第十三章 克隆动物

克隆羊多利（Dolly）的诞生 1997年2月，英国Roslin研究所宣布克隆羊多利（Dolly）的诞生揭示一个全新概念：由成年机体的一个体细胞核，可以复制一个基因完全相同的新生命个体。 是克隆技术的里程碑。 克隆一词变得家喻户晓

克隆来源于英语“clone”或“cloning”的音译，起源于希腊文“Klone”，原意是用“插条”繁殖。曾译为无性生殖或无性繁殖. （1） 克隆来源于英语“clone”或“cloning”的音译，起源于希腊文“Klone”，原意是用“插条”繁殖。曾译为无性生殖或无性繁殖.

动物克隆 动物克隆是指通过无性繁殖的手段，从一个动物细胞获得遗传背景相同的个体群的过程。 获得的个体群称为克隆动物（cloned animal）

动物克隆的研究历史 1、最初用胚胎分割的方法获得克隆动物。 2、同卵双生或孤雌生殖的方式获得克隆动物。 3、通过核移植获得克隆动物，但开始仅限于胚胎细 胞和胎儿细胞的克隆。 4、1997年，克隆羊多莉的诞生，标志着体细胞克隆 的成功。 5、现有多种体细胞克隆动物诞生，如牛、猪、老 鼠、猫、羊、兔、猫、狗等。

1998年1月，美国威斯康星一麦迪逊大学的科学家们以牛的卵子为受体，成功克隆出猪、牛、羊、鼠和猕猴五种哺乳动物的胚胎，这一研究结果表明，某个物种的未受精卵可以同取自多种动物的成熟细胞核相结合。 1999年，美国科学家用牛卵子克隆出珍稀动物盘羊的胚胎；我国科学家也用兔卵子克隆了大熊猫的早期胚胎， 在异种克隆研究领域，目前国际上仅有印度野牛和欧洲盘羊取得成功。到目前为止应用异种核移植技术获得的活体后代都来自于亚种间核移植。 中国首例异体克隆动物———濒危动物北山羊在新疆乌鲁木齐县六十户乡降生

获得克隆动物的方法 1.胚胎分割 2.孤雌生殖 3.细胞核移植

1.胚胎分割 胚胎分割（embryo splitting）是指采用机械方法用特制的纤维刀片或玻璃微针将早期胚胎分割成2等分、4等分或 多等分，再移植给受体母畜，从而获得同卵多仔的一项胚胎工程技术。

                                                              胚胎分割—— 一卵双生

胚胎分割—— 一卵双生

2.孤雌生殖 孤雌生殖（parthenogenesis）:指卵子不经受精，直接发育为个体的繁殖方式。 如：蚜虫、鱼类、两栖类、爬行类、鸟类

蜥蜴

蚜虫

问 题 在哺乳动物胚胎发育过程中，细胞发生了分化，但是在适宜环境下，已分化的细胞能否重新恢复到发育的起始状态，再重新发育成其它类型细胞组织的多能性，甚至发育成完整个体的全能性呢？细胞的分化是不是发生了不可逆的变化？

1935 Nobel Laureate in Medicine HANS SPEMANN                                                    1935 Nobel Laureate in Medicine for his discovery of the organizer effect in embryonic development. 1869-1941 Residence: Germany Affiliation: University of Freiburg im Breisgau                              德国胚胎学家Spemann提出通过核移植可以验证不同发育阶段 和不同分化程度的细胞核是否具有全能性。

3.细胞核移植 细胞核移植（nuclear transfer）是指将早期胚胎细胞、胎儿细胞或成体动物的细胞核移植到去核的卵母细胞中，重新组成重构胚（reconstructed embryo）或克隆胚（cloned embryo）并使之发育成成体动物的过程。

提供细胞核的细胞称为----核供体（donor） 接受细胞核的细胞称为----核受体（recipient） 核供体：胚胎细胞、胎儿细胞、体细胞（somatic cell） 核受体：早期胚胎细胞、受精卵、MII期卵母细胞

核移植的机理 供体细胞的细胞核移入卵母细胞后，在卵母细胞相关因子的作用下，发生了重编程回复到发育的起点状态。 核重编程的过程就是使在体细胞中被关闭,而在正常胚胎发育中表达的基因重新被激活的过程.

重编程有三种可能的结果 （1）供核基因组完全没有进行重编程 重构胚很快死亡； （2）部分重编程,重构胚在不同的发育 阶段死亡 ； （3）完全重编程,产生正常的克隆动物。

细胞核移植分类 根据核供体细胞来源的不同 1.胚胎细胞核移植 2.胎儿细胞核移植 3.体细胞核移植（SCNT） 根据供体细胞与受体细胞是否来源于同一种动 物又可将其分为 1.同种核移植 2.异种核移植

显微操作仪（micromanipulator）

胚胎细胞核移植 胚胎细胞核移植 (embryo cell unclear transplantation)是指，将一个早期胚胎的细胞核移植到去核的卵母细胞中，构建新合子的生物技术。

胚胎细胞核移植流程图

历史回顾 1938年Spemann提出设想：分化了的细胞核移入卵子中能否指导胚胎发育？ 1952年Briggs和King在两栖动物证实了Spemann提出的设想：利用已分化的蛙囊胚细胞核移植到去核的蛙卵母细胞中，得到了重新发育的结果，从而证明了不同时期的胚胎细胞核在相同的卵质中具有重新发育的能力，在特定条件下，可以恢复其发育的全能性。

1981年，瑞士日内瓦大学的伊尔门泽、美国杰克逊实验室，首次对小鼠胚胎细胞进行核移植获得成功。 此后，胚胎细胞的核移植在多种动物上获得了克隆后代，如绵羊(Willadsen等,1986),牛(Prather等,1987),兔(Stice等,1988),猪(Prather等,1989),山羊(张勇等,1991)等。 直到1997年才由 Meng et al成功地克隆出两只猴,这是灵长类动物的首次被克隆。

直至此时,核移植所用的供体细胞均为囊胚阶段以前的胚胎细胞。当时人们普遍认为，早期胚胎尚具有全能性，到囊胚以后则随着分化而逐渐丧失其全能性。

极体 极体 卵周腔 透明带 卵裂球 1. 雌原核与雄原核形成 2. 雌原核与雄原核融合 3. 卵裂开始 4. 2细胞期 内细胞群 受精卵 透明带 卵裂球 1. 雌原核与雄原核形成 2. 雌原核与雄原核融合 3. 卵裂开始 4. 2细胞期 内细胞群 5. 4细胞期 6. 8细胞期 7. 桑椹胚 胚泡腔 滋养层 8. 囊胚

体细胞核移植技术 -------动物克隆技术的里程碑

体细胞核移植 体细胞核移植技术(somatic cell unclear transplantation)是指，将分化程度较高的体细胞移植入去核的卵母细胞中构建新合子的生物技术。

历史回顾 1996年，世界第一例从成年动物细胞克隆出的哺乳动物绵羊多莉诞生。这个秘密直到1997年2月才向世人公布。 1997年7月，苏格兰科学家在实验室内将一个人类基因导入绵羊体细胞，克隆了带有人类基因的绵羊“波莉”。

此后，体细胞核移植技术在牛、山羊、猪等多种动物获得成功。 1998年7月，美国夏威夷大学Wakayama等报道，由小鼠卵丘细胞克隆了27只成活小鼠，其中7只是由克隆小鼠再次克隆的后代，这是继“多莉”以后的第二批哺乳动物体细胞核移植后代。 此后，体细胞核移植技术在牛、山羊、猪等多种动物获得成功。 至1999年底，全世界已有6种类型细胞——胎儿成纤维细胞、乳腺细胞、卵丘细胞、输卵管／子宫上皮细胞、肌肉细胞和耳部皮肤细胞的体细胞克隆后代成功诞生。

多莉的诞生过程

体细胞核移植程序 受体卵母细胞的准备 核供体细胞的准备 去核卵母细胞 细胞周期调控后的体细胞 装核 重构胚的激活 重构胚的培养 融合后形成重构胚 移植给代孕动物

1.核供体细胞的准备 常用的体细胞有： 卵丘细胞 颗粒细胞 皮肤成纤维细胞 细胞在体外一般在体外传代8-16次

A 组织块培养的人皮肤成纤维细胞 B 消化培养的人皮肤成纤维细胞

2.细胞周期的调控 1.血清饥饿法 2.Aphidicolin（阿菲迪霉素）法 3. 激活卵母细胞法

3.受体细胞准备 目前为止，有三类用于核移植产生了后代 第一类是去除原核的受精卵 第二类是早期胚胎； 第三类即是MⅡ期的卵母细胞。

4.去核的方法 1.盲吸法 2.半卵法 3.荧光引导核法 4.微分干涉显微镜去核法 5.功能性去核法 6.离心去核法 7.末期去核法

去核举例 盲吸去核法一般将脱去颗粒细胞的卵母细胞用含7.5ug/ml CB的培养液中清洗3-4遍后移入100ul左右的上述溶液的液滴中，同时将供体细胞加入液滴中。石蜡油覆盖后于显微操作仪上用固定针吸住卵母细胞，用去核针拨动之，使第一极体位于1点位置；去核针从3点处进针，针尖斜面部分刺入卵泡内，吸出第一极体及其下方的1/4-1/3胞质（包括细胞核）；然后从操作液中吸取形态圆，边缘略粗糙的核供体细胞，从原针吸口处注入透明带下并轻压透明带。

MII期卵母细胞

去 核 过 程

5.装核 将准备好的体细胞放入去核卵母细胞的过程。 将体细胞放入带下

图2 核移植的显微操作过程 A 显微注射针刺入卵母细胞前 B开始吸取第一极体 C 极体已被吸入注射针 D 去除极体后的卵母细胞 E 注射供体细胞 F 供体细胞已被注入透明带下

直接注射法

细胞融合的方法有： 病毒介导融合 化学融合 电融合 6.细胞融合 细胞融合的方法有： 病毒介导融合 化学融合 电融合

电融合举例 利用电穿孔的原理来使细胞融合。为使供/受体细胞的接触面与电场方向垂直,更有利于融合,可在待融的供/受体复合物移入两微电极丝所组成的融合小槽内后用一次交流脉冲或手工排步的方式来达到这一目的。

卵母细胞与体细胞电融合过程

7.重构卵激活 正常情况下,受精过程中，精子进入卵子后,卵母细胞质中会出现一系列的反应,如游离Ca2+ 浓度增高、母源性的mRNA启动转录、MPF等因子活性下降等。这些反应是卵母细胞被激活的标志，不经过这些变化,胚胎就不能正常发育。 核移植过程中的激活就是模仿受精过程中精子的刺激作用。 目前，激活的方式有电激活、化学激活和注射精子因子激活三种。 化学激活常用药品有：钙离子载体（A23187）、7%乙醇、离子霉素、6-DMAPSrCl2

8.重构胚的培养 重构胚移入受体之前的培养方法有体外培养和体内培养两种方法。体外培养法相对要简单、方便的多。 目前为大部分核移植所采用。

重构胚体外发育图

人类体细胞核移植技术

历史回顾 2001年，美、意科学家联手展开克隆人的工作。 2001年11月美科学家宣布首次克隆成功了处于早期阶段的人类胚胎，称其目的是为病人“定制”出不会诱发排异反应的人体组织器官，用于移植。 2004年2月11日，美国 《科学》 杂志宣布， 汉城国立大学研究小组成功克隆出人类早期胚胎，并从中提取出胚胎干细胞。 由于法律的限制，人的克隆仅限于治疗性克隆。

治疗性克隆 技术途径包括以下几个步骤： 首先取病人体细胞核，移植到去核的成熟受体卵母细胞； 在早期胚胎形成后，从中分离获得人ES细胞； 将定向分化后的细胞移植给病人。

治疗性克隆流程图

生殖性克隆流程图

人类体细胞核移植存在的问题 在人类，由于伦理等原因，卵母细胞的获得比较困难，这就给体细胞核移植技术在人类医疗方面的应用带来很大的限制，限制了核移植技术为人类服务的初衷。

解决办法 异种核移植

将人的体细胞作为核供体，另一种动物的卵母细胞为受体细胞而进行的核移植技术。 异种核移植 将人的体细胞作为核供体，另一种动物的卵母细胞为受体细胞而进行的核移植技术。 去核 人体细胞 动物卵母细胞 异种克隆胚

胞核的新西兰兔卵母细胞融合，获得了人类早期胚胎。 上海第二医科大学 陈莹博士 2003年，她将一5岁男孩的包皮细胞与已去除细 胞核的新西兰兔卵母细胞融合，获得了人类早期胚胎。

人兔异种核移植的焦点问题 1. 非人类哺乳动物卵母细胞可否对 人体细胞核进行重编程？

2. 核移植中线粒体的命运 哺乳动物核移植中,无论采用电融合法还是胞质内注射法构建重构卵,都不可避免地会把部分供体线粒体带入受体卵胞质。两种来源的线粒体在重构胚的各阶段发育中到底会有什么样的变化一直是科学家们研究的热点。

克隆技术的应用 干细胞生产 复制人体器官，即治疗性克隆 扩大优良畜群、转基因动物的数量 拯救濒危野生动物 为细胞生物学、遗传学等学科提供实验手段和遗传均质的实验动物

克隆技术存在的问题     尽管克隆技术有着广泛的应用前景，但离产业化尚有很大距离。因为作为一个新兴的研究领域，克隆技术在理论和技术上都还很不成熟，在理论上，分化的体细胞克隆对遗传物质重编（细胞核内所有或大部分基因关闭，细胞重新恢复全能性的过程）的机理还不清楚；克隆动物是否会记住供体细胞的年龄，克隆动物的连续后代是否会累积突变基因，以及在克隆过程中胞质线粒体所起的遗传作用等问题还没有解决。