第六章　基因的转移与重组体的 　　　　筛选和鉴定

第一节 DNA的体外重组 DNA的体外重组：将目的基因与载体连接，这种重新组合的DNA称为重组DNA。 一、粘性末端的连接 DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与3’-OH连到一起 单酶切、双酶切

二、平末端（blunt end）的连接 （一） 直接连接 T4 DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1~10%。 5’ 5’ P- -OH 3’ P- -OH 3’ HO- 3’ HO- -P 3’ -P 5’ 5’ 5’ P- -OH 3’ -P 3’ HO- 5’

（二） 人工加尾形成 “粘性末端” （1）同聚加尾法 ① 原理： DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸。 ② 加尾－碱基互补 分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。

③优点： 能把任何片段连接起来 ④缺点： 操作繁琐； 外源片段难以回收； 同聚物尾巴影响外源基因表达。 非酶切位点

（二） 人工加尾形成 “粘性末端” （2）衔接物（linker）连接 Linker： 用化学合成法合成的一段10-12bp的，具有一个或数个限制性内切酶识别位点的平末端双链寡核苷酸 GGAATTCC CCTTAAGG EcoR I linker：

（1）多核苷酸激酶处理 （2）T4连接酶连接 （3）限制性内切酶消化 （4）目的片段与载体连接

（3）DNA接头 （adapter）连接法 （二） 人工加尾形成 “粘性末端” ① adapter 一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列） P- 5’p-GATCCCGG-OH3’ 3’HO-GGCC-p5’ -P Blunt-ended DNA BamHI adapter 5‘p-GATCCCGG- GGCC- -CCGG -GGCCCTAG-P5’

接头与接头以粘末端连接，影响与DNA片段的连接 ② 优点： 连上后就能用。 ③ 缺点： 接头与接头以粘末端连接，影响与DNA片段的连接 CCGG GGCCCTAG-p5’ 5‘p-GATCCCGG- GGCC- ④ 防止自我连接 先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其5’端的磷酸，防止自我连接。

虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接 T4多核苷酸激酶处理使5’磷酸化 5’p-GATCCCGG-3’ GGCC-p5’ BamHI adapter CIP处理 Blunt-ended DNA P- -OH 5’HO-GATCCCGG3’ GGCC-OH5’ HO- -P T4 ligase nick缺口 5’HO-GATCCCGG- GGCC CCGG -GGCCCTAG-OH5’ nick缺口 虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接 T4多核苷酸激酶处理使5’磷酸化

三、PCR产物的连接 1.在引物的5’端设计酶切位点 （1）设计原则 符合载体的多克隆位点； 避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。 （2）带酶切位点的引物的结构 3’端15～20bp与模板互补； 5’端内切酶识别序列＋保护碱基

三、PCR产物的连接 1.在引物的5’端设计酶切位点 请设计一对PCR引物，在N端和C端分别加一个EcoRI（GAATTC，保护碱基GCA）和BamHI酶切位点（GGATCC，保护碱基CGC），另外，各含有18个同该基因同源的核苷酸，能够用于扩增该基因的编码序列。写出P1和P2的引物序列。

带酶切位点的PCR产物 5’- PCR产物 -3’ GCAGAATTC GGATCCGCG 3’- CGTCTTAAG PCR产物 CCTAGGCGC -5’ EcoR I位点 BamH I位点 EcoR I BamH I PCR产物 AATTC G -3’ 5’- PCR产物 -5’ 3’- G CCTAG 两头各有一个粘性末端！

2. 与T载体直接连接 三、PCR产物的连接 PCR产物 载体 dNTP Taq DNA聚合酶 dTTP A T A T TA TA

噬菌体位点特异性重组系统； 高效的实现DNA序列在多种载体系统的转移。 三、Gateway 载体构建系统 噬菌体位点特异性重组系统； 高效的实现DNA序列在多种载体系统的转移。 入门克隆 改造过的各种表达载体 在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。一旦您拥有了一个入门克隆，就可以多次使用它，转移您的目的基因到Gateway改造过的各种表达载体

√ 三、Gateway 载体构建系统 （1）创建入门克隆 BP反应：attB+attP attL+attR，产物：入门克隆 入门克隆 改造过的各种表达载体 √ 在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。一旦您拥有了一个入门克隆，就可以多次使用它，转移您的目的基因到Gateway改造过的各种表达载体

√ √ 三、Gateway 载体构建系统 （2）构建表达克隆 LR反应：attL+attR attB+attP，产物：表达克隆 入门克隆 改造过的各种表达载体 √ 在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。一旦您拥有了一个入门克隆，就可以多次使用它，转移您的目的基因到Gateway改造过的各种表达载体 √

第二节 重组体导入受体细胞 一、重组DNA导入大肠杆菌 （一）转化（transformation） 大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。 第二节 重组体导入受体细胞 一、重组DNA导入大肠杆菌 （一）转化（transformation） 大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。 （二）转导（transduction） 借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。 （三）转染（transfection） 受体菌直接捕获噬菌体DNA的过程。

（一）转化（transformation） （1）热激法（heat shock） （2）电转化法（electronporation） （3）PEG介导的原生质体转化 （4）接合转化

（1）热激法 制备感受态细胞 ① 目的 增加受体菌细胞膜的通透性 感受态细胞：处于能吸收外源DNA分子的生理状态的细胞

② CaCl2法制备感受态细胞转化DNA的原理 （1）热激法 制备感受态细胞 ② CaCl2法制备感受态细胞转化DNA的原理 1、将处于对数生长期的细菌置于0℃的CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，处于感受态； 2、将感受态细胞与DNA混合，Ca2+与DNA结合形成抗DNase的羟基-磷酸钙复合物，粘附于细胞表面； 3、经42℃短时间热激处理，细胞吸收DNA复合物； 4、在培养基中生长数小时之后，球形细胞复原并增殖。

操作步骤：　　（p140） 10ng 载体DNA 吸附DNA 摄入DNA 冰浴30min 42℃ 1~2min 100L 感受态细胞 加入1mL LB培养基 （Amp-） 10-100L转化液涂Amp＋平板 37℃ 振荡培养1h 转化率：106-108/g DNA

（2）电转化法 　　原理：在高压脉冲下，细菌细胞表面形成暂时性微孔，重组DNA通过微孔进入细胞后，脉冲结束，细胞恢复原状。 　　实验简单，不需要制备特殊的感受态细胞 　 “感受态”：清洗处理，在低温下使细胞处于无离子区且有甘油或蔗糖等保护剂的悬液中，保证电击过程中细胞不被击穿而死亡。 转化率：109~1010/ g DNA

体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，形成噬菌斑。 现在把DNA转移至动物细胞的过程也称转染 （二） 转　导 由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息的转移过程 体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，形成噬菌斑。 每g DNA能形成106个噬菌斑 （三） 转　染 噬菌体DNA不经过蛋白包装成病毒颗粒，直接被感受态细胞捕获的过程。 与转化无本质区别 现在把DNA转移至动物细胞的过程也称转染

体外包装过程

二、重组DNA导入真核细胞 （一）导入酵母细胞 （二）导入植物细胞 （三）导入动物细胞 原生质体转化 碱金属离子介导的完整细胞转化 PEG1000转化法 电击法 （二）导入植物细胞 （三）导入动物细胞

转化细胞达原生质体总数的1%~2%，转化率受再生率影响 1. 利用原生质体进行转化 CaCl2 PEG 酶去壁 原生质体 感受态 酵母 转化 插入外源基因的载体 转化细胞达原生质体总数的1%~2%，转化率受再生率影响 共转化的原生质体占转化子总数的25%~33% 共转化：将两个以上的基因同时导入感受态细胞的方法

吸收线性DNA能力明显大于环状DNA，两者相差80倍 2. 碱金属离子介导的完整细胞转化 热激 0.1mol/L LiCl处理 感受态 酵母 插入外源基因的载体 40% PEG 4000 涂布选择性平板，筛选转化子 吸收线性DNA能力明显大于环状DNA，两者相差80倍 转化率：103个 / g DNA；共转化现象极少

3. PEG1000转化 PEG处理酵母细胞，可获得类感受态，用于转化 4. 电击转化 （1）适于原生质体和完整细胞 （2）转化率高，105个 / g DNA （3）单链转化率高于双链

二、重组DNA导入真核细胞 （一）导入酵母细胞 （二）导入植物细胞 （三）导入动物细胞 载体介导的转化（农杆菌介导） 种质系统法（花粉管通道法等） （三）导入动物细胞

（二）导入植物细胞 1. 农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法 将目的基因插入到载体的T-DNA区，形成重组DNA 先将实验材料(如烟草)的叶子表面进行消毒,再用消毒过的不锈钢打孔器从叶子上取下圆形小片,即叶盘.为了对叶盘进行接种处理,需将它放在土壤农癌杆菌培养液中浸泡4~5min,然后用滤纸吸干,放在看护培养基上进行培养 将目的基因插入到载体的T-DNA区，形成重组DNA

（二）导入植物细胞 1. 农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法 将重组DNA转入含有Vir致病基因的农杆菌 先将实验材料(如烟草)的叶子表面进行消毒,再用消毒过的不锈钢打孔器从叶子上取下圆形小片,即叶盘.为了对叶盘进行接种处理,需将它放在土壤农癌杆菌培养液中浸泡4~5min,然后用滤纸吸干,放在看护培养基上进行培养 将重组DNA转入含有Vir致病基因的农杆菌

（二）导入植物细胞 1. 农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法 通过农杆菌侵染植物外植体 先将实验材料(如烟草)的叶子表面进行消毒,再用消毒过的不锈钢打孔器从叶子上取下圆形小片,即叶盘.为了对叶盘进行接种处理,需将它放在土壤农癌杆菌培养液中浸泡4~5min,然后用滤纸吸干,放在看护培养基上进行培养 通过农杆菌侵染植物外植体

（二）导入植物细胞 1. 农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法 将含有外源目的基因的T-DNA整合到植物细胞基因组中，获得转基因植株 先将实验材料(如烟草)的叶子表面进行消毒,再用消毒过的不锈钢打孔器从叶子上取下圆形小片,即叶盘.为了对叶盘进行接种处理,需将它放在土壤农癌杆菌培养液中浸泡4~5min,然后用滤纸吸干,放在看护培养基上进行培养 将含有外源目的基因的T-DNA整合到植物细胞基因组中，获得转基因植株

叶盘法的具体操作 在饲养平皿的滤纸上培养2天 先将实验植物材料，例如矮牵牛的叶片进行表面无菌消毒，用经过消毒的无菌不锈钢打孔器从叶片上取下圆形小片，即所谓叶盘，然后接种上含有重组Ti质粒的根瘤土壤杆菌。这种经接种处理的叶盘，在饲养平皿的滤纸上培养2天后，将滤纸连同叶盘转移到含有适量的卡那霉素的“长芽”培养基(shooting emdium)中，进行筛选与再生，接着再转移到“生根培养基”(rooting medium)上诱导幼芽生根，最后将小植株移栽在土壤中 ，叶盘转化法适用性广，对那些能被根瘤土壤杆菌感染的、并能从叶片外植体再生植株的各种植物都可适用。这种方法操作方便简单，获得转基因植株的周期短并具有很高的重复性，便于在实验室内进行大量常规培养。 共培养法，是指将毒性的根瘤土壤杆菌，同刚刚再生出新细胞壁的原生质体作短暂的共同培养，以便促使植物细胞发生转化。

又称生物弹击法、微弹轰击法，借助高速金属微粒将DNA分子引入活细胞的转化技术。 2. 基因枪法（gene gun） 又称生物弹击法、微弹轰击法，借助高速金属微粒将DNA分子引入活细胞的转化技术。 DNA 1.2m钨弹头 吸附 基因枪 装入 外植体制备 轰击 此法的基本原理是，将包裹着DNA的金粒或钨粒，通过基因枪(gunpowder)、氦气 (helium gas)或电击(electric discharge)等技术来获得足够的加速度，射入完整的植株、组织外植体(tissue explants)、愈伤组织或细胞悬液。 生物弹击法的操作对象可以是完整的细胞或组织，突破了基因转移的物种界限，也不必制备原生质体，实验步骤比较简单易行，具有相当广泛的应用范围，已经成为研究植物细胞转化和培养转基因植物的最有效的手段之一 外植体培养及选择 金属微粒加速，进入受体细胞

1. DNA微弹的制备 2. 外植体的制备 3. DNA微弹轰击 4. 外植体的培养 具体操作

3. 电击法（电穿孔法） 纤维素酶和果胶酶 植物细胞 原生质体 DNA 混合入 电击缓冲液 电击处理 选择培养 分化 愈伤组织 幼苗

二、重组DNA导入真核细胞 （一）导入酵母细胞 （二）导入植物细胞 （三）导入动物细胞 1. 磷酸钙沉淀法 2. 脂质体介导法 3. 显微注射法 4. DEAE-葡萄糖转染法

（三）导入动物细胞 1. 磷酸钙沉淀法 原理： 通过磷酸钙-DNA共沉淀，将外源基因导入哺乳动物细胞 1. 磷酸钙沉淀法 原理： 通过磷酸钙-DNA共沉淀，将外源基因导入哺乳动物细胞 依据不同的细胞类型，平皿上最多能有10%的细胞能吸收DNA沉淀。

操作简便，成本低廉、可大批量转染、对细胞毒性小、效果稳定，但转染效率低。

2. 脂质体介导法 脂质体包埋DNA，通过细胞膜进入细胞。

3. 显微注射法 应用玻璃显微注射器，直接把外源DNA注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。 1）外源基因制备：线性化的质粒或目的片段 2）收集受精卵：受孕后几小时内 3）显微注射：将外源基因注入受精卵的雄原核 4）受精卵移植

精子进入卵细胞后，尾部消失，头部变圆膨大，形成雄原核；卵细胞完成第二次有丝分裂后，其细胞形成雌原核。雄原核与雌原核接触，各自的核股消失、融合，二性染色体在其后的台子分裂中混合、配对，受孕宣告结束，一个新生命宣告开始。受精过程约需24小时。

4. DEAE-葡萄糖转染法 二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖为多聚阳离子试剂，能促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。 葡聚糖 葡聚糖

4. DEAE-葡萄糖转染法 DEAE-dextran 细胞 混合 外源DNA 吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分DNA可以进入到细胞核里。 DEAE-dextran对细胞有毒，常采用低浓度长时间处理

三、转化率及影响因素 转化率（cfu / μgDNA）：每微克重组DNA转化后，接纳DNA分子的受体细胞的个数，即阳性克隆数。 （一）转化率的计算： 转化率 ＝ 产生菌落的总数 / DNA的加入量

三、转化率及影响因素 例：取1μl（0.1 ng/μl）完整的质粒转化100μl的感受态细胞。向转化反应液中加入900μl培养液，让细菌恢复一小段时间，取100μl铺板。培养过夜，产生1000个菌落，转化率为多少？ 转化率＝1000 / 0.01 ng DNA = 108 cfu /μg

三、转化率及影响因素 例：某一DNA重组实验的重组率为20%，转化率为107 cfu / mg 天然载体，经酶切和连接处理后的重组载体转化率比天然载体约低100倍，欲获得104个重组克隆，需要投入多少重组载体DNA进行重组实验？ 104 ＝ 107 cfu / mg ×10-2 × a × 20% 重组载体 a = 0.5 mg

三、转化率及影响因素 普通的亚克隆实验：1×10 6 cfu/μg DNA； 更复杂的亚克隆：1×107 cfu/μg DNA，如有限量的DNA的转化，T-A克隆； 构建文库：> 1×108 cfu/μg DNA。

三、转化率及影响因素 （二）转化率的影响因素 1）载体DNA类型、大小；重组DNA浓度、纯度 2）受体细胞 3）转化方法：同一转化方法技术参数影响转化率

第三节 重组子的筛选与鉴定 一、载体表型选择法 二、根据插入基因的表型选择 三、DNA电泳检测法 四、PCR检测法 五、核酸杂交检测法 第三节 重组子的筛选与鉴定 一、载体表型选择法 二、根据插入基因的表型选择 三、DNA电泳检测法 四、PCR检测法 五、核酸杂交检测法 六、免疫化学检测法 七、DNA序列分析

一、载体表型选择法 1. 抗药性标记及其插入失活选择法 pBR322质粒上有两个抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。

2. -半乳糖苷酶显色反应选择法 -半乳糖苷酶 X-gal 5-溴-4-氯靛蓝 半乳糖 + 深蓝色

-半乳糖苷酶使X-gal分解成蓝色产物。

二、根据插入基因的表型选择 利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。 1. 弥补缺陷 转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。 URA3、HIS3、LEU2、TRP1、LYS2 受体菌： his- 在不含组氨酸的培养基中生长 外源基因： his+

2. 增加新性状 使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。 例：抗生素抗性 抗性基因 载体 抗生素培养基平板 转化 受体菌 连接 外源DNA 含抗生素抗性基因的 克隆才能生长

三、 DNA电泳检测法 1. 直接电泳检测法 有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。 重组克隆 Marker 载体 1. 直接电泳检测法 Marker 载体 从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。

2. 酶切电泳筛选法 根据外源DNA序列的限制性酶切图谱，选一两种内切酶切割，电泳后比较电泳结果：DNA带数和长度。 单 2. 酶切电泳筛选法 根据外源DNA序列的限制性酶切图谱，选一两种内切酶切割，电泳后比较电泳结果：DNA带数和长度。 单 一般用重组时的内切酶将外源DNA切出 双

四、PCR扩增检测法 应用PCR反应扩增出预期DNA片断 （1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）； （2）用外源DNA插入片断引物作PCR； （3）凝胶电泳； （4）是否有条带产生，条带大小是否正确。

五、核酸杂交检测法 1. Southern blotting 从宿主细胞中提取DNA，用探针杂交。

2. Northern blotting 从宿主细胞中提取RNA，用探针杂交。 主要检测插入片断是否被转录。

在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测胶上的蛋白质泳带。 3. Western blotting 点样 在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测胶上的蛋白质泳带。 电泳方向 ①（SDS-PAGE）

膜 胶 蛋白 ② 转膜 3. Western blotting ③ 杂交 待测蛋白 硝酸纤 维素膜 一抗 二抗 ④ 检测

4. 原位杂交筛选

六、免疫化学检测法 对表达产物的检测。蛋白－蛋白“杂交” 放射性抗体检测 与菌落杂交相似 利用抗体作为“探针”，检测产生外源DNA编码的抗原的菌落或噬菌斑。

七、DNA序列分析 DNA测序是最为准确的重组子鉴定方法，可以鉴定重组克隆序列是否准确无误。

植物转化体报告基因（reporter gene)筛选 报告基因：基因载体上引入的一些可证明载体已经进入宿主细胞，并可将含有目的基因的宿主细胞从其他细胞中识别区分甚至挑选出来的具有特殊标志意义的基因。 （1）大肠杆菌的β-D-葡萄糖醛酸糖苷酶 （β-D-glucuronidase，GUS）； （2）细菌和萤火虫的荧光素酶 （Luciferase）； （3）水母绿色荧光蛋白（GFP）基因 （Green Fluorescent Protein）。 Gus (b-glucuronidase)基因作为一种报告基因，在植物遗传转化研究中有广泛的用途。Gus基因来自于大肠杆菌，编码b－葡聚糖苷酶（一种水解酶），可催化底物5－溴－4－氯－3－吲哚葡聚糖醛酸苷（5－bromo-4-chloro-3-indolyl-glucronide，缩写为X－Gluc）分解，产生肉眼可见的深兰色化合物，借此用来观察转基因植物中外源基因的表达情况，鉴定转基因植株。

进行基因工程操作的一般步骤 ? （1）获得目的基因； （2）目的基因与载体的酶切与连接； （3）将目的基因导入受体细胞； （4）转化受体细胞的大量繁殖； （5）目的基因的检测和表达。 Gus (b-glucuronidase)基因作为一种报告基因，在植物遗传转化研究中有广泛的用途。Gus基因来自于大肠杆菌，编码b－葡聚糖苷酶（一种水解酶），可催化底物5－溴－4－氯－3－吲哚葡聚糖醛酸苷（5－bromo-4-chloro-3-indolyl-glucronide，缩写为X－Gluc）分解，产生肉眼可见的深兰色化合物，借此用来观察转基因植物中外源基因的表达情况，鉴定转基因植株。

思 考 题 1、什么是感受态细胞？简述CaCl2法制备感受态细胞转化DNA的原理 ？ 2、什么是Ti质粒？简述农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法。 3、重组子筛选主要有哪些方法 ？