高效液相色谱法的应用和进展 新疆分析测试中心 杨 中

讲 课 提 纲 1、概述 2、液相色谱在食品分析中的应用 3、液相色谱在食品安全分析中的应用 4、液相色谱在环境分析分析中的应用 5、液相色谱在医药研究中的应用 6、液相色谱在精细化工中的应用

概述 高效液相色谱法 高效液相色谱法（high performance liquid chromatography, HPLC）又称高压液相色谱法，是在经典液相色谱法的基础上，引入了气相色谱的理论，于20世纪60年代末迅速发展起来的一种新型分离分析技术。

高效液相色谱法以经典液相色谱法为基础，但又不同于经典液相色谱法。与经典液相色谱法相比较，高效液相色谱法的优点是高效、高速、高灵敏度、高自动化。

高效液相色谱法是在气相色谱法的理论和实验技术基础上发展起来的，与气相色谱法相比较，它的突出优点是应用范围广。

高效液相色谱法不受样品挥发性和热稳定性的影响，只要把样品制成溶液便可进行分析，特别是一些生物大分子例如氨基酸、蛋白质、生物碱、核酸、甾体、脂类、维生素等，都可应用高效液相色谱法进行分析测定。

气相色谱法采用的流动相是惰性气体，仅起载带作用，而高效液相色谱法中流动相可选用不同极性的液体，参与对组分的分配作用，使分离效率提高。此外，高效液相色谱法分离分析后的样品馏分易于收集

高效液相色谱法的缺点是仪器复杂、价格昂贵，并且使用有机溶剂，不仅使用费用较高，而且对人体健康有害、对环境有污染。

关于色谱 色谱是一种分离工具，而不是传统意义上的分析仪器 常见的分离方式： 蒸馏、离心、电泳、过滤、超滤 等等 色谱 是其中一种分离工具

色谱分离的机理 分离是一个物理的过程 流动相（Mobile Phase） 固定相（Stationary Phase） 样品（溶解于流动相中的溶质）

HPLC的仪器配置及流程 HPLC色谱柱 数据处理系统 溶剂 自动进样器 检测器 色谱泵 废液

HPLC的仪器配置及流程 溶剂 数据处理系统 色谱泵 自动进样器 色谱柱及柱温箱 检测器

色谱图：HPLC图形结果（Chromatogram） 色谱图即色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图，其纵坐标为信号强度，横坐标为保留时间。 ← 色谱峰 响应值 峰高 峰宽 基线 ↓ 保留时间（分）

液相色谱应用：分析型液相色谱 定量分析主要基于与标准品的比较 定性分析；不是色谱的强项 对定量及定性分析的要求 是其最大应用领域 基于样品的保留时间比较 借助于和其联用的紫外、质谱或其他检测器 对定量及定性分析的要求 灵敏度、精度及准确度的要求 样品量的要求；复杂样品的分析能力 容易使用

液相色谱原理 － 基本概念及方法开发 液相色谱实验所需的基本参数 以上参数即构成一个具体的HPLC方法；亦称色谱条件 流动相：种类及配比，等度或梯度 固定相：色谱柱类型及内径、长短 流动相输送系统参数：流速 检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等 温度控制 进样量 以上参数即构成一个具体的HPLC方法；亦称色谱条件

评价液相色谱方法的标准 问题：什么样的分离结果是好的？分离度？

色谱泵及液相色谱对泵的要求 稳定平滑并且重现性好的流速 可靠且充分的溶剂混合 有效的流速范围 滞后体积 目的：在任何情况下保持最高精度 准确及重现的自动溶剂混合 准确及重现的梯度形成 有效的流速范围 制备色谱或微柱、窄柱色谱更为关注 滞后体积 仅仅应用于梯度实验 目的：在任何情况下保持最高精度

梯度：高压混合 高压梯度 使用多台色谱泵，在泵后混合 配置灵活、简单，脱气简单 易调节梯度的滞后体积

梯度：低压混合 低压梯度 如设计不当，梯度的 准确性受影响 用单泵产生梯度，泵前（低压端）混合 对脱气要求高 不易调节梯度的滞后体积 滞后体积（系统 体积）设计合理

梯度滞后：系统体积的影响 检测器 进样器 色谱柱 低压梯度 滞后(系统)体积 死体积/谱带展宽体积(无色谱柱时) 比例阀 检测器 进样器 A B C D 色谱柱 溶剂输送系统(泵) 低压梯度 阻尼器 混合器 滞后(系统)体积 死体积/谱带展宽体积(无色谱柱时) 注意∶滞后体积包括进样器、阻尼 器、混合器及其管路 溶剂输送系统(泵) 检测器 进样器 色谱柱 梯度混合器 高压梯度

梯度滞后大小的影响 滞后体积太大会引起梯度变化的延迟 滞后体积的不同会使方法转换麻烦 普通分析型液相色谱的滞后体积为2~4ml 例如：滞后体积为2.0ml，流速1.0ml/min 实际梯度会比设置值晚 2 分钟响应，没有问题 对微柱色谱影响更大，同上例但流速0.1ml/min 实际梯度会比设置值晚20 分钟响应，不能接受 滞后体积的不同会使方法转换麻烦 滞后体积比文献大或小都会使方法不能重现 滞后体积的变化会导致梯度重现性不好 普通分析型液相色谱的滞后体积为2~4ml

滞后体积变化的影响 设计不好的HPLC系统，滞后体积随反压变化 滞后体积随反压变化的后果： 用静态梯度混合器；固定滞后体积可明显改善梯度特性 梯度的准确性不好，造成：方法的适应性不好 用静态梯度混合器；固定滞后体积可明显改善梯度特性 梯度百分比 保留时间 梯度曲线 好的梯度 滞后曲线 不好的梯度 固定滞后体积，改善了梯度性能 普通的低压梯度系统

色谱柱反压变化对梯度实验的影响 Pump with pulse damper 5 6 8 10 12 -100 200 400 600 900 mAU Minutes Methylparabene Ethylparabene Propylparabene Butylparabene Pump with pulse damper Back-pressure: 60 bar, 85 bar and 105 bar Variation: > 2% 5 6 8 10 12 -100 200 400 600 900 mAU Minutes Methylparabene Ethylparabene Propylparabene Butylparabene P680A LPG without pulse damper Back-pressure: 60 bar, 85 bar and 105 bar Variation: < 1% Parabenes are widely analysed, since Parabenes are used as preserving agents in cosmetic products. In addition it is a very simple application that shows the effect of back pressure on retention. Notice the deviations on the system with the pulse damper. Eventually these peaks will fall out of the retention window, and not be detected. Acclaim 120, C18, 5 µm, 4.6 x 100 mm; 0.5 mL/min; 25°C; 5 µL injection volume; UV detection at 256 nm; Eluent (A) Water and (B) Acetonitril; Gradient: 30 % b to 100 % B in 10 min; Methyl-, Ethyl-, Propyl- and Butylparabene, 10 mg/L each

液相色谱的检测器 常规检测器 高端检测器 示差折光检测器（Refractive Index） 紫外/可见光吸收检测器（UV-Vis） 荧光检测器（Fluorescence） 蒸发光散射检测器（Evaporative Light Scattering） 其他检测器（Other Detectors） 高端检测器 光电二极管矩阵检测器（Photodiode Array） 质谱检测器（Mass Spectrometry）

HPLC检测器应提供的功能 对样品有响应并有一个输出信号 应该提供在检测器响应值与样品浓度之间的线性关系；并且所设计的校正技术应该促进这种关系 但是： 由于受HPLC系统其他部件的影响会产生响应与浓度之间关系的与线性偏离现象 并不是所有的检测器是线性的 受HPLC系统其他部件的影响，检测器的表现可能与其最佳水平有较大的差距 All HPLC detectors, regardless of design should provide the functions outlined here.

用于HPLC的检测器 没有任何一种单独的检测器可以适应所有的液相色谱分离！ HPLC检测器可以分为： 溶质性质检测器（Solute property detectors） 对溶质的物理或化学性质响应，一般不反应流动相的变化（选择型） 整体性质检测器（Bulk property detectors） 不管是否有溶质，对流动相任何物理性质的变化作出响应（通用型）

不同种类的检测器的分类 溶质性质 整体性质 紫外/可见光检测器 固定波长 可变波长 荧光检测器 光电二极管矩阵 电化学检测器 放射化学检测器 氮/硫检测器 质谱检测器 紫外/可见光检测器 整体性质 示差折光检测器 蒸发光散射检测器 电导检测器

理想的HPLC检测器 高灵敏度；可忽略的基线噪音 宽的线性范围 独立于流动相及操作参数的响应 长时间操作的稳定性 低死体积 非破坏性 选择性 对压力、温度及流速等变化不敏感 长时间操作的稳定性 低死体积 非破坏性 选择性 A prefect detector design would provide all of the listed features. Unfortunately, no such detector exists and any detector design is forced to make compromises. As we will see throughout the presentation, knowledge of these compromises and the effects of the obtained results allow users to use detectors for their maximum benefit.

灵敏度：信噪比 6:1 灵敏度是信号与噪音的比值；即峰高与基线噪音的比值（S/N） 检测限（LOD）：S/N = 3 定量限（LOQ）：S/N = 10 好的信噪比有利于： 更好的色谱峰确认 更好的定量 更好地完成色谱峰纯度/均一性 6:1 S Sensitivity is one of the most widely cited detector requirements. Generally speaking, most users demand detector that are highly sensitive to their compounds of interest. Many users describe sensitivity simply as the net response (or signal) of the peak (this may be height count, absorbance units, millivolts, intensity, and others). The true measure of sensitivity is better described as a ratio of the signal intensity divided by the intensity of the baseline noise. N

2. 确定特定HPLC过程、样品预处理等的需求 4. 选择HPLC方法；初步分离；建立最佳分离条件 方法开发的过程 1. 得到样品信息，确定分离目标 2. 确定特定HPLC过程、样品预处理等的需求 3. 选择检测器及其条件 4. 选择HPLC方法；初步分离；建立最佳分离条件 5. 优化分离条件 6. 检查特定过程的问题及需要 7. 定量校正 8. 日常使用的确认 In general, development of a HPLC method often follows the steps outlined here. As you can see, choosing a detector is an important part of the method development process. Correct (or incorrect) detector selection will influence the success of the method. Limits of detection, limits of quantitation are directly influenced by the detector choice. Other factors can be indirectly influenced as well. For example, a very selective detector (MS or FLD) can minimize the need for perfect separation conditions. Adapted from: Snyder, L.R.; Kirkland, J.J.; Glajch, J.L; Practical HPLC Method Development 2nd Ed., Wiley-Interscience, New York, 1997, p. 2

选择液相色谱的检测器 要考虑的因素： 你要分离的化合物/样品的化学特性 流动相的影响（溶剂、缓冲盐改性剂等） 梯度还是等度 灵敏度需求 化学结构、分子量及紫外光谱等等 流动相的影响（溶剂、缓冲盐改性剂等） 梯度还是等度 灵敏度需求 是否有双检测的需求

选择液相色谱的检测器 通用检测器 RI ELSD MS 灵敏度 mg ng pg 线性范围 104 否 103 流速敏感 是 否 是 线性范围 104 否 103 流速敏感 是 否 是 温度敏感 是 否 否 破坏性 否 是 是 选择性检测器 ABS FL EC Cond MS 灵敏度 ng pg fg pg pg 线性范围 105 103 106 105 103 流速敏感 否 否 是 是 是 温度敏感 否 否 是 是 是 破坏性 否 否 是 否 是 This slide outlines some of the varoius detector capabilities and would be the first step in detector selection.

示差折光（Refractive Index）检测 示差折光检测器（RI）是第一个商品化的液相色谱检测器（上世纪六十年代末、七十年代初） 通常被认为是一种通用检测器 检测溶液中所有被溶解的溶质 － 非特异性 任何光学介质的折光率都被定义为光在该介质中与真空中的速度之比值 R S

示差检测器 － 基本原理 检测基于被分析物的折光指数的差异 典型的应用领域 测量样品流路与参比流路在折光指数上的差别 当折光指数差异最大时灵敏度也达到最大 并不测量绝对的折光指数而是测定折光指数的差别（Differential RI） 典型的应用领域 没有紫外吸收、荧光的化合物，例如： 碳水化合物（Carbohydrates）、聚合物（Polymers） 脂肪酸（Fatty Acids）及油脂类（Lipids）

示差检测器的优、缺点 优点 缺点 通用检测器 容易使用；通常来说是比较耐用的检测器 维护成本低 灵敏度低、选择性差 对流速、温度及粘度的变化敏感 不能用于梯度方法 色谱峰可能是正的，也可能是负的 Universal detection – Of all the universal detectors, RI is the most universal Ease of use – Very few instrument settings (For Waters – Sampling Rate, Filter Time, Polarity, Unit label, sensitivity and Internal Temperature Generally robust detectors – The only Waters detector that does not require a PQ Low maintenance costs – See Above Lack of sensitivity Lack of selectivity Sensitive to changes in flow, temperature, viscosity Not useful for gradient elution methods Peaks may be positive or negative

示差检测器的优点 － 通用性 根据随机统计；任何一对液体都会有大约0.07的折光率差异 因此；除非正好被分析的样品与溶液的折光指数完全相同，都会被检测到 Separation of Lactose-Reduce Milk MV -20 -10 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 Minutes 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 葡萄糖 乳糖 半乳糖

示差检测器的缺点 － 灵敏度 缺乏灵敏度 － 和其他检测器相比，RI检测器一般灵敏度较低 UV@254 nm S/N >15000:1 MV -30.00 -25.00 -20.00 -15.00 -10.00 -5.00 0.00 5.00 10.00 15.00 Minutes 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 AU 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 Refractive Index S/N ~125:1 流动相： MeOH/H2O 60:40 流速： 1.0 mL/min 色谱柱： C18 色谱柱温：30 ºC 检测温度：35 ºC 样品： Paraben Mixture Paraben mixture. Isocratic 60/40 MeOH Water

示差检测器的缺点 － 不适宜作梯度 流动相： A= CH3CN/H2O 75:25 B= CH3CN 流速： 1.4 mL/min MV -2600 -2400 -2200 -2000 -1800 -1600 -1400 -1200 -1000 -800 -600 -400 -200 200 400 Minutes 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 0% B 25 % B 流动相： A= CH3CN/H2O 75:25 B= CH3CN 流速： 1.4 mL/min 色谱柱： NH2 色谱柱温： 30 ºC 检测温度： 35 ºC Chromatography Forum: Is RI with a Reverse Phase gradient possible? By XXXXXXXXX: I have a good separation of a multi-substituted, cyclohexane that fully resolves ~12 different oligomers. I can detect the components by MS, but I would like to use a standard LC detector instead. There is virtually no adsorption above 230nm and below 230nm picks up solvent interference. I’m considering using RI detection and afterward subtracting a blank run. Is there any hope of this working or would I be wasting my time? http://www.chromforum.com/

示差检测器的缺点 － 对温度敏感 室温变化 RI 基线 流动相 － 甲醇 @ 0.25mL / minute Temp.(Deg C) 18.5 19.0 19.5 20.0 MV -1.00 0.00 1.00 2.00 Minutes 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 室温变化 RI 基线 流动相 － 甲醇 @ 0.25mL / minute 检测器温度 － 35˚C；没有使用柱温箱

吸光度（Absorbance UV/Vis）检测 目前实验室中最流行的选择 多数公司约75%的检测器是吸光度检测器（其中50%是多波长，25%是PDA） 测量通过溶液后的紫外或可见光光强度的损失 吸光度与样品浓度呈线性关系 在被测物的最大吸收波长处检测时灵敏度最大

吸光度检测器（UV/Vis）－ 优点 这种检测器简单、可靠 多数人熟悉并喜欢这种技术 可以作梯度实验并且是非破坏性的 大多数有机化合物有一定程度的吸光度 一般来说灵敏度还可以 Parabens at 254 nm The majority of organic compounds can be analyzed by UV/VIS detectors. Almost 70% of published HPLC analyses were performed with UV/VIS detectors. This fact, plus the relative ease of its operation, makes the UV detector the most useful and the most widely used LC detector. AU 0.00 0.05 0.10 0.15 Minutes 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 Parabens at 254 nm

吸光度检测器（UV/Vis）－ 缺点 由于不是所有化合物都有吸光度，因此不是通用检测器 对某些化合物的检测灵敏度不及其他检测器 样品中不同化合物的最大吸收波长不同时，需要使用多波长检测，或使用折衷的波长 受流动相组成的影响： 用截止波长以上至少5～10nm作为工作波长 缓冲盐、离子对试剂、胺改性剂也会有影响

背景吸收的影响 实际 浓度 理想 1 吸光度 2 背景吸收 背景吸收降低了线性范围 多数流动相有紫外吸收

UV Spectrum of Eluents with 0.1% TFA Against HPLC Grade H2O Blank 背景吸收对紫外检测器噪音的影响 UV Spectrum of Eluents with 0.1% TFA Against HPLC Grade H2O Blank AU 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 1.10 1.20 1.30 1.40 1.50 nm 200.00 210.00 220.00 230.00 240.00 250.00 260.00 270.00 280.00 290.00 H20 with 0.1% TFA 50% ACN with 0.1% TFA First for some background information. Solvent Mixing can be critical when gradient separations are performed using solvents that different UV absorbing characteristics. This slide shows that 0.1% TFA has an increased absorbance at low UV (e.g., 214nm) when present in Acetonitrile vs. Water.

溶剂混合的基线噪音 色谱条件 色谱柱： C18, 5 µm, 3.9x150mm at 35º C. 流动相： 图1；好的梯度系统 图2；一般的二元梯度系统 图3；一般的四元梯度系统 色谱条件 色谱柱： C18, 5 µm, 3.9x150mm at 35º C. 流动相： A: 0.1% TFA in Water. B: 0.1% TFA in Acetonitrile. 梯度： 5 - 40% B in 35 min. 流速： 1.0 mL/min. 样品： 水（10 µL inj. vol.） 检测： 214 nm To demonstrate how HPLC system design affects baseline performance, a simple gradient of increasing Acetonitrile concentration was used employing a mobile phase modifier (0.1% trifluoroacetic acid) which absorbed at low UV wavelengths. Figure 1 clearly demonstrates how baseline stability is affected by HPLC system design and how Waters Alliance Technology yields superior results to that of Brand A (Agilent) in this example. (Note: The increase in baseline from 0 to 26 min is normal since 214nm absorbance of TFA increases with increased concentrations of acetonitrile.)

为何如此重要？ 五个小肽的5ng进样，好的色谱系统非常容易鉴别出所有峰。在不好的色谱系统中，第一个峰则消失在基线噪音中。 Effect of Solvent Delivery on Limit of Detection is the “So What”: Limit of detection (LOD) is defined as the lowest analyte concentration that can be detected over baseline noise. It is expressed as a concentration at a specified signal-to noise ratio (usually 2:1 or 3:1). Using data in Table 1, the expected LOD at two times the signal to noise was calculated for each of the evaluated systems. To verify the calculated limits of detection, a 1:10 dilution of the five synthetic peptide test mix was injected onto each of the HPLC systems with results shown in Fig. 3. Again, Alliance technology yields superior LOD results compared to the other systems. 五个小肽的5ng进样，好的色谱系统非常容易鉴别出所有峰。在不好的色谱系统中，第一个峰则消失在基线噪音中。

基线噪音对积分的影响 1.224 1.183 Caffeine @ 271 nm

荧光（Fluorescence）检测 发荧光的化合物吸收光（UV或VIS），其分子达到激发态，其返回到基态时发射光的现象即荧光 激发态 基态 振动能（2） S1 激发 （1） 发射 （3） 基态 S0 Analytes not only absorbs UV/Vis radiation but also releases the energy in the form of light of longer wavelength. 1. 分子在吸收UV或可见光后进入激发态，分子达到不稳定的高能量状态。 2. 电子失去过剩的能量成为振动能，并达到最低的激发单重态。 3. 电子失去能量达到基态时发出荧光 共轭及芳香族化合物最容易有荧光现象

荧光检测器原理

荧光检测器的应用 环境中的污染物 食品、饮料 生物技术及制药 多环芳烃(PAH)，多酚，氨基甲酸酯等 食品中的毒素；例如：黄曲霉毒素 染料 维生素及衍生氨基酸 生物技术及制药 多环芳烃（PAH） 维生素 This slide show a small sampling of the compound classes that are often analyzed using FL detectors. Remember that some compounds have a native fluorescence while some may require either a pre-column or post column derivitization to provide fluorescent species. Carbamate Pesticide = Carbofuran Aflatoxin = Aflatoxin B1 PAH = Pyrene Vitamin = Vitamin A Amino Acid = Leucine +ACQ (Accutag Chemistry) 黄曲霉毒素 氨基甲酸酯类杀虫剂

荧光检测器的优点 选择性提高 灵敏度提高（在 pg/fg 范围） 低背景技术 mV -0.10 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 Minutes 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 6.894 9.639 Selectivity - Most molecules that absorbed UV light with not naturally fluoresce - Because 2 distinct wavelenght are used (emmission and excitation) the chance of detecting interfering peaks and compound not of interest is significantly reduced. Sensitivity – Increased sensitivity is primarily due to the increased selectivity and the low background effect (see next paragraph) Low background technique – In an absorbance detector (UV/VIS), the signal is measured relative to the difference in light intensity between a compound of interest being present versus that compound being absent. At very low levels of analyte, the noise from the detector becomes more and more dominant as analyte levels drop. In FL, the detector is looking for light emitted by the compound of interest form an otherwise dark background. This results in the detection limit being a combination of electronic noise emitted by the detector and the dark current of the PMT. Chromatogram Details Waters Breeze System (1525/717+/474/Satin/Breeze Software) Waters XTerra RP18 3.0X150 mm @ 40 C Mobil Phase = 5 mMol Ammonium Bicarbonate Buffer (pH 9.6)/ Acetonitrile 80:20 @ 0.60 mL/minute Sample – 5 uL injection of 40 pg/uL of MDA (3,4-Methyenedioxyamphetamine) aka “Love Drug” + MDMA (3,4-Methyenedioxymethamphetamine) aka “Ecstasy” MDA及MDMA 柱上200pg Excitation =280 Emission =360

荧光检测器的缺点 不是所有化合物都有荧光，需要衍生 检测器对溶解气体及其他淬灭物质（如甲醇）敏感 对Ex及Em的最佳，易受温度、溶剂的极性和粘度、溶剂的pH值及样品浓度影响 多数仪器的批次间差异较大，同一型号的不同荧光检测器会得到不同的结果。 有的仪器信号及噪音大于另一台2～3倍，光电倍增管的特征是导致这个现象的原因。 Roughly about 15% of all compounds have a natural fluorescence.

溶剂中溶解的气体对响应值的影响 Minutes 20.5 21.0 22.0 1000 MV 充分脱气 未充分脱气 1 2 3 Column - PAH Column @ 27º C Eluent A: Water Eluent B: Acetonitrile Gradient: 60% B to 100% B using curve 9 in 12 minutes Hold 11 minutes Back to initial conditions Flow Rate 1.2 ml/min Injection: 20ul Time programmed wavelength changes 20.5 21.0 22.0 1000 MV 充分脱气 未充分脱气 Fluorescence Detector 1 2 3 1. Benzo(b)flouranthene - 400 ppb 2. Benzo(k)fluoranthene - 200 ppb 3. Benzo(a)pyrene

浓度对芘（Pyrene）最大激发波长的影响 Emission  Excitation  ~ 10–3 M ~ 10 –5 M 在正己烷中 From: Turro, N.J., Modern Molecular Photochemistry Menlo Park CA, Benjamin/Cummings Publishing, 1978

蒸发光散射（Evaporative Light Scattering） 用氮气把流动相吹成细雾状 流动相的液滴通过一个预加热的腔体后被蒸发掉 蒸发的溶剂被从检测器中除去 溶质的挥发性小于流动相，因此产生颗粒束与光束相交 被颗粒散射的光由光电倍增管（PMT）收集 PMT的输出与溶质的存在量呈比 例关系

蒸发光散射检测器原理 Evaporative Light Scattering 简称：ELSD Waters is currently working on development of a ELSD for general purpose LC. The purpose of this section is to create some awareness of this technology before the launch of the Waters design ELSD. Current Manufactures of ELSD Devices Include: Alltech – ELSD 2000 Polymer Labs – PL-ELS 2000 Sedex – Models 55, 75, 75C ESA – Model 301 ,

ELSD － 优点及应用领域 通用型 － 比流动相挥发性小的物质都能被检测 应用领域： 可以作梯度实验；检测下限可到纳克级水平 对环境条件不敏感；可以使用有强紫外吸收的溶剂作流动相 应用领域： 碳水化合物 油脂及脂肪酸 未衍生的氨基酸 制药行业 表面活性剂 天然产物

ELSD － 缺点 不能使用不挥发性的流动相（例如：磷酸盐） 要求使用雾化气源（典型的是氮气） 不同的色谱条件下雾化及除溶剂的参数需要重新优化 破坏性技术 蒸发出的溶剂要因到户外或通风橱里 对挥发性化合物的检测不理想 一般得到的是非线性校正曲线 某些化合物的检测灵敏度不如其他检测器

光电二极管矩阵（Photo Diode Array） 简称：PDA或DAD The diagram show the generic layout of a photo diode array detector. All of the energy from a broad spectrum lamp (or lamps) usually covering both the ultarviolet and visible wavelength range is passed through a flow cell. The light is then split into its component wavelenghts on a grating. A series of diodes measures the light intensity over the entire wavelenght range. The result is two types of data, a traditional chromatogram (time vs absorbance) at any wavelentgh in the operating range, and a spectrum (wavelength vs absorbace) at any given time point. Data collected from a PDA detector is often refered to as 3 dimensional data.

PDA检测器 － 特点 三维水平的吸光度检测器 二极管矩阵检测器是在1982年首度出现的 在整个UV-Vis带宽上检测吸光度 都需要相应的软件进行数据的分析 Intensity vs Time at any given wavelength Intensity vs Wavelength at any given time point.

PDA检测器的用途及要求 光电二极管检测器可以提供许多又用的功能 像其他所有的UV/Vis检测器一样，需要： 另外；还需要： 光谱信息 色谱峰纯度 谱库拟合 像其他所有的UV/Vis检测器一样，需要： 高的信噪比；好的线性 另外；还需要： 光学分辨率 光谱灵敏度及光谱分析软件

光学分辨率（带宽） 好的光谱分辨率可得到高质量的光谱信息 Benzene 3.0nm vs 1.0nm 损失分辨率，UV最大波长移动 nm 230.00 250.00 270.00 nm Benzene 3.0nm vs 1.0nm 损失分辨率，UV最大波长移动 1.0 nm 3.0 190 5.0 Spectral resolution (or Bandwidth) is the wavelength interval (in nm) between data points in an acquired spectrum. The minimal resolution of the 2996 detector is 1.2 nm. As an example, in 3D mode, the 2996 averages 3 adjacent diodes for each reported wavelength when the spectral resolution is set to 3.6 nm. 好的光谱分辨率可得到高质量的光谱信息

分辨率与色谱性能 高分辨率给出更多数据点（同样波长范围） 高分辨率有更好的线性 低分辨率的数据文件尺寸较小 宽的光学带宽可以得到更高的光通量（灵敏度） 14.4 nm 1.2 nm Spectrum of Caffeine

PDA的优点及缺点 优点 缺点 通用的UV/Vis检测 好的选择性、线性 提供色谱峰的UV/Vis光谱图（峰确认） 可提供纯度估计 低光学通量（较窄的带宽通量） 与普通UV/Vis相比更复杂，容易漂移 灯输出能量随时间降低

质谱（Mass Spec.）作为HPLC检测器 m/z +/- MS： 质谱（Mass Spectrometry）是一种按照分子量及其电荷分离物质的技术，经过多年的不断开发及改进，已经使质谱成为一种多功能、高灵敏度，并被愈来愈广泛使用的分析技术。 LC/MS： 液相色谱与质谱的连用。需要： 除去HPLC的溶剂；产生离子；分离离子；检测离子；计算离子强度；处理数据

除去溶剂 LC MS 离子化前的准备： Liquid Gas Co(l) C+/-(l) C+/-(g) Co(g) 雾化（Nebulization） 蒸发溶剂或解吸附（Evaporation/ or Desorption） 大气压下或减压下（Atmosphere or Pressure reduction） 离子化（Ionization － Ion Source） Liquid Gas LC MS Co(l) C+/-(l) C+/-(g) Co(g) Evaporation Desorption LC/MS Interface

LC-MS的离子产生 电子轰击源（Electron Impact / Electron Ionization － EI） 大气压电离源（Atmospheric Pressure Ionization － API） 大气压化学电离源（Atmospheric Chemical Ionization － APCI） 电喷雾源（Electrospray － ESI） 200 300 400 500 600 700 800 m/z 529 527 233 489 543 APCI(-): 40V 100 57 97 147 219 278 515 530 EI Mass Spectrums of Irgonox (MW 530), a polymer additive.

LC-MS技术的应用

色谱的数据类型 采集类型： 极性切换： 单离子模式（SIR） 扫描模式（Scan） 总离子流（TIC或BPC） 正离子 负离子 ESI -ve 180-400 m/z TIC ESI +ve 180-400 m/z TIC In API, a compound can acquire a positive or negative charge. Some compounds can acquire both, which is dependent on their functional groups and proton activity in its environment. This then requires that the hardware, the mass spectrometer, be capable of acquiring a chromatogram in the negative or positive mode or both in a single run. In this example we have acquired an SCAN chromatogram in the negative mode and positive mode. Prednisolone and Beta-Methazone only show in positive mode while Lansoprazole shows in both and Ibuprofen shows strongly in negative mode. 采集类型： 单离子模式（SIR） 扫描模式（Scan） 总离子流（TIC或BPC） 极性切换： 正离子 负离子

离子排序及检测 离子排序方式 检测方式 四极杆（Quadrupole） 离子阱（Ion Trap） 飞行时间（Time of Flight） 磁质谱（Sector Mass Analyzers） 富里叶变换（Fourier Transform） 检测方式 电子倍增 光电倍增 ……

Adapted from: R. Willoughby et al ‘A Global View of LC/MS’, 1998 液相色谱的分离依然重要 标称分子量在250的化合物的数量超过了1500！ Adapted from: R. Willoughby et al ‘A Global View of LC/MS’, 1998

cis-10-hydroxyamitriptyline (ZHAT) 液相色谱的分离依然重要 2.60 min trans-10-hydroxyamitriptyline (EHAT) 2.80 min cis-10-hydroxyamitriptyline (ZHAT) 9.60 min amitriptyline

其他重要的检测器 电导检测器 Conductivity 电化学检测器 Electrochemical 有机及无机离子 W R C The areas of application of electrochemical detection are not large, but the compounds for which it does apply, represent some of the most important drug, pollutant and natural product classes. For these, the specificity, and sensitivity make it very useful for monitoring these compounds in complex matrices such as body fluids and natural products. Sensitivities for compounds such as phenol, catecholamines, nitrosamines, and organic acids are in the picomole (nanogram) range. 有机及无机离子 儿茶酚胺 Catecholamines 亚硝胺 Nitrosamines 有机酸 Organic acids 碳水化合物 Carbohydrates 氨基酸 Amino Acids

特殊的检测器 N2/S2 NMR Radiochemical

二、液相色谱在食品分析中的应用

1、食品中氨基酸的分析 摘要：采用柱前衍生液相色谱法，测定了3种贝类中天冬氨酸、赖氨酸、亮氨酸等17种氨基酸含量。 衍生试剂为6一氨基喹啉基一N一羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯(AQC)，流动相为醋酸盐一磷酸盐缓冲溶液、乙睛、水，梯度洗脱。色谱柱为AccQ ·Tag(Waters)氨基酸分析柱，紫外检测。

氨基酸是蛋白质的主要组成成分，食品中氨基酸的种类和含量是衡量其营养质量高低的一项重要指标。 国内外早已将氨基酸自动分析仪专用于氨基酸的分析测定，氨基酸分析仪的工作原理是基于离子交换层析法。相比之下，高效液相色谱(HPLC)法因其具有分离度高、选择性

好、可用于多种物质的分析等优点，近些年来已广泛应用于氨基酸的分析测定。随着研究工作的深入，柱前衍生的HPLC法已成为氨基酸分离和分析的重要手段。液相色谱分析方法简单、快速而且样品处理简单，衍生后可直接进样。目前采用柱前衍生结合HPLC法分析测定贝类中氨基酸种类和含量的研究报道尚少，本文采用反相高效液相色谱法，以6一氨基喹啉基一N一羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯(AQC)作为柱前衍生试剂，对海湾扇贝、近江牡蛎和菲律宾蛤仔3种贝类中的17种氨基酸进行了分析测定

盐酸(优级纯)；苯酚(分析纯)；混合氨基酸标准液(Waters公司)，含17种氨基酸，除胱氨酸浓度为1 盐酸(优级纯)；苯酚(分析纯)；混合氨基酸标准液(Waters公司)，含17种氨基酸，除胱氨酸浓度为1.25mmol／L外，其余16种氨基酸浓度均为2.5 mmol／L；lia酸盐缓冲溶液(Waters公司)；衍生试剂，6一氨基喹啉基一N_羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯(AQC)(Waters公司)，用时加入1 ml乙睛，混匀，于55℃烘箱加热30 min至溶解

色谱柱为Waters AccQ·Tag氨基酸分析柱(3．9mmX 15cm)；流动相A，醋酸盐一磷酸盐缓冲液(Waters公司)，按1：10用超纯水稀释；流动相B，乙腈(HPLC级)+高纯水(3+2)；流速1.0 ml／min；柱温37℃ ；检测波长248 nm进样量10 μl，梯度洗脱条件见表1。

，

2．2 样品处理 供试贝类经去壳、烘干(恒重)、研粉后，精确称取一定重量的样品于安瓿瓶中，加入含有1 苯酚的6mol／L盐酸10 ml，冲氮封口，在115℃条件下水解20 h，定容至50 ml。离心后取上清液1．0 ml冷冻干燥，再加2．0 ml 0．02 mol／L盐酸复溶，备用。 2．3 氨基酸衍生步骤用微量注射器移取 10μl稀释的氨基酸标准溶液或样品水解液放入6 mm×50 mm样品管底部，加入70μl硼酸盐缓冲溶液，涡旋混合，加入20 μ l衍生试剂溶液，涡旋混合15 s，用封口膜密封样品管，置于55℃烘箱中处理10 min，从烘箱中取出样品管冷却至室温，供分析用。

其他测定方法 OPA\FMOC衍生法 高效液相色谱参考条件： 色谱柱 HYPERSIL ODS Cl8 51xm 4．Omm ×125ram 柱，或具等同性能的色谱柱。 检测器 紫外检测器，波长338nm，17min后262nm， 灵敏度0．2AUFS。 柱温：40℃。 梯度程序 先用流动相C平衡色谱系统30rain，再用流 动相D平衡色谱系统30min。梯度程序25min停 止，滞留2min。

流动相D：2.72g醋酸钠(NaAC·3H2O)加水 到1000mL，加180 μL三乙胺，用1％醋酸调pH至7.20，再加3.0mL四氢呋喃，混合，经滤膜过滤。 流动相C：2.72g醋酸钠(NaAC·3H20)加水到 20OmL，用l％醋酸调pH至7.20，加400mL乙腈、400mL甲醇，混合，经滤膜过滤。 OPA、FMOC衍生试剂购于惠谱公司 氨基酸标准溶液：lnmol／μL。购于Fluka公 司

标准图谱出峰顺序依次为：天冬氨酸、谷氨 酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、精氨 酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、 亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸

2、食品中的维生素分析

HPLC法测定果汁中游离态的抗坏血酸(Vc)、硫胺素(VB1)和烟酰胺(VB5) 材料与试剂 果汁，L一抗坏血酸(生化试剂)，盐酸硫胺(生化试剂)，烟酰胺(生化试剂)，甲醇(色谱纯)，磷酸。实验用水为超纯水

实验方法 标准溶液的配制 准确称取L一抗坏血酸 20．8 mg，硫胺素10．4 mg，烟酰胺10．1 mg，用 0．01％ 的磷酸(加少量偏磷酸)溶解并定容于50 mL 容量瓶中，然后分别稀释为原浓度的1／2、1／4、1／6、1／8、1／10和1／20，得系列标准溶液，同时配制单标。 标准样品溶液上机分析前临时配制，并过0．45μ m 的滤膜。 1．3．2 样品溶液的处理取一定量的果汁用0.01％磷酸水溶液稀释1倍后，直接过0.45 μ m 的滤膜，滤液上机分析，样品在分析前临时制备

采用Alltima C18(250 mm x4．6 mm，5 m)色谱柱作为分离柱；流动相组成为甲醇和0．01％ 磷酸水溶液。以甲醇和0．01％磷酸水溶液(3：7，V：V)为流动相，流速为1 mL／min，进样量为20 L，柱温为室温，在此条件下，三种维生素均达到基线分离

维生素B1测定方法 色谱条件 色谱柱为Diamonsil(钻石)(250×4．6mm，5ttm) c。8色谱柱；检测波长：激发波长为375nm，发射波长 为435nm；进样量为20ttL。 样品处理 样品提取方法 称取5．0g试样于三角瓶中，准确量取0．1molt／L的盐酸溶液100mL倒人三角瓶中，摇匀，提取，将提取液用定量滤纸过滤，弃去初始5—10mL滤液，收集20mL滤液作为样品备用液。 硫胺素衍生方法取滤液10．00mL于25mL具塞试管中，加入5mL碱性铁氰化钾溶液，加塞用力振荡30次，使其充分氧化，再加10mL正丁醇，用力振荡30次，静置分层，吸取上层液(正丁醇相)用于色谱测定。

3、食品中的糖类分析 用蒸发光散射检测器检测；样品中鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖

目前，糖的测定方法主要有费林试剂法、近 红外分光光度法、连续流动分析法、毛细管电泳 法、气相色谱法和高效液相色谱法等。其中高效 液相色谱一示差折光检测法(RID)是一种快速、 直接的糖分析方法，但RID基于色谱流出物光折 射率的变化来连续检测样品浓度，要求恒温、恒 流速，对工作环境要求较苛刻，无法进行梯度洗 脱，且检测灵敏度不高。蒸发光散射检测器 (ELSD)是一种质量检测器，基于不挥发的样品颗 粒对光的散射程度与其质量成正比而进行检测， 对没有紫外吸收、荧光或电活性的物质以及产生 末端紫外吸收的物质均能产生响应。ELSD稳定性

仪器与试剂 Waters 2695 Alliance高效液相色谱系统，包括 四元梯度泵，Empower色谱工作站，ELSD 2000蒸发光散射检测器(美国Waters公司)；Milli—Q50 高纯水处理器(美国Milhpore公司)；Waters Sep—pak—C， 固相萃取小柱(美国Waters公司)。 D一果糖、D一葡萄糖、L一甘露糖(Sigma公 司)；麦芽糖、蔗糖、D一木糖(Supelco公司)；L一鼠李糖、DL一阿拉伯糖(Fluka公司)；各种糖标样的纯度均大于99％。乙腈、甲醇为色谱纯试剂

(Fisher公司)。实验用水为高纯水。 配制质量浓度均为5 g／L的鼠李糖、木糖、阿 拉伯糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等 8种糖的标准储备水溶液，使用前用水稀释成所需 浓度的标准工作溶液。

1．2 色谱条件 分析柱为Waters carbohydrate 高效糖柱 (WAT044355，250 mm x 4．6 mm i．d．，4 μm)，配有预柱WAT046895，12.5 mm x 4.6 mm i．d．， 4μm)，Waters公司产品。流动相为 (乙腈):(水)= 70:30，流速为1.0 mL／min；柱温为25℃ ；进样量10 μL；ELSD的漂移管温度80℃ ，氮气作载气，流速2.00 mL／min。

摘 要： 采用水提醇沉法提取多糖，用三氟乙酸(TFA)水解，通过1-苯基一3一甲基-5一吡唑啉酮(PMP)衍生水解后的单糖，衍生物用反相高效液相色谱(RP．HPLC)分析，紫外检测。

1 材料与方法 1．1 仪器、材料与试剂 Waters2695— 2996型高效液相色谱仪，色谱柱 (Symmetry C·8，5 μm，3．9×150mm) 美国Waters公司；离心机；电热恒温水浴锅。 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、鼠李糖(Rha)、木糖(Xy1)、 露糖(Man)、葡萄糖(GIc)、半乳糖(Ga1)、三氟乙酸(TFA)(分析纯) 上海医药集团；乙腈(色谱纯) 氢氧化钠、乙酸胺、盐酸、无水乙醇、 丙酮、乙醚(分析纯)

4、食品中的有机酸分析 有机酸以两种状态存在：一种是游离态；一种是 与碱性物质结合为成盐化合物，其阳离子部分不直接 干扰酸味。其中对酸感起主要作用的有机酸有五种， 分别是：酒石酸，苹果酸，柠檬酸，乳酸和琥珀酸。 这五种酸的口感不同：酒石酸给人感觉是尖酸粗硬， 苹果酸是生青尖酸，柠檬酸是清新凉爽，乳酸的酸性 比较弱，略带一些乳香，琥珀酸是先咸后苦。在相同 的pH值下，有机酸的酸性不同，苹果酸>乳酸>酒 石酸；在相同的浓度下，有机酸的酸性是苹果酸>酒 石酸>柠檬酸

常规的有机酸分析一般采用化学法测定，但该方 法易受干扰，预处理步骤较多，时间长，且只能测定 食品中的总酸度；酶法虽然前处理简单，但每次只能 测定一种有机酸；薄层色谱法一次可测定多种有机酸， 但测量精度差，只能半定量和定性；气相色谱法仅适 于测定挥发性有机酸，且需衍生处理，操作繁琐，准 确度较低，难以用于热稳定性差和含量极低的有机酸 分析IJ J；离子色谱法多采用稀强酸做淋洗液，对设备 有一定的腐蚀作用；高效液相色谱法很适合于非挥发 性物质的分析，测量精度好，灵敏度高，并且实现一 机多用，一柱多用。采用反相C18柱对七种有机酸进行测定.

主要仪器 高效液相色谱仪(日本岛津公司)LC一10Avp 反相Cl8柱(日本岛津公司)：Cl8 150X4.6mm

流动相的pH值对各种有机酸的分离效果有很大影响，各种有机酸的保留时间随着流动相pH值的变化而变化

利用反相高效液相色谱法同时测定啤酒中9种有机酸的方法

在反相高效液相色谱中，有机酸分子直接在两相中分配，各种有机酸因分配系数不 同而被分离。但因有机酸极性较大，流动相中水的比例很高，常发生酸的电离。为了使有机酸尽可能以分子形式存在，一般使用酸性流动相来抑止有机酸的解离

三、 在食品安全上的应用

1、食品中农药残留的分析 一种大米中11种氨基甲酸酯类杀虫剂及其代谢产物的多残留快速测定方法。

2、食品中的兽药残留分析 建立动物性食品中磺胺、喹乙醇、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲嘧啶、甲氧苄啶、磺胺二甲嘧啶、呋喃唑酮、磺胺甲基异嗯唑、磺胺(二甲)异嗯唑、磺胺喹嗯啉残留量的高效液相色谱(HPLC测定方法)

3、食品中的真菌毒素分析 棒曲霉素的检测 霉目真菌种类(青霉菌、曲霉菌和丝衣菌等)产生的一种有毒的次级新陈代谢产物，多产生在发霉的水果、谷类和其他食品中 。用HPLC法对番茄酱、果汁及果酒中棒曲霉素进行检测

黄曲霉素B 1的检测 采用先进的生物技术免疫亲和柱提取样品中的黄曲霉素B 1，利用柱后衍生系统和高效液相色谱法相结合，快速、准确 地检测花生奶中的黄曲霉素B1的含量

黄曲霉素B 1是黄曲霉菌的代谢产物， 因此黄曲霉素广泛存在于霉变的粮食及由粮食制得的食品和饮料中。黄曲霉素有许多种，其中黄曲霉素B1的致癌性最强， 而且化学结构非常稳定， 加热到268～269℃才分解[1]，普通的食物处理方法不会减少黄曲霉素B1 的含量，所以黄曲霉素B 1一旦进入人类的食物链，就会对人类的身体健康造成极大的危害。1993年， 黄曲霉素B 被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构划定为工类致癌物质。 目前食品和饮料中的黄曲霉素B1 的检测通常采用薄层色谱法 引、酶标法 和柱前衍生的高效液相色谱法，这些方法在样品处理上较复杂，灵敏度差，回收率不理想，因此建立一个安全、快捷、准确的黄曲霉素B1 的分析方法尤其重要。

实验原理 试样经过甲醇水提取， 提取液经过过滤、稀释后，滤液交联在有黄曲霉素特殊抗体的免疫亲和柱净化，此抗体对黄曲霉素B1 具有专一吸附性，黄曲霉素B1 键合在亲和柱上，用蒸馏水将免疫亲和柱上的杂质除去，以甲醇洗脱免疫亲和柱，洗脱液用HPLC柱后衍生后测定黄曲霉素B1。

将样品过滤，取一定量的样品稀释并经SPE柱萃取后，通过键合有黄曲霉素B。抗体的免疫亲和柱，这时黄曲霉素B 就会键合在免疫亲和柱上，

4、食品中的抗生素分析 高效液相色谱一紫外光度法检测尿液和牛奶中多种头孢类抗生素

固相萃取液相色谱一质谱／质谱联用测定河水中大环内酯类抗生素

5、食品中的防腐剂分析 高效液相色谱法同时测定多种食品添加剂 采用反相高教液相色谱法，一次进样、同时测定食品中的人工合成甜味剂(糖精钠、安赛蜜、甜味素)、防腐剂(苯甲酸、山梨酸)、咖啡因、可可碱和茶碱

由于分析物的最大吸收波长不同，固定波长检测会造成测定灵敏度偏低，而且对于介质复杂的样品，也无法对峰的纯度进行确定性评价。本文采用光电二极管阵列检测器，在195 nm～320 nm范围内对所有分析物进行紫外波长扫描。结果发现，在实验条件下，安赛蜜、糖精钠、可可碱、茶碱、咖啡因、苯甲酸、甜味素、山梨酸的最大吸收波长分别224.0nm，201.7 nm，200.5 nm ，200.5 nm，205.2nm，195.8 nm，195.8 nm和260.7 nm。由于流动相在低于200nm的波长下背景的紫外吸收较高，另外考虑到应使每种分析物的测定灵敏度尽可能的大，且定量方法不致于过分复杂,

最终决定分别采用224 nm，261 nm和202 nm等3个波长分别对安赛蜜、山梨酸、糖精钠、可可碱、茶碱、咖啡因、苯甲酸、甜味素进行测定。此时，安赛蜜、糖精钠、可可碱、茶碱、咖啡因、苯甲酸、甜味素、山梨酸的峰面积为各自最大吸收波长时峰面积的100％ ，95．6％ ，99．8％，99．5％ ，99．0％ ，28．7％ ，60．5％和99．9％ ，灵敏度均能满足实际样品的测定

6、食品中杀菌剂的分析 新型液相色谱一串联质谱法快速测定水产品中孔雀石绿及其隐色代谢物残留。

孔雀石绿是一种三苯甲烷类染料，最先使用在纺织工艺，因其具有消毒和杀菌作用而被广泛使用于水产品的养殖过程中。在被鱼类吸收后，大部分快速转化为隐色孔雀石绿，由于其具有很好的亲脂性，在鱼类的脂肪组织中能形成稳定的残留 。研究表明，此种药物可使许多种类的实验动物发生癌变和基因突变，所以欧盟、美国FDA等宣布禁止其在水产品养殖过程中使用 。

目前，国内外对于孔雀石绿和隐色孔雀石绿检测的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)，气相色谱质谱法(GC-MS)和液质联用法(LCMS)，其中GC-MS仅对隐色孔雀石绿进行了检测。而在PLC和LC MS法中，为了达到同时检测的目的，通常利用一个在线柱后氧化铅柱把对可见光无吸收的隐色代谢物转化为在可见光波长有强吸收的显色母体，然后再进行定量测定。然而氧化铅柱的转化效率及氧化铅柱的寿命都对检测结果产生不确定影响.

本实验没有利用柱后氧化铅柱，通过液相色谱一串联质谱法(LC MS／MS)电喷雾(ESI)离子源正离子扫描模式直接对孔雀石绿和隐色孔雀石绿进行了检测，通过多反应监控方式(MRM)选择多对离子分别对两种物质进行定性定量检测。

7、食品中抗氧化剂的分析 高效液相色谱梯度洗脱同时测定化妆品中 防腐剂、抗氧化剂和杀菌剂

四、液相色谱在环境分析中的应用

1、环境中多环芳烃的分析 微波萃取一高效液相色谱法测定空气总悬浮颗粒物中1 6种多环芳烃

稠环芳烃多为致癌物质。 固定相：十八烷基硅烷化键合相 流动相：20%甲醇-水 ～100%甲醇 线性梯度淋洗，2%/min 稠环芳烃的分析 稠环芳烃多为致癌物质。 固定相：十八烷基硅烷化键合相 流动相：20%甲醇-水 ～100%甲醇 线性梯度淋洗，2%/min 流 速：1mL/min 柱 温：50 ºC 柱 压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器

2. 环境中有机氯农药残留量分析 可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。 固定相：薄壳型硅胶(37 ～50m) 流动相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm2.5mm(内径) 检测器：差示折光检测器 可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。

3、环境中酚类物质的测定 固相萃取．高效液相色谱法测定水中酚类物质

4、重金属元素分析

五、液相色谱在药物分析中的应用

反相高效液相色谱法分离测定复合维生素片剂中VB1、VB2、VB6和烟酰胺

高效液相色谱法测定保健品中的6种水溶性维生素及咖啡因

化妆品中维生素D 、维生素D 的高效液相色谱测定

离子对反相高效液相色谱法测定VB2，B6，VB12 ， VC和叶酸

六、液相色谱在精细化工中的应用

讲课结束 谢谢大家！