控制后代的性别比例，可充分发挥受性别限制的生产性状（如泌乳）和受性别影响的生产性状（如生长速度、肉质）的最大经济效益。 　　其次，控制后代的性别比例可增加选种强度，加快育种进程。通过控制胚胎性别还可克服牛胚胎移植中出现的异性孪生不育现象，排除伴性有害基因的危害。

一、性别控制技术的发展概况 早在2500年前，古希腊的德谟克利特就提出通过抑制一侧睾丸控制后代性别比例的设想。 在20世纪，随着孟德尔遗传理论的重新确立，人们提出性别由染色体决定的理论。 1923年，Painter证实了人类X和Y染色体的存在，指出当卵子与X精子受精，后代为雌性，与Y精子受精，后代为雄性。

二、基本方法 （一）X、Y精子的分离 1.X和Y精子的差异 　　从20世纪50年代开始，人们就对X和Y精子的大小、带电荷数、密度和活力等作了深入比较研究，但是目前发现除了X精子的染色体的含量高于Y精子和Y染色体上特异的SRY序列外，两者在其他方面没有明显差异。

2.X和Y精子的分离 　　 当前X和Y精子较准确的分离方法是流式细胞器分类法，它的理论根据是两类精子头部DNA含量的差异。在家畜中，X精子的DNA含量比 Y精子高出3％～4％。根据这一差异，准确的流式细胞分类仪可对X、Y精子进行分离。

（二）早期胚胎的性别鉴定 运用细胞学、分子生物学或免疫学方法可对哺乳动物附植前的胚胎进行性别鉴定，通过移植已知性别的胚胎可控制后代性别比例。目前胚胎性别鉴定最有效的方法是胚胎细胞核型分析法和SRY-PCR法。

1.核型分析法 　　 它是通过分析部分胚胎细胞的染色体组成判断胚胎性别，有XX染色体的胚胎通常发育为雌性，而具有XY染色体的发育为雄性。其主要操作程序是：先从胚胎中取出部分细胞，用秋水仙素处理使细胞处于有丝分裂中期，再制备染色体标本，通过显微摄影分析染色体组成，确定胚胎性别。这种方法的准确率可达100%，但是取样时对胚胎损伤大，操作时间长，并且获得高质量的染色体中期分裂相很困难，难以在生产中推广应用。目前，核型分析法主要用于验证其他方法的准确性。

2.SRY片段的PCR扩增法　 　　它是近11年发展起来的用雄性特异性DNA探针和PCR扩增技术对哺乳动物早期胚胎进行性别鉴定的一种新方法。其原理和主要操作程序:先从胚胎中取出部分卵裂球，提取DNA，然后用SRY基因的一段碱基作引物，以胚胎细胞DNA为模板进行PCR扩增，再用SRY特异性探针对扩增产物进行检测。如果胚胎是雄性，那么PCR产物与探针结合出现阳性，而雌性胚胎则为阴性。也可以对扩增产物进行电泳，通过检测SRY基因条带的有无判定是雄性或雌性。

这种方法的理论依据是雄性胚胎存在雄性特异性组织相容性抗原(H-Y抗原)，但是这种抗原的分子性质目前尚无定论，因而结果不稳定，准确率也较低。 3.免疫学方法 　　 这种方法的理论依据是雄性胚胎存在雄性特异性组织相容性抗原(H-Y抗原)，但是这种抗原的分子性质目前尚无定论，因而结果不稳定，准确率也较低。

第六节 胚胎干细胞分离培养技术 哺乳动物胚胎干细胞又称ES或EK细胞，它是从早期胚胎中分离出来的具有发育全能性的细胞系。它一方面具有胚胎细胞的特性，在形态上表现为体积小，细胞核大，核质比高，核仁突出，培养时呈克隆状生长；在功能上，它具有发育全能性，即具有分化为成年动物体内任何一种类型细胞的能力。另一方面，它又具有细胞系的特性，可在体外培养繁殖而不发生分化，可进行冷冻保存和遗传改造。

一、胚胎干细胞研究的意义 (一)ES细胞可用于研究哺乳动物个体的发生发育规律 　　由于ES细胞可分化为胚胎内胚层、中胚层和外胚层中任何一种类型细胞，因此可用遗传标记的ES细胞(如标记半乳糖苷酶基因)注入囊胚腔，通过组织化学染色追踪ES细胞的分化特点，探索胚胎发育过程中细胞分化、组织和器官形成的规律。小鼠的ES细胞已成为研究哺乳动物早期发育规律的重要工具之一。

(二)ES细胞可在体外研究细胞的分化规律 　　 ES细胞仅在饲养层细胞上或在添加白血病抑制因子(LIF)或白细胞介素-6(IL-6)的培养液中维持不分化状态。当培养液中添加分化诱导剂，如牛黄酸(RA)、二甲基亚砜(DMSO)、丁酰环腺苷酸和3-甲氧基苯甲酰胺等，可诱导ES细胞发生不同类型的分化，通过研究ES的分化特点可揭示细胞分化和凋亡机理。

(三)ES细胞可用于研究基因的功能 　　 由于ES细胞易进行基因打靶，因此，容易获得基因敲除或定向插入外源基因的ES。用遗传修饰的ES细胞生产嵌合体或克隆后代可研究未知基因的生物学功能。小鼠ES细胞已是基因敲除和基因插入的首选细胞。

ES细胞与普通细胞一样，可通过多种方法把外源DNA插入基因组中。通过筛选的阳性细胞，然后用嵌合体或细胞核移植技术获得转基因动物。

(五)ES细胞可用于治疗人类的某些疾病 　　 人ES细胞的分离成功可能会带来一场医学革命，因为它不仅为某些顽症的治疗带来了希望，同时为新医药的发现和器官移植开辟了新的道路。现代医学研究认为帕金森综合症、少年型糖尿病和痴呆症等是由某一种或几种类型细胞死亡或功能异常导致，这些细胞如果被ES细胞取代，通过诱导分化可修复功能异常的组织或器官。

二、胚胎干细胞研究的历史 1958年，Stevens发现小鼠的畸胎瘤，并把它移植到“129品系”小鼠的精巢或肾脏的被膜下，获得了EC细胞。 1974年Brinster发现在小鼠的囊胚中注射EC细胞能形成嵌合体后代。 1981年，Mintz等发现EC细胞能分化为生殖细胞。 1981年，Evans和Kaufman宣布从延迟着床的小鼠胚胎中分离得到了胚胎干细胞。 1988年Doetschman等建立了仓鼠的ES细胞系。

三、胚胎干细胞分离主要技术环节 (一)选择抑制细胞分化的培养体系 1.饲养层培养体系 　　这种体系要求先在培养皿底部制备单细胞层，即饲养层，然后把胚胎细胞培养在饲养层上。用于制备饲养层的细胞一般分裂缓慢，常用小鼠胚胎成纤维细胞经射线照射或丝裂霉素C处理获得。研究表明饲养细胞能分泌白血病抑制因子(LIF)和分化抑制因子(DIA)等物质，它们能抑制胚胎细胞分化。饲养层培养体系是分离ES细胞广泛采用的方法。

2.条件培养体系 　　 在这种体系中，胚胎细胞直接培养在条件培养液中，不需要制备饲养层。条件培养液实质是一些细胞培养一段时间后再回收的培养液。常用来生产条件培养液的细胞有豚鼠肝脏细胞(BRL)、人膀胱癌细胞和小鼠的EC细胞。这些细胞在生长过程中能分泌白血病抑制因子，因此，条件培养液能抑制胚胎细胞的分化 。

3.培养液中添加分化抑制因子体系 这种方法是将分化抑制因子LIF或白细胞介素-6(IL-6)家族按一定浓度直接添加到细胞培养液中，培养胚胎细胞，建立ES细胞系。这种培养体系不仅方法简单，而且能避免饲养层细胞的干扰和丝裂霉素C对胚胎的毒害作用，发展前景广阔。

(二)早期胚胎的选择 　 为提高分离ES细胞的效率，选择合适阶段的胚胎是非常重要的。动物品种不同，胚胎的发育阶段要求也不同。从已有的资料分析来看，小鼠的桑椹胚、囊胚和延迟着床的囊胚均可分离ES细胞，人和猪的ES细胞可以从囊胚和原始生殖细胞中分离获得，牛、绵羊和家兔的早期囊胚可获得类ES细胞。

(三)胚胎干细胞的分离 分离ES细胞的第一步是获得胚胎内细胞团(inner cellmass，ICM)，然后把ICM分散成单个细胞，再放入分化抑制培养体系中继续培养，以获得ES细胞克隆。

(四)胚胎干细胞的保持 分离得到ES细胞以后，为克服长期培养对细胞遗传物质的影响，需采取一定方法维持ES细胞的未分化状态。目前保持ES细胞的方法有两种：一是常规保持，即通过不断更换培养液，以传代培养方式维持ES的快速繁殖和抑制分化状态；二是冷冻保持，即通过超低温冷冻保存使细胞的代谢活动完全停止，而长期保存，冷冻时，只需在培养液中加入一定浓度的抗冻剂，ES细胞就可在液氮中长期保存。

(五)胚胎干细胞的鉴定 分离出的胎胚细胞除了具有一定的形态特征外，还需要满足几项生化指标，才能初步确定为ES细胞。主要包括细胞中有较高水平的端粒酶(telomerase)和碱性磷酸酶(AKP)以及细胞表面出现的阶段特异性胚胎抗原(SSEA)。端粒酶和碱性磷酸酶活性检测可用专门试剂盒进行，SSEA可通过免疫组化或免疫荧光检测。

(六)胚胎干细胞的分化潜力验证 ES细胞除了具有形态和生化特征外，还必须具有高度分化潜能。ES细胞被注入囊胚腔后，它必须能参与内胚层、中胚层和外胚层的形成。在体外培养时，分化诱导剂可诱导ES细胞定向分化。只有以上功能完全具备，分离出的胚胎细胞才能最终确认为ES细胞。

第七节 哺乳动物嵌合体的生产 一、概念 在现代生物学中，嵌合体是指由基因型不同的细胞构成的复合个体，它包括种内和种间嵌合体。

早在1901年Spemann就在两栖动物中开始培育嵌合体的研究，以探索两栖动物胚胎发育规律。 二、嵌合体技术的发展概况 早在1901年Spemann就在两栖动物中开始培育嵌合体的研究，以探索两栖动物胚胎发育规律。 1965年，Mintz等才得到小鼠嵌合体后代。 20世纪70年代以后，哺乳动物嵌合体技术发展迅速。

三、哺乳动物嵌合体的生产方法 （一）卵裂球聚合法 　　它是把不同遗传性能而发育阶段相同或相近的胚胎卵球聚合在一起获得嵌合体的方法，胚胎发育阶段在8-细胞至桑葚胚阶段操作较为理想。操作时先用链霉蛋白酶去除透明带，将两枚或两枚以上胚胎的卵裂球聚合在一起形成复合体，再经过一段时间培养后形成嵌合体胚胎，然后移植到受体内继续发育为嵌合体。对妊娠识别需要透明带的动物来说，卵裂球的聚合可放在一个空透明带中进行。聚合法操作简单，但是嵌合体生产效率低

(二)囊胚注射法 它是把一种或多种胚胎的卵裂球、内细胞团细胞、EC细胞、ES细胞或内细胞团直接注射到另一枚囊胚的腔隙中获得嵌合体的方法。操作时，首先要准备注入的细胞或细胞团，即供体细胞，再用显微操作仪把供体细胞注入囊胚腔，然后把胚胎移人受体内继续发育为嵌合体。这种方法虽然操作复杂，但生产嵌合体的效率很高，已成为生产嵌合体的主要方法。

四、嵌合体的鉴定 　 是通过外观观察、生化或分子检测确定后代是否为嵌合体。外观法是通过观察后代的肤色或毛色变化确定是否为嵌合体，这种方法直观，但在选择动物品种时，要求观察指标对比明显。生化分析法主要通过测定嵌合体血液或组织中同工酶的变化确定后代的嵌合情况，目前常用的是分析磷酸葡萄糖异构酶的表达情况。随着分子生物学的发展，可通过DNA指纹分析后代体细胞的遗传组成，这种方法快速准确。