生物技术概论 第四章:发 酵 工 程 Fermentation Engineering

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资料1: 火山口海底10000米,暗无天日,不断冒出滚滚的H2S气体。在这样的世界里,生活着一种微生物---硫细菌。硫细菌可以不断氧化H2S获得能量,而且可以利用周围的CO2合成自身生命活动所需的有机物…… 资料2: 作为生活能源的石油和天然气深埋地下,勘探专家可以用各种方法检测土样、水样、岩芯等样品中的某类微生物的数量,预测石油和天然气的储藏分布地点和数量,这种方法称为微生物石油勘探。微生物石油勘探是一种省钱、省力、简便易行的石油勘探法。甲烷氧化菌、乙烷氧化菌是常用的勘探微生物,它们可以以气态烃为唯一的
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用途:促使微生物生长;积累代谢产物;分离微生物菌种;鉴定微生物种类;微生物细胞计数;菌种保藏;制备微生物制品。
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生物技术概论 第四章:发 酵 工 程 Fermentation Engineering

4.1发酵工程概况 生物工程 基因工程 发酵工程 细胞工程 产物 酶工程 产品 产品

教育部1998年颁布的高等学校本科专业目录把发酵工程划归生物工程类,肯定了发酵工程的生物学属性。 作为生物工程的最接近生产实践的组成部分,发酵工程正在从工业向农、牧、医、药、环保和军事等各生物学相关领域延伸,受到社会的广泛关注。

发酵工程(微生物工程) 定义: 是一门将微生物学、生物化学和化学工程学的基本原理有机地结合起来,利用微生物的生长和代谢活动来生产各种有用物质的工程技术。

发酵的定义 1、传统发酵 最初发酵是用来描述酵母菌作用于果汁或麦芽汁产生气泡的现象,或者是指酒的生产过程。 2、生化和生理学意义的发酵 指微生物在无氧条件下,分解各种有机物质产生能量的一种方式,或者更严格地说,发酵是以有机物作为电子受体的氧化还原产能反应。 如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出CO2。

3、工业上的发酵 泛指利用微生物制造或生产某些产品的过程。包括: ( 1 ). 厌氧培养的生产过程,如酒精,乳酸等。 ( 2 ). 通气(有氧)培养的生产过程,如抗生素、氨基酸、酶制剂等。 产品有细胞代谢产物,也包括菌体细胞、酶等。

发酵:把利用微生物在有氧或无氧条件下的 生命活动来制备微生物菌体或其代谢 产物的过程。

除草剂

禽流感 甲肝 乙肝 SARS 乙脑 腮腺炎

发酵工程的内容 包括三部分: 上游工程:优良种株的选育,最适发酵条件(pH、温度、溶氧和营养组成)的确定,营养物的准备等 。 中游工程:在最适发酵条件下,发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的工艺技术 。 下游工程:从发酵液中分离和纯化产品的技术

发酵的发展简史 传统型—天然发酵 第一代—纯培养技术的建立 第二代—深层培养技术 第三代—微生物工程

1 天然发酵 原始社会就会利用含糖果实进行酒精发酵。 公元前4000-3000年,古埃及人熟悉了酒、醋的酿造方法。 我国在4200-4000年前的龙山文化时期已有酒器出现。 主要产品有:酒、酱油、泡菜、奶酒、干酪等。 特点:不能控制发酵过程,生产只能凭经验。

2 第一代—纯培养技术的建立 1680年,荷兰的列文虎克(Anthony Leeuwenhoek)制成了显微镜,并通过显微镜观察到了微生物. 19世纪中期,法国的巴斯德(Louis Pasteur)证明了酒精发酵是由活酵母引起的,各种不同的发酵产物是由不同的微生物产生的。 德国的柯赫(Robert Koch)发明了固体培养基,得到了细菌的纯培养物,由此建立了微生物的纯培养技术。

产品主要有:酵母、酒精、丁醇、有机酸、酶制剂等。 特点:靠厌氧发酵和表面固体发酵。

3 第二代—深层培养技术 1928年,英国的细菌学家弗莱明(Fleming)发现了能够抑制葡萄球菌的点青霉,其产物称为青霉素。 第二次世界大战中对于抗感染药物的极大需求,促使人们重新研究青霉素。至1945年,采用了深层培养技术,将青霉素进行大规模生产。

主要产品:各种抗生素、氨基酸、酶制剂、维生素等。 特点:发酵产量大大提高,可选择性地发酵所需产物

4 第三代—微生物工程 1953年,美国的Watson 和Crick发现了DNA双螺旋结构。 70年代,DNA体外重组技术的建立。 主要产品:胰岛素、生长激素、细胞因子、单克隆抗体等 特点:采用基因工程技术对微生物进行改造,使微生物生产出他们本身不能生产出的产品。

发酵工程的类型 1、生产微生物细胞物质 定义:是以获得具有多种用途的微生物菌体细胞为目的的产品的发酵工业,包括单细胞的酵母和藻类、担子菌,生物防治的苏云金杆菌以及人、畜防治疾病用的疫苗等。 特点:细胞的生长与产物积累成平行关系,生长速率最大时期也是产物合成速率最高阶段,生长稳定期产量最高。

2、微生物酶发酵 酶的特点:易于工业化生产,便于改善工艺提高产量。 分类:胞内酶 和胞外酶 生物合成特点:需要诱导作用,或遭受阻遏、抑制等调控作用的影响,在菌种选育、培养基配制以及发酵条件等方面需给予注意。

3、微生物代谢产物发酵 包括初级代谢产物、中间代谢产物和次级代谢产物。 对数生长期形成的产物是细胞自身生长所必需的,称为初级代谢产物或中间代谢产物。 各种次级代谢产物都是在微生物生长缓慢或停止生长时期即稳定期所产生的,来自于中间代谢产物和初级代谢产物。

4、微生物的生物转化 定义:是利用生物细胞对一些化合物某一特定部位(基团)的作用,使它转变成结构相类似但具有更在经济价值的化合物。 最终产物是由微生物细胞的酶或酶系对底物某一特定部位进行化学反应而形成的。

5、微生物特殊机能的利用 利用微生物消除环境污染 利用微生物发酵保持生态平衡 微生物湿法冶金 利用基因工程菌株开拓发酵工程新领域。

发酵(Fermentation)的一般过程 菌种(斜面) 摇瓶 种子罐 发 酵 罐 发酵液 细胞分离 菌体 无细胞上清液 产品提取 产品 精制 产品包装

发酵过程中离不开微生物的作用 1、发酵原料的选择及预处理 2、微生物菌种的选育及扩大培养 3、发酵设备选择及工艺条件控制:常温、常压。种子扩大培养和发酵采用不同的工艺。 4、发酵产物的分离提取 5、发酵废物的回收和利用

发酵技术的特点 (1)发酵所用的原料通常以淀粉、糖蜜或其他农副产品为主,只要加入少量的有机和无机氮源就可进行反应。可以利用废水和废物等作为发酵的原料进行生物资源的改造和更新。 (2)微生物菌种是进行发酵的根本因素,通过变异和菌种选育,可以获得高产的优良菌株并使生产设备得到充分利用,也可以因此获得按常规方法难以生产的产品。

(3)发酵过程一般来说都是在常温常压下进行的生物化学反应,反应安全,要求条件简单。 (4)发酵对杂菌的污染的防治至关重要。反应必需在无菌条件下进行。 (5)由于生物体本身所具有的反应机制,能够专一地和高度选择性地对某些较为复杂的化合物进行特定部位地氧化、还原等化学转化反应,也可以产生比较复杂的高分子化合物。

(6)发酵过程是通过生物体的自动调节方式来完成的,反应的专一性强,因而可以得到较为单一的代谢产物。 (7) 工业发酵与其他工业相比,投资少,见效快,并可以取得较显著的经济效益。 (8) 除利用微生物外,还可以用动植物细胞和酶,也可以用人工构建的遗传工程菌进行反应。

发酵技术的应用 食品加工 调味品 含醇饮料 1. 食品工业 甜味剂 发酵乳制品 食品添加剂 食品检验

氨基酸 维生素 抗生素 2. 医药卫生行业 治疗用酶 激素 生物制品 酶抑制剂

糖酶 凝乳酶 蛋白酶 3. 轻工业 过氧化氢酶 果胶酶 脂肪酶

醇及溶剂 有机酸 多糖 4 .化工能源 清洁能源 烷烃

根瘤菌 增产剂 生物农药 除草剂 5 .农业 真菌、病毒 食用菌和 药用真菌

处理废物 6. 环保 处理污水 生物补救 生物采矿

4.2 微生物发酵过程 按发酵原料分:糖类物质发酵、石油发酵、废水发酵。 按发酵形式分:固体发酵、液体发酵 按发酵工艺流程分:分批式、连续式、流加式 按对氧的需求分:厌氧发酵、好氧发酵

微生物用于工业生产的三要素: 生产菌种的性能 发酵及提纯的工艺条件 生产设备

4.2.1发酵工业中常用的微生物 细菌 放线菌 酵母菌 霉菌 其他微生物:担子菌、藻类等

菌种来源 根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买; 从大自然中分离筛选新的微生物菌种。

分离和筛选思路 新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性,采用各种筛选方法,快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。 实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌,也必须重新进行分离纯化。 有了优良的菌种,还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合。

筛选步骤 标本的采集 标本材料的预处理 富集培养 菌种的初筛 菌种的复筛 性能鉴定 菌种保藏

标本的采集 原则:材料的来源越广泛,越有可能获得新的菌种。 方法:根据所需菌的特点(查资料),选择不同的地点、材料来采集。

采样对象 以采集土壤为主。也可以是植物,腐 败物品,某些水域等。 例如: 有机物丰富的地方,细菌、放线菌较多。 果园树根土壤中,酵母菌多。 动植物残骸及腐殖土中,霉菌多。

含淀粉多的土壤中淀粉酶产生菌和以淀粉质原料为碳源的氨基酸产生菌较多。 蛋白酶产生菌可以从加工皮革的生皮晒场、蚕丝、豆饼等腐烂变质处的土壤中分离得到。 豆科植物根周围土壤中根瘤菌较多。 白腐态树木上可以分离到分解木质素的微生物。 褐腐态树木上可以分离到分解纤维素的微生物。

采样季节:以温度适中,雨量不多的秋初为好。 采土方式:在选好适当地点后,用小铲子除去表土,取离地面5-15cm处的土约10g,盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中,密封,标记:记录采样时间、地点、环境条件等,以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化,宜将样品逐步分批寄回,以便及时分离。 采集好标本后,应尽快分离。

标本的预处理 方法: 物理法 加热法、膜过滤法、离心法 化学法 提高pH值、加入几丁质 诱饵法 花粉、蛇皮

富集培养 为了容易分离到所需的菌种,让无关的微生物至少是在数量上不要增加,可以通过配制选择性培养基,选择一定的培养条件来控制。 例如:碳源利用的控制,可选定糖,淀粉、纤维素,或者石油等,以其中的一种为唯一碳源,那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长,而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。

纯种分离 方法: 涂布平板分离法 倾注平板分离法 平板画线分离法

涂布平板法

倾注平板法

画线法

平皿快速检出法 透明圈法 变色圈法 抑菌圈法

性能鉴定 特性:包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。

毒性测定 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的,将其作为生产菌种应当十分当心,尤其与食品工业有关的菌种,更应慎重。据有的国家规定,微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外,其他微生物作为食用,均需通过两年以上的毒性试验。

菌种保藏 根据需要采用合适的方法进行保藏。

微生物的代谢 一、微生物的代谢产物 初级代谢产物 定义:微生物通过代谢活动所产生的、自身生长和繁殖所必需的物质。 举例:氨基酸、核苷酸、多糖、脂类、维生素等。 特征: 不同的微生物初级代谢产物基本相同; 初级代谢产物合成过程是连续不断的。

一、微生物的代谢产物 次级代谢产物 定义:微生物生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂、对该微生物无明显生理功能,或并非是微生物生长和繁殖所必需的物质。 举例:抗生物、毒素、激素、色素等。 特征: 不同的微生物次级代谢产物不同; 抗生素是一类具有特异性抑菌和杀菌作用的有机化合物。

二、微生物代谢的调节 酶合成的调节 微生物细胞内酶的种类: 举例: 组成酶:微生物细胞内一直存在,合成是受遗传物质控制。 诱导酶:在环境中存在某种物质的情况下才能够合成的酶。 举例: 亮白曲霉原来不能合成蔗糖酶,所以不能利用蔗糖,但如果在培养基内加入蔗糖,一段时间后,可合成蔗糖酶,并利用蔗糖。

二、微生物代谢的调节 酶活性的调节

细胞内两种方式同时存在,密切配合,高效、准确控制代谢的正常进行。 二、微生物代谢的调节 两种调节的对比 酶合成的调节 酶活性的调节 不同点 调节对象 通过酶量的变化控制代谢速率 控制酶活性,不涉及酶量变化 调节效果 相对缓慢 快速、精细 调节机制 基因水平调节,调节控制酶合成 代谢调节,它调节酶活性 相同点 细胞内两种方式同时存在,密切配合,高效、准确控制代谢的正常进行。

三、微生物代谢的人工控制 目的 最大限度积累对人类有用的代谢产物 措施 改变微生物遗传特性 控制生产过程中各种条件

环境因素对微生物生长的影响 一、温度

温度太低:使原生质膜处于凝固状态,不能正常进行 营养物质的运输或形成质子梯度。 温度太高:蛋白质、核酸和细胞的其他组成发生不可 逆的变形作用。 最低生长温度 三种基本温度 最适生长温度 最高生长温度

根据生长温度分类: 1. 嗜冷微生物 2.嗜温微生物 3.嗜热微生物 4.嗜高热微生物

1.嗜冷微生物能够在低温条件下生长的原因是:其所含 的酶在低温能有效地催化生化反应;在低温下主动运输 仍能正常进行,有效的吸收必须的营养物质,是其原生 质膜中含有较多的不饱和脂肪酸,在低温下仍可维持膜 的流动性。 2.嗜高温微生物在高温条件下生长的原因是:其酶和其他蛋白质在高温时更稳定;其蛋白质合成机构和细胞质膜(富含饱和脂肪酸等)等结构成分是热稳定。

3.微生物耐热性在实践中的重要性: (1)发酵生产的优点是发酵周期短,效率高;有利于非 气体物质在发酵液中的扩散和溶解,以及防止杂菌的污 染;可节约冷却发酵热量所需的成本。 (2)嗜热微生物产生的酶制剂有更高的耐热性。

二、pH 1.pH影响微生物生长的原因:介质pH影响生活环境中 营养物质的可给态和有毒物质的毒性;影响菌体细胞膜 的带电荷性质、膜的稳定性及膜对物质的吸收能力;使 菌体表面蛋白变性或水解。 2.分类: 嗜酸性微生物(<pH5.4) 嗜中性微生物(pH5.4~pH8.5) 嗜碱性微生物( pH7.0~ pH11.5)

3.嗜酸或嗜碱微生物耐酸或耐碱的原因:主要是由于 细胞本身具有维持胞内pH值接近中性的能力。嗜酸微生 物在酸性环境中,细胞膜可以阻止H+进入胞内、不断将 胞内H+排出胞外。而嗜碱或耐碱微生物,则可以阻止 OH-进入胞内并将其排出胞外,以维持胞内接近中性pH。

三、氧 1.根据和氧的关系分为: 专性好氧微生物 好氧微生物 (必需有氧) 微好氧微生物 兼性好氧微生物 (可有可无) 耐氧微生物 好氧微生物 (必需有氧) 微好氧微生物 兼性好氧微生物 (可有可无) 耐氧微生物 厌氧微生物 (不需) 严格厌氧微生物

2.氧与不同微生物的关系 (1)严格厌氧微生物并不是被气态的氧所杀死,而是由 于不能解除某些氧代谢产物(过氧化氢、超氧阴离子和羟 自由基等)的毒性而死亡。 (2)好氧生物具有降解这些产物的酶,如过氧化氢酶、 过氧化物酶、超氧化物歧化酶(SOD)等,严格厌氧微生物 则缺乏全部或部分这些酶。 (3)专性好氧微生物和大多数兼性好氧微生物都含有超 氧化物歧化酶和过氧化氢酶,某些兼性好氧微生物和耐 氧厌氧微生物只含有超氧化物歧化酶但缺乏过氧化氢酶。 (4)大多数专性厌氧微生物都同时缺乏这两种酶,因而 死于O2-和H2O2的毒害作用。

微生物生长的控制 一、概念 灭菌:杀死或消除全部的微生物 消毒:杀死、消除或降低病源微生物 防腐:防止或抑制微生物的生长

二、控制微生物的方法 高温(干热灭菌、湿热灭菌和巴斯德消毒法) 低温(冷藏法5℃和冷冻法-10℃ ) 物理方法 辐射(紫外光、电离辐射和强见光) 干燥和渗透压 过滤 消毒剂和防腐剂 化学方法 化学治疗剂 微生物的抗药性

1.高温导致微生物细胞成分发生不可逆的失活而死亡; 加热引起的微生物死亡是以指数速率进行的,因此加热 温度、起始微生物总数、微生物的抗热性等影响加热灭 菌的作用。 2.在相同的温度下,湿热比干热的灭菌效果好 (1)热蒸汽对细胞成分的破坏作用更强。水分子的存 在有助于破坏维持蛋白质三维结构的氢键和其他相互作 用弱键,更易使蛋自质变性,还可以使细胞脑膜脂溶解; (2)热蒸汽比热空气穿透力强,能更加有效地杀灭微 生物; (3)蒸汽存在潜热,当气体转变为液体时可放出大量 热量,故可迅速提高灭菌物体的温度。

3.巴斯德消毒法处理牛奶可采用71.6 ℃快速处理至 少15s或62.9 ℃处理30min。 4.紫外光杀菌作用是因为它可以被蛋白质(约280nm) 和核酸(约260nm)吸收,造成这些分子的变性失活。 5.电离辐射主要使用x射线和γ射线,形成离子和自 由基分子。最重要的是对的H2O2作用。 6.化学治疗剂是能够特异性作用某些微生物并有选择 性的化学药剂,基本对人体无害。 7.化学治疗剂有生长因子类似物(竞争性抑制剂)和 抗生素两类。

8.抗生素的作用机制: (1)抑制细胞壁的合成(青霉素--G+) (2)破坏细胞膜的功能(多粘菌素--G-) (3)抑制蛋白质的合成(氯霉素-30s,链霉素-50s) (4)抑制核酸的合成(利福霉素--细菌RNA聚合霉, 新生霉素--细菌DNA)

9.微生物的抗药性机制: (1)缺乏某类药物作用的结构 (2)化学治疗剂不能穿过细胞膜进入胞内 (3)化学治疗剂被变为无活性的形式 (4)药物的作用部位被修饰改变 (5)被药物阻断的代谢途径发生遗传改变 (6)将进入到胞内的药物泵出胞外

4.2.2培养基 一、培养基的营养成分 微生物的营养活动,是依靠向外界分泌大量的酶.将周围环境中大分子的蛋白质、糖类、脂肪等营养物质分解成小分子化合物,再借助细胞膜的渗透作用,吸收这些小分子营养来实现的。 所有发酵培养基都必须提供微生物生长繁殖和产物合成所需的能源,包括碳源、氮源、无机元素、生长因子及水、氧气等。对于大规模发酵生产,除考虑上述微生物的需要外,还必须重视培养基原料的价格和来源。

微生物的营养来源 (1)能源 自养菌:光;氢,硫胺;亚硝酸盐,亚铁盐。 异养菌:碳水化合物等有机物,石油天然气和石油化工产品,如醋酸。

(2)碳源: 碳酸气; 淀粉水解糖,糖蜜、亚硫酸盐纸浆废液等 石油、正构石蜡,天然气 醋酸、甲醇、乙醇等石油化工产品

(3)氮源 豆饼或蚕蛹水解液,味精废液,玉米浆,酒糟水等有机氮 尿素,硫酸铵,氨水,硝酸盐等无机氮 气态氮

(4)无机盐 磷酸盐,钾盐,镁盐,钙盐等其他矿盐 铁、锰、钴等微量元素 其他 (5)特殊生长因子 硫胺素、生物素、对氨基苯甲酸、肌醇等

二、培养基的用途 筛选菌种 保藏菌种 检验杂菌 培养种子 发酵生产

(一)培养基的分类 (1)按培养基组成物质的化学成分 合成培养基、半合成培养基、天然培养基。 (2)按物理性质 固体,液体 (3)按用途 选择性培养基、鉴别培养基、富集培养基等

(1)天然培养基 是采用化学成分还不清楚或化学成分还不恒定的各种植物和动物组织或微生物的浸出物、水解液等物质(例如牛肉膏、酵母膏、麦芽汁、蛋白胨等)制成的。 适合于各类异养微生物生长,而一般自养微生物都不能生长。

(2)合成培养基 是用化学成分和数量完全了解的物质配制而成的。成分精 确,重复性强,可以减少不能控制的因素 适用于在实验室范围作有关营养、代谢、分类鉴定、生物测定及选育菌种、遗传分析等定量研究工作。 但一般微生物在合成培养基上生长较慢,有些微生物营养要求复杂,在合成培养基上不能生长。

(3)半合成培养基 多数培养基配制是采用一部分天然有机物作碳源、氮源和生长因子的来源,再适当加入一些化学药品以补充无机盐成分,使其更能充分满足微生物对营养的需要。 大多数微生物都能在此培养基上生长繁殖。因此,在微生物工业生产上和试验研究中被广泛使用。

(1) 液体培养基:常用于大规模的工业生产及生理代谢等基本理论研究工作。 发酵工业多用作培养种子和发酵的培养基。 根据微生物对氧的要求情况,分别作静止或通风搅拌培养。 在菌种筛选工作和菌种培养工作中,也常用液体培养基进行摇瓶培养 微生物在液体培养基中生长的情况有时也可用作鉴定菌种的参考。

生理代谢 菌种筛选 种子培养 发酵培养

(2) 固体培养基 分类:斜面试管、平板等 是在液体培养基中加入凝固剂配成的,最常用的凝固剂是琼脂。

作用: 固体培养基在菌种的分离、保藏、菌落特征的观察、活菌计数和鉴定菌种方面是不可缺少的。 在制曲、酶制剂、柠檬酸等生产中,用来培养霉菌等的固体种子和发酵培养基是由麸皮等农作物加无机元素等制成的。

增殖培养基:可以配制成适合某种微生物生长而不适合其他微生物生长,从而达到从自然界分离这种微生物的目的。 鉴别培养基:是根据微生物能否利用培养基中某种营养成分,借助指示剂的显色反应,以鉴别不同种类的微生物。 选择培养基:是在培养基内加入某种化学物质以抑制不需要菌的生长,而促进某种需要菌的生长。

(二)发酵生产中的培养基类型 工业发酵中培养基往往是依据生产流程和作用分为: 斜面培养基 种子培养基(摇瓶培养基、小罐培养基) 发酵培养基

1.斜面培养基 作用:这是供微生物细胞生长繁殖用的,包括细菌,酵母等的斜面培养基以及霉菌、放线菌生孢子培养基或麸曲培养基等。这类培养基主要作用是供给细胞生长繁殖所需的各类营养物质。

特点: 1.富含有机氮源,少含或不含糖分。有机氮有利于菌体的生长繁殖,能获得更多的细胞。 2.对于放线菌或霉菌的产孢子培养基,则氮源和碳源均不宜太丰富,否则容易长菌丝而较少形成孢子。 3.斜面培养基中宜加少量无机盐类,供给必要的生长因子和微量元素。

2.种子培养基(包括摇瓶种子和小罐种子培养基): 培养种子的目的: 1.扩大培养,增加细胞数量; 同时也必须培养出强壮、健康、活性高的细胞。为了使细胞迅速进行分裂或菌丝快速生长。

种子培养基特点: 1. 必须有较完全和丰富的营养物质,特别需要充足的氮源和生长因子。 2. 种子培养基中各种营养物质的浓度不必太高。供孢子发芽生长用的种子培养基,可添加一些易被吸收利用的碳源和氮源。 3. 种子培养基成分还应考虑与发酵培养基的主要成分相近。

3.发酵培养基 发酵培养基是发酵生产中最主要的培养基,它不仅耗用大量的原材料,而且也是决定发酵生产成功与否的重要因素。 (1)根据产物合成的特点来设计培养基: 对菌体生长与产物相偶联的发酵类型,充分满足细胞生长繁殖的培养基就能获得最大的产物。 对于生产氨基酸等含氮的化合物时,它的发酵培养基除供给充足的碳源物质外,还应该添加足够的铵盐或尿素等氮素化合物。

(2)发酵培养基的各种营养物质的浓度应尽可能高些,这样在同等或相近的转化率条件下有利于提高单位容积发酵罐的利用率,增加经济效益。 (3)发酵培养基需耗用大量原料,因此,原料来源、原材料的质量以及价格等必须予以重视。

(三)发酵培养基的选择 (1)必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分。 (2)有利于减少培养基原料的单耗,即提高单位营养物质所合成产物数量或最大产率。 (3)有利于提高培养基和产物的浓度,以提高单位容积发酵罐的生产能力。 (4)有利于提高产物的合成速度,缩短发酵周期。

(5)尽量减少副产物的形成,便于产物的分离纯化。 (6)原料价格低廉,质量稳定,取材容易。 7)所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响,利于提高氧的利用率,降低能耗。 (8)有利于产品的分离纯化,并尽可能减少产生“三废”的物质。

发酵培养基的设计和注意事项 1.提供必要的营养成分:培养基成分必须满足细胞生长,代谢活动和合成产物所需的基本要求。 2.配制合适的浓度:可以从发酵动力学有关生长、产物合成和基质利用物料平衡的关系中大致推算所需原料或大致计算出所需主要原料的需要量。 3. 主成分与其他成分的配比。

4.控制合适的pH:微生物的生长繁殖或产物的合成往往需要—定的pH环境,在最适pH值下有利于加快各种酶的反应。因此在整个发酵过程中应使培养基的pH适合于微生物生长或产物合成所需。

pH的具体控制方法 可以在微生物培养过程中加入酸或碱或流加某些营养物质调节培养基的pH,但更应在配制培养基时考虑所用营养物质的组成成分,使其pH值适合该微生物生长或合成代谢产物的需要。 还要注意有些营养物质被利用后培养基的pH变化情况. 控制pH最常用的方法是在培养基中添加具有一定缓冲能力的物质作为营养物,如以磷酸盐作为磷的成分;或者避免使用容易产生生理酸性或碱性使培养基pH波动太大的物质。

5.避免产生微生物不能利用的物质或形成沉淀 葡萄糖与铵盐或氨基酸的氨基在灭菌高温下作用形成深褐色物质。这种物质不被微生物利用。因此这两类营养物不宜直接配在一起进行灭菌,而应采用分开灭菌后再加入发酵罐内。 硫酸铵中的SO42-与钙盐易形成难溶的硫酸钙,因此二者也不宜直接配成培养基。

6.注意代谢调节物的影响: 有些物质存在于培养基中往往能明显地促进或抑制发 酵产物的形成。 前体物质 诱导剂 阻遏物 抑制剂 金属离子

(1)添加有关前体物质 前作物质:是指当添加到发酵培养基中的某些化学物质基本上不改变其分子结构而直接进入产物中的小分子物质,从而在一定条件下控制产物的合成方向和提高产量。 在发酵中添加前体物质将有利于产物的合成和显著提高产量,如苯乙酸及其衍生物被认为是青霉素的前体物质。

(2)添加诱导物 目前工业用微生物酶多数为诱导酶,如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等。 诱导物的存在能大大强化诱导酶的生物合成。 酶的正常底物或底物的类似物都可作为诱导物。 在各种微生物酶的发酵培养基中必须加入诱导物,例如淀粉、糊精或麦芽糖是淀粉酶或糖化酶的诱导物。只有添加这些物质的培养基,才能获得高产。

(3)注意阻遏物或抑制剂的影响 培养基中存在反馈阻遏物或分解阻遏物均能影响酶的合成,降低发酵产量。 有些酶的抑制剂却能提高某些代谢产物的产量,最早利用抑制剂提高中间代谢物产量的例子是甘油发酵中加入亚硫酸钠。 在培养基配制时必须注意加入有益的抑制剂,而避免混入有害的抑制物。

7. 金属离子的影响: 有些种类的发酵生产对金属离子相当敏感,因为有些金属离子是中间代谢酶的抑制剂或激活剂。 因此对于有重大影响的金属离子必须严格控制。如柠檬酸发酵中铁、锰和锌离子都能明显影响产量,钙离子对细菌淀粉酶的生产有促进作用,而钴离子对葡萄糖异构酶的发酵是必需的,这些在培养基配制时都必须予以注意。

(四)培养基组成物质的营养与作用 碳素化合物 氮素化合物 水 微量元素(无机盐类) 生长因子

碳素化合物营养源对微生物生长发育的影响 (1)碳素化合物的作用 构成菌体成分的重要元素, 产生各种代谢产物和细胞内贮藏物质的主要原料, 同时又是化能异养型微生物的能量来源。

(2)碳源种类 糖:单糖中的己糖,寡糖中的蔗糖、麦芽糖、棉子糖,多糖中的淀粉、纤维素、半纤维素、甲壳质和果胶质等,其中淀粉是大多数微生物都能利用的碳源。 有机酸如糖酸、柠檬酸、反丁烯二酸、琥珀酸、苹果酸、丙酮酸、酒石酸等。

醇类中甘露醇、甘油、低浓度的乙醇。 脂肪酸如甲酸、乙酸、丙酸、丁酸等低级脂肪酸都可用作碳源。油酸和亚油酸等高级脂肪酸可被不少放线菌和真菌作为碳源和能源利用,低浓度的高级脂肪酸可刺激细菌生长,但浓度较高时往往有毒害作用。 正烷烃:一般是指从石油裂得到的14C至18C的直链烷烃混合物。

葡萄糖: 是最易利用的糖,并且作为加速微生物生长的一种有效的糖。 过多的葡萄糖会过分加速菌体的呼吸,以致培养基中的溶解氧不能满足需要。

糖蜜:是制糖厂生产糖时的结晶母液,是蔗糖厂的副产物。含有较丰富的糖、氨素化合物和无机维生素等,是微生物工业的价廉物美的原料。 淀粉:一般要经菌体产生的胞外酶水解成单糖后再被吸收利用。可克服葡萄代谢过快的弊病。来源丰富,价格比较低廉。常用的为玉米淀粉、小麦淀粉和甘薯淀。

油和脂肪:在微生物分泌的脂肪酶作用下水解为甘油和脂肪酸,在溶解氧的参与下,氧化成水和二氧化碳。因此用脂肪作碳源时需比糖代谢供给更多的氧。

(2)氮素化合物 氮是构成微生物细胞蛋白质和核酸的主要元素,而蛋白质和核酸是微生物原生质的主要组成部分。氮素一般不提供能量,但硝化细菌却能利用氨作为氮源和能源。 就某一类微生物而言,由于其合成能力的差异,对氮营养的需要也有很大区别。

氮的来源可分为无机氮和有机氮: 有机氮源:花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母膏、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟等。 它们在微生物分泌的蛋白酶作用下,水解成氨基酸,被菌体进一步分解代谢。

有机氮源特点: 含有丰富的蛋白质、多肽和游离的氨基酸 还含有少量的糖类、脂肪、无机盐、维生素及生长因子。

玉米浆:是玉米淀粉生产中的副产物,其中固体物含量在50%。还含有有机酸、还原糖、磷、微量元素、生长素。 由于玉米浆的来源不同,加工条件也不同,因此玉米浆的成分有较大波动。

无机氮源:铵盐、硝酸盐、氨水等。 微生物对其吸收利用比有机物快,所以也称速效氮。 利用无机氮时应注意引起的pH变化。

实验室中常用蛋白胨、牛肉膏、酵母膏等作为有机氮源,工业生产上常用硫酸铵、尿素、氨水、豆饼粉、花生饼粉、麸皮等原料作氮源。

(3)水 (1) 水是良好的溶剂,菌体所需要的营养物质都是溶解于水中被吸收的。 (2) 渗透、分泌、排泄等作用都是以水为媒介的; (3) 水直接参与代谢作用中的许多反应。所以,水在生物化学反应中占有极为重要的地位。 (4) 水的比热高,能有效地吸收代谢过程中所放出的热,使细胞内温度不致骤然上升。 (5) 水是热的良导体,有利于放热,可调节细胞的温度。

(4)微量元素(无机盐类) 无机盐类是微生物生命活动所不可缺少的物质。主要功用是: ①构成菌体成分; ②作为酶活性基的组成部分或维持酶的活性; ③调节渗透压、pH值、氧化还原电位等; ④作为自养菌的能源。

无机元素包括主要元素(又称大量元素)和微量元素两类,这是依据微生物对它们需要量的大小划分的。 主要元素有P、S、Mg、K、Ca等; 微量元素有Fe、Cu、Mn、Zn、Mo、Co、B等。 当盐浓度太高时,对微生物生长有抑制作用,而在较低浓度时却能刺激生长。 一般在复合培养基中由于加入许多动植物原料等都含有微量元素。

磷: 是核酸和蛋白质的必要成分,也是ATP的成分。 在代谢途径调节方面,起着重要作用。促进微生物生长,但过量时,许多产物的合成受抑制。

钙:培养基中钙盐过多时,会形成磷酸钙沉淀。可分别消毒或逐步补加。 镁:处于离子状态时,是许多酶的辅酶的激活剂,不但影响基质的氧化,也影响蛋白质的合成。以硫酸镁加入,但在碱性溶液中会形成沉淀。

(5)生长因子 广义说,凡是微生物生长不可缺少的微量有机物质都称为生长因子(又称生长素),包括氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等;狭义说,生长素仅指维生素。 与微生物有关的维生素主要是B族维生素,这些维生素是各种酶的活性基的组成部分,没有它们,酶就不能活动。 凡是缺少合成生长素类物质的微生物(即缺少了合成生长素过程中的某种酶),统称为营养缺陷型。

(五)培养基确定方法 (1)首先必须做好调查研究工作,了解菌种的来源、生活习惯、生理生化特性和一般的营养要求。 工业生产主要应用细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类微生物。它们对营养的要求既有共性,也有各自的特性,应根据不同类型微生物的生理特性考虑培养基的组成。

(2)其次,对生产菌种的培养条件,生物合成的代谢途径,代谢产物的化学性质、分子结构、一般提炼方法和产品质量要求等也需要有所了解,以便在选择培养基时做到心中有数。

(3)最好先选择一种较好的化学合成培养基做基础,开始时先做一些摇瓶试验; 然后进一步做小型发酵罐培养,摸索菌种对各种主要有机碳源和氮源的利用情况和产生代谢产物的能力。 注意培养过程中的pH变化,观察适合于菌种生长繁殖和适合于代谢产物形成的两种不同pH,不断调整配比来适应上述各种情况。

(4)注意每次只限一个变动条件。有了初步结果以后,先确定一个培养基配比。 其次再确定各种重要的金属和非金属离子对发酵的影响,即对各种无机元素的营养要求,试验其最高、最低和最适用量。 在合成培养基上得出一定结果后,再做复合培养基试验。 最后试验各种发酵条件和培养基的关系。培养基内pH可由添加碳酸钙来调节,其他如硝酸钠、硫酸铵也可用来调节。

(5) 有些发酵产物,如抗生素等,除了配制培养基以外,还要通过中间补料法,一面对碳及氮的代谢予以适当的控制,一面间歇添加各种养料和前体类物质,引导发酵走向合成产物的途径。

(6)根据生产和科学研究的需要选择培养基 工业上,液体深层培养具有占地面积小、发酵效率高、操作方便、易于机械化相自动化生产、降低劳动强度等优点。所以,发酵工业中大多采用液体培养基培养种子和进行液体发酵,并根据微生物对氧气的要求,分别作表面静止培养或深层通气培养。

实验室或制种车间进行固体培养常采用试管、扁瓶和培养皿。工业生产中也常采用固体原料,如小米、大米、铁皮、马铃署等直接制作斜面,或在茄子瓶表面培养霉菌、放线菌。 具有设备简单、投资少、易推广等优点。 大规模生产中,固体培养的缺点是占地面积多,劳动强度大,生产稳定性差。

(7)根据经济效益选择培养基原料 考虑经济节约,尽量少用或不用主粮,努力节约用粮,或以其他原料代粮。 糖类是主要的碳源。碳源的代用方向主要是寻找植物淀粉、纤维水解物,以废糖蜜代替淀粉、糊精和葡萄糖,以工业葡萄糖代替食用葡萄糖。同时,使用稀薄的培养基,适当减少碳氮配比 石油作为碳源的微生物发酵不但可以生产以粮食为碳源的发酵产品。

有机氮源的节约和代替主要为减少或代替黄豆饼粉、花生饼粉、食用蛋白胨和酵母粉等含有丰富蛋白质的原料。 代用的原料可以是棉籽饼粉、玉米浆、蚕蛹粉、杂鱼粉、黄浆水或麸汁、饲料酵母、石油酵母、骨胶、菌体、酒糟,以及各种食品工业下脚料等。这些代用品大多蛋白质含量丰富,贷源充足,价格低廉,便于就地取材,方便运输。

4.3 液体深层发酵 4.3.1 发酵的操作方式 4.3.2 发酵的工艺控制 4.3.3 发酵设备 4.3.4 下游加工工程

液体深层培养 用液体深层发酵罐从罐底部通气,送入的空 气由搅拌桨叶分散成微小气泡以促进氧的溶解。 这种由罐底部通气搅拌的培养方法,相对于由气 液界面靠自然扩散使氧溶解的表面培养法来讲, 称为深层培养法。 特点是容易按照生产菌种对于代谢的营养要 求以及不同生理时期的通气、搅拌、温度、与培 养基中氢离子浓度等条件,选择最佳培养条件。

深层培养基本操作的3个控制点 ①灭菌:发酵工业要求纯培养,因此在发酵开始前必须对培养基进行加热灭菌。所以发酵罐具有蒸汽夹套,以便将培养基和发酵罐进行加热灭菌,或者将培养基由连续加热灭菌器灭菌,并连续地输送于发酵罐内。

②温度控制:培养基灭菌后,冷却至培养温度进行发酵,由于随着微生物的增殖和发酵会发热、搅拌产热等,所以为维持温度恒定,须在夹套中以冷却水循环流过。 ③通气、搅拌:空气进入发酵罐前先经空气过滤器除去杂菌,制成无菌空气,而后由罐底部进人,再通过搅拌将空气分散成微小气泡。为了延长气泡滞留时间,可在罐内装挡板产生涡流。搅拌的目的除了溶解氧之外,可使培养液中微生物均匀地分散在发酵罐内,促进热传递,以及为调节pH而使加入的酸和碱均匀分散等。

4.3.1 发酵的操作方式 4.3.1.1 分批发酵 分批发酵又称为分批培养,是指在一个密闭系统内投入有限数量的营养物质后,接入少量的微生物菌种进行培养,使微生物生长繁殖,在特定的条件下只完成一个生长周期的微生物培养方法。    在发酵过程中,除了不断进行通气(好氧发酵)和为调节发酵液的 pH 而加入酸碱溶液外,与外界没有其它物料交换。 培养基的量一次性加入,产品一次性收获,是目前广泛采用的一种发酵方式。

优点: ① 对温度的要求低,工艺操作简单; ② 比较容易解决杂菌污染和菌种退化等问题; ③ 对营养物的利用效率较高,产物浓度也比连续发酵要高。 缺点: ① 人力、物力、动力消耗较大; ② 生产周期较长,由于分批发酵时菌体有一定的生长规律,都要经历延滞期、对数生长期、稳定期和衰亡期,而且每批发酵都要经菌种扩大发酵、设备冲洗、灭菌等阶段; ③ 生产效率低,生产上常以体积生产率(以每小时每升发酵物中代谢产物的 g 数来表示)来计算效率,在分批发酵过程中,必须计算全过程的生产率,即时间不仅包括发酵时间,而且也包括放料、洗罐、加料、灭菌等时间。

4.3.1.2 连续发酵 连续发酵:是指以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基,同 时以相同速度流出培养液,从而使发酵罐内的液量维持恒定的 发酵过程。   连续发酵可分为单罐连续发酵和多罐串联连续发酵等方式。 在单罐连续发酵中,由于发酵液在不断搅拌,一部分刚流入的 发酵基将随发酵液一起流出。 优点: ① 设备的体积可以减小; ② 操作时间短,总的操作管理方便,便于自动化控制; ③ 产物稳定,人力物力节省,生产费用低。 缺点: ① 对设备的合理性和加料设备的精确性要求甚高; ② 营养成分的利用较分批发酵差,产物浓度比分批发酵低; ③ 杂菌污染的机会较多,菌种易因变异而发生退化。

4.3.1.3 补料分批发酵 补料分批发酵是指在微生物分批发酵过程中,以某种方式向发酵 系统中补加一定物料,但并不连续地向外放出发酵液的发酵技 术,是介于分批发酵和连续发酵之间的一种发酵技术。 假设物料流入发酵罐的速率为 Fin ,流出发酵罐的速率为 Fex,则 分批发酵时 Fin= Fex= 0 ;连续发酵时 Fin= Fex≠ 0 ;而补料分 批发酵时 Fin 与 Fex 不恒定,是可变的,有时为 0 ,有时不为 0 。 通常 Fex=0 的单纯补料工艺是增体积操作,不断分次加入发酵 基质或连续流加发酵基质,至发酵罐的体积不再适宜补料为止。 所以发酵时间只是有限地延长。另一种 Fex≠ 0 ,即定期从发酵 罐中排出一定量的发酵液以便能进一步补加物料的补料分批发 酵,称为重复循环工艺。

该法具有如下优点: ① 可以解除底物的抑制、产物的反馈抑制和分解代谢物阻遏作用。当代谢产物收率或其生产速率明显地受某种底物组分浓度影响时,采用补料分批技术比分批发酵有利; ② 可以减少菌体生长量,提高有用产物的转化率; ③ 菌种的变异及杂菌污染问题易控制; ④ 便于自动化控制。

4.3.2 发酵工艺控制 1、温度 通常在生物学范围内每升高10℃,生长速度就加 快一倍,所以温度直接影响酶反应,对于微生物来说, 温度直接影响其生长和合成酶。 机体的重要组成如蛋白质、核酸等都对温度较敏 感,随着温度的增高有可能遭受不可逆的破坏。 微生物可生长的温度范围较广,总体说在-10—95℃ 之间。

任何微生物的生长都需要有最适的生长温度, 在此温度范围内微生物生长繁殖最快。 如果所培养的微生物能承受稍高一些的温度进行 生长和繁殖,这对生产有很大的好处,即可减少污 染杂菌的机会和夏季培养所需降温的辅助设备,因 此培养耐高温的菌种有一定的生产现实意义。

2、pH值 培养基中的pH值与微生物生命活动有着密切关系, 各种微生物有其可以生长的和最适生长的pH范围。 以及代谢产物的积累。 控制pH值不但可以保证微生物良好的生长,而且可 以防止杂菌的污染。

培养基pH在发酵过程中能被菌体代谢所改变。 若阴离子(如醋酸根、磷酸根)被吸收或氮源被利用 后产生NH3 ,则pH上升;阳离子(如NH4、K+ )被 吸收或有机酸的积累,使pH下降。 一般来说,高碳源培养基倾向于向酸性pH转 移,高氮源培养基倾向于向碱性pH转移,这都跟 碳氮比直接有关。

3、氧 微生物对氧的需要不同,是由于依赖获得能量的 代谢方面的差异。好气性菌主要是有氧呼吸或氧化代 谢,厌气菌为厌气发酵(分子间呼吸),兼性厌气菌则 两者兼而有之。 不同微生物或同一微生物的不同生长阶段对通风 量的要求也不相同。

通风和搅拌 通气可以供给大量的氧。 通气量与菌种、培养基性质、培养阶段有关。通气量的多 少,最好按氧溶解的多少来决定。只有氧溶解的速度大于菌 体的吸氧量时,菌体才能正常地生长和合成酶。因此随着菌 体繁殖,呼吸增强,必须按菌体的吸氧量加大通气量,以增 加溶解氧的量。 搅拌则能使新鲜氧气更好地与培养液混合,保证氧的最大 限度溶解,并且搅拌有利于热交换,使培养液的温度一致, 还有利于营养物质和代谢物的分散。

一般来说,若培养罐深,搅拌转速大,通气管开孔 小或多,气泡在培养液内停留时间就长,氧的溶解速度 就大,而且在这些因素确定下,培养基的粘度越小,氧 的溶解速度也越大。 搅拌可以提高通气效果,但是过度地剧烈搅拌会导致 培养液大量涌泡,容易增加杂菌污染的机会,液膜表层 的酶容易氧化变性,微生物细胞也不宜剧烈搅拌。

4、种龄与接种量 种子培养期应取菌种的对数生长期为宜,菌种过嫩或过 老,不但延长发酵周期,而且会降低产量。 接种量的大小直接影响发酵周期。

大量地接入培养成熟的菌种的优点: 1.可以缩短生长过程的延缓期,因而缩短了发酵周期,提高了设备利用率, 2. 节约了发酵培养的动力消耗, 3.并有利于减少染菌机会, 一般都将菌种扩大培养,进行两级发酵或三级发酵。 接种量和培养物的生长过程的延缓期长短呈反比。 接种量过多也无必要。因培养种子费时,而且过多地移入代谢 废物,反而会影响正常发酵。

5、泡沫 (1)泡沫的危害: 培养过程中产生的泡沫与微生物的生长和合成酶有 关,泡沫的持久存在影响着微生物对氧的吸收,妨碍二 氧化碳的排除,因而破坏其生理代谢的正常进行,不利 于发酵; 由于泡沫大量生成,致使培养液的容量一般只能等于 种子罐容量的一半左右,大大影响了设备的利用率,甚 至发生跑料,招致染菌,造成巨大损失。

(2)产生泡沫的原因 通气和机械搅拌使液体分散和空气窜入,形成气泡; 培养基中某些成分的变化或微生物的代谢活动产生气泡; 培养基中某些成分(如蛋白质及其他胶体物质)的分子,在 气泡表面排列形成坚固的薄膜。因此,气泡不易破裂,聚成 泡沫层。

(3)培养过程的消泡措施 机械法:靶式消泡桨 化学法:发酵工业常用的消泡剂,有各种天然的动植物油 及来自石油化工生产的矿物油、改性油、表面活性剂等。 而新型的有机硅聚合物如硅油、硅树脂等,则具有效率高、 用量省、无毒性、无代谢性,同时兼有提高微生物合成酶 等多种优良特性,是一类有发展前途的消泡剂。 泡沫的控制除了添加消泡剂外,改进培养基成分也是相 辅相成的一个重要方面。

6、染菌的控制 (1)染菌的原因 归结起来是:设备、管道、阀门漏损、灭菌不彻底; 空气净化不好;无菌操作不严或菌种不纯等。

(2)染菌的控制 必须加强接种室的消毒管理工作,定期检查消毒 效果,严格无菌操作技术。 如果新菌种不纯,则需反复分离,直至完全纯粹 为止。对于已出现杂菌菌落或噬菌斑的试管斜面菌 种,应予废弃。在平时应经常分离试管菌种,以防菌 种衰退、变异和污染杂菌。 对于菌种扩大培养的工艺条件要严格控制,对种 子质量更要严格掌握,必要时可将种子罐冷却,取样 做纯种试验,确证种子无杂菌存在,才能向发酵培养 基中接种。

4.3.3 发酵设备 发酵装置:严密的结构;良好的液体混合能力;传质、传热速率高;检测与控制仪表。 好氧发酵设备:机械搅拌式、通风搅拌式 厌氧发酵设备:酒精发酵罐

4.3.3.1机械搅拌式发酵罐 1、通用式发酵罐 传热装置:夹套、蛇管 搅拌装置:圆盘涡轮搅拌器 空气分布管:单孔管、环形管

4.3.3.1机械搅拌式发酵罐 2、自吸式发酵罐 罐内为负压,易染菌 无需空压机

4.3.3.2通风搅拌式发酵罐 1、循环式通风发酵罐 无搅拌装置,结构简单,清洗 方便,节省动力 2、高位塔式发酵罐

4.3.3.3 厌氧发酵设备 无需通氧,尽量装满发酵液以排 除空气;培养基预先还原;排气 口水封;大剂量接种。

NBS bioflo 110发酵罐

4.3.4 下游加工工程 下游加工工程:从发酵液中分离和精制有关产品的过程。 发酵液性质:成分复杂,发酵产品浓度低,且不稳定,液相黏度大,悬浮物颗粒小,提取成本高 单元操作:发酵液预处理和固液分离、提取、精制、成品加工

4.3.4.1发酵液预处理和固液分离 1、预处理 目的:改善发酵液性质,便于固液分离 方法:酸化、加热、加絮凝剂、加电解质 2、固液分离 方法:过滤、离心 3、细胞破碎 高压匀浆破碎法、高速搅拌珠研磨破碎法、超声波破碎法 酶溶破碎法 添加化学试剂

4.3.4.2 提取 目的:浓缩、初步纯化 方法:吸附、离子交换、沉淀、萃取、超滤 吸附法:用于抗生素等小分子物质的提取 离子交换法:用于极性化合物的提取 沉淀法:用于蛋白质提取 萃取法:溶剂萃取、两水相萃取、超临界流体萃取、反胶 束萃取 超滤法:超滤膜,分离、浓缩

蛋白质沉淀方法 1.中性盐盐析法: ⑴在一定的 pH值及温度条件下,改变盐的浓度(即离子强度)达到沉淀的目的,称为“Ks”分级盐析法。 (Ks盐析:固定pH, 温度,改变盐浓度) ⑵在一定的离子强度下,改变溶液的pH值及温度,达到沉淀的目的,称为“β”分级盐析法。 (β盐析:固定离子强度,改变pH及温度。) 2.等电点沉淀法: 蛋白质等电点沉淀法是基于不同蛋白质离子具有不同等电点这一特性,依次改变溶液pH值的办法,将杂蛋白沉淀除去,最后获得目标产物。 3.有机溶剂沉淀法: 许多能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮、甲醇和乙腈,常用于低盐浓度下沉淀蛋白质。

4.非离子型聚合物沉淀法 :20世纪60年代非离子型聚合物开始用于分离血纤维蛋白原和免疫球蛋白。如:聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、葡聚糖等。 5.金属沉淀法 :能与羧基、胺基等含氮化合物以及含氮杂环化合物强烈结合的金属离子,如:Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Cd2+; 能与羧酸结合而不与含氮化合物结合的金属离子,如:Ca2+、Ba2+、Mg2+、Pb2+; 与巯基化合物强烈结合的金属离子,如:Hg2+、Ag+、Pb2+。 6.亲和沉淀:将一个目标蛋白质与键合在可溶性载体上的亲和配体络合成沉淀; 所得沉淀物用一适当的缓冲溶液进行洗涤,洗去可能存在的杂质; 用一种适当的试剂将目标蛋白质从配体中离解出来。

两水相萃取法 两水相体系是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间,在水中以适当的浓度溶解后形成的互不相溶的两相或多相水相体系。高聚物- 高聚物- 水体系主要依靠高聚物之间的不容性,即高聚物分子的空间阻碍作用,促使其分相。 两水相萃取与水- 有机相萃取的原理相似,都是依据物质在两相间的选择性分配,不同之处在于萃取体系的性质差异。当生物物质进入两水相体系后,由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等) 的存在和环境的影响,使其在上、下相中的浓度不同。分配系数K 等于两相中生物物质的浓度比,由于蛋白质的K 值不相同(大致在0.11~10 之间),因而两水相体系对各类蛋白质的分配具有较好的选择性。

超临界流体萃取 所谓超临界流体,是指物体处于其临界温度和临界压力 以上时的状态。这种流体兼有液体和气体的优点,密度大,粘 稠度低,表面张力小,有极高的溶解能力,能深入到提取材料 的基质中,发挥非常有效的萃取功能。而且这种溶解能力随着 压力的升高而急剧增大。这些特性使得超临界流体成为一种好 的萃取剂。 超临界流体萃取,就是利用超临界流体的这一强溶解能力 特性,从动、植物中提取各种有效成份,再通过减压将其释放 出来的过程。 超临界流体萃取法是一种物理分离和纯化方法, 一般以CO2为萃取剂,在超临界状态下,加压后使其溶解度增大。 将物质溶解出来,然后通过减压又将其释放出来。该过程中CO2 循环使用。该技术除可替代传统溶剂分离法外,还可以解决生 物大分子、热敏性和化学不稳定性物质的分离,因而在食品、 医药、香料、化工等领域受到广泛重视。

反胶束萃取法 反胶束是分散于连续有机相中的、由表面活性剂所稳定的纳米尺度的聚集体。 在反胶束溶液中,构成反胶束的表面活性剂的非极性尾向外伸入非极性溶剂中,而极性头则向内排列形成一个极性核。蛋白质及其他亲水物质能够进入反胶束的极性核内,由于周围水层和极性头的保护,保持了蛋白质的天然构象。

超滤 超滤(UF)是一种薄膜分离技术,依靠流体切向流动和压力驱 动的过滤过程,并按分子量大小来分离颗粒,以压力差为推动 力,原料液在膜面上流动,原料液中的溶剂和小的溶液粒子从 高压的料液透过膜的低压侧,溶解物质和比膜孔径小的物质将 能作为透过液透过膜,透过的液体一般称为滤出液或透过液, 不能透过膜的物质将被超滤膜所截留,被截留的部分一般称为 浓缩液,浓缩液在滤剩液中浓度增大,达到溶液的净化、分离 与浓缩的目的。 超滤膜是一种膜分离设备,但膜孔径要比微孔膜小的多,属于 分子级,它能滤除细菌、病毒、胶体物及小分子量的微粒。它 在常温下使用,过滤性能可靠、精确度高,不需加化学试剂即 能达到分离、浓缩、纯化分级的目的。

超滤设备 垂直流超滤杯 切向流超滤器

4.3.4.3 精制 方法:沉淀、超滤、层析分离 层析技术:基于不同物质在流动相和固定相之间的分配系数不同而将混合组分分离的技术。当流动相(液体或气体)流经固定相(多孔的固体或覆盖在固体支持物上的液体)时,各组分沿固定相移动的速度不同而分离。能用于微量样品的分析和大量样品的纯化制备。

4.3.4.4 成品加工 浓缩、无菌过滤、去热源、干燥、加稳定剂 热源物质是指微生物产生的某些多糖蛋白复合物等发热的物质。它们是一类分子量很大的物质,所以可以利用凝胶过滤的排阻效应将这些大分子热源物质与其它相对分子量较小的物质分开。也可以用超滤的方法去除。

4.5 典型产品的发酵生产 4.5.1 抗生素发酵生产 4.5.2 氨基酸发酵生产 4.5.3维生素发酵生产

4.5.1 抗生素发酵生产 青霉素发酵生产菌株 培养基 碳源、氮源、前体(苯乙酸、苯乙酰胺)、无机盐 发酵工艺:种子制备,发酵培养、发酵后处理

4.5.2 氨基酸发酵生产 谷氨酸发酵生产的菌种 原料制备 扩大培养 发酵生产 谷氨酸提取

4.5.3 维生素发酵生产 维生素C的发酵生产