Seminar Ⅰ 核 移 植 技 术 及 应 用 报告人 ：孙 志 杰 导 师 ：马小军研究员

精卵结合 胚 胎 细 胞 个 体

显微操作仪

目 录 一 核移植技术简介 二 核移植的分类 核移植的应用 四 展 望

一 核 移 植 技 术 简 介 1.1 定义 ：将供体细胞核移入 去核的卵母细胞中,使后者不经 精子穿透等有性过程即可被激 一 核 移 植 技 术 简 介 1.1 定义 ：将供体细胞核移入 去核的卵母细胞中,使后者不经 精子穿透等有性过程即可被激 活、分裂并发育,使得核供体的 基因得到完全复制。

1 切开卵母细胞透明带 2 挤出卵母细胞细胞核 3 注入供体细胞核 4 电融合仪融合 培养 1 2 3 4 5

异种核移植 同种核移植 生殖性克隆 治疗性克隆 二 核 移 植 分 类 供体细胞核的来源 核移植目的 供受体种间关系 异种核移植 同种核移植 生殖性克隆 治疗性克隆 胚胎细胞核移植 胚胎干细胞核移植 体细胞核移植

2.1 生殖性克隆

2.2 克 隆 动 物 的 鉴 定 DNA 指 纹 ：指每个个体所特有的基因多态性 鉴定方法：RAPD 微卫星 RFLP DOLLY的鉴定：微卫星

2.3 已 克 隆 的 动 物 绵 羊 1997 小 鼠 1998 牛 1998 山 羊 2000 张 涌 西北农林科技大学 猪 2000 2.3 已 克 隆 的 动 物 绵 羊 1997 小 鼠 1998 牛 1998 山 羊 2000 张 涌 西北农林科技大学 猪 2000 兔 2001 大 鼠 2003 周 琪 中科院动物所 狗 2005

2.4 治 疗 性 克 隆 细胞治疗 组织替代 器官移植

三 核 移 植 技 术 的 应 用 细胞治疗 异种器官移植 生产治疗性蛋白 保护濒危物种 培育各种疾病动物模型

1 细 胞 治 疗 三 核 移 植 技 术 的 应 用 面临的问题 解决方法 1.1 定义 细胞移植可以治疗由于细胞功能缺陷所引起的各种疾 1 细 胞 治 疗 1.1 定义 细胞移植可以治疗由于细胞功能缺陷所引起的各种疾 病，如糖尿病 ; 中枢神经系统疾病（帕金森，阿尔莫茨症）; 肝功能衰 竭 ; 甲状腺疾病。 面临的问题 解决方法 细胞来源 尸源性 异种细胞 免疫排斥 免疫抑制剂 基因敲除 免疫隔离

三 核 移 植 技 术 的 应 用 核移植 消除免疫排斥 胚胎干细胞 提供细胞来源 2005 韩国科学家 黄禹锡应用体细胞核移植，从糖尿病；脊索损伤；先天性低丙球蛋白血症病人的皮肤细胞中克隆出了早期胚胎，并成功提取出新的胚胎干细胞系， 突 破 克隆早期胚胎和提取干细胞的效率从 1/240 提 高到 1/20。 体细胞全部来自于患有各种疾病的病人

遗 传 疾 病 的 治 疗

2 异 种 器 官 移 植 三 核 移 植 技 术 的 应 用 可移植器官短缺 猪的器官大小、结构和功能上与人体器官相近 急性免疫排斥反应 2 异 种 器 官 移 植 可移植器官短缺 猪的器官大小、结构和功能上与人体器官相近 急性免疫排斥反应 基因敲除半乳糖基转移酶 核移植 基因敲除SPF克隆猪 器官移植

3 生 产 药 用 蛋 白 3.1 方 法 三 核 移 植 技 术 的 应 用 目 的 基 因 转基因细胞系 核 移 植 动 物 乳 腺 3 生 产 药 用 蛋 白 3.1 方 法 目 的 基 因 转基因细胞系 核 移 植 动 物 乳 腺 乳 液 提 取 目 的 产 物 基 因 打 靶

3.2 研 究 实 例 三 核 移 植 技 术 的 应 用 1997 年底,英国Roslin 研究所和PPL 公司通过克隆转基因体细胞， 三 核 移 植 技 术 的 应 用 3.2 研 究 实 例 1997 年底,英国Roslin 研究所和PPL 公司通过克隆转基因体细胞， 获得了6只整合neo 或neo 和F2IX 基因绵羊,这标志着核移植介导的转基 因技术成功问世。 2000 年,英国PPL公司将人AAT 基因定点整合到胎儿成纤维细胞的 α1 原胶原( Procollagen) 基因座位,而后用转基因细胞进行核移植,生产 出世界首例基因打靶绵羊,其乳中AAT 蛋白含量达到了650 mg/ L ,远高 显微注射法18 mg/ L 的水平。 2004 年，台湾培育带有治疗血友病的“第八凝血因子”的体细胞克隆 羊。2005 年，这只克隆羊产下一只同样带有第八凝血因子的公羊。

三 核 移 植 技 术 的 应 用 4 保 护 濒 危 物 种 去核卵母细胞 细胞核 核移植重构胚

5 培 育 各 种 疾 病 动 物 模 型 动物种类 疾病模型数 猪 65 猫 123 狗 203 三 核 移 植 技 术 的 应 用 5 培 育 各 种 疾 病 动 物 模 型 应用核移植技术可以培育基因完全一致的 实验动物模型 ，为遗传学，病理学研究 提供良好的实验材料。 动物种类 疾病模型数 猪 65 猫 123 狗 203

已取得了一些进展如体细胞核移植等，但也存在 着一些问题。主要包括 核移植效率低，动物畸 形。这要求研究人员进一步了解核质作用机理， 四 展 望 虽然核移植技术有着广阔的应用前景，并且 已取得了一些进展如体细胞核移植等，但也存在 着一些问题。主要包括 核移植效率低，动物畸 形。这要求研究人员进一步了解核质作用机理， 改进培养方式。

基本参考文献 Bortvin, A., Eggan, K., Skaletsky, H. (2005). Incomplete reactivation of Oct4-related genes in mouse embryos cloned from somatic nuclei. Development 130, 1673-1680. Buehr, M., Nichols, J., Stenhouse, F. (2003). Rapid loss of oct-4 and pluripotency in cultured rodent blastocysts and derivative cell lines. Biol Reprod 68, 222-229. Ferguson-Smith, A. C., and Surani, M. A. (2001). Imprinting and the epigenetic asymmetry between parental genomes. Science 293, 1086-1089. Giles, J., and Knight, J. (2003). Dolly's death leaves researchers woolly on clone ageing issue. Nature 421, 776. Gurdon, J. B. (1999). Genetic reprogramming following nuclear transplantation in Amphibia. Semin Cell Dev Biol 10, p239-243. Jaenisch, R., and Wilmut, I. (2001). Developmental biology. Don't clone humans! Science 291, 2552. Rideout, W. M., Eggan, K., and Jaenisch, R. (2001). Nuclear cloning and epigenetic reprogramming of the genome. Science 293, 1093-1098.

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三 目 前 存 在 的 问 题 及 原 因 1 存 在 的 问 题 供体核 小鼠囊胚率 表型 胚胎干细胞 15 - 30 % 不正常 三 目 前 存 在 的 问 题 及 原 因 1 存 在 的 问 题 1.1 核移植效率低 供体核 小鼠囊胚率 表型 胚胎干细胞 15 - 30 % 不正常 滋养层细胞 1 - 3 % B，T细胞 < 1/3000

1.2 克 隆 动 物 异 常 胎儿或新生儿死亡率极高, 极少数能全程发育的个体也表现为超重、呼吸系统疾病等异常表型, 个别表型正常者也存在有免疫缺陷、关节炎或肾、脑畸形等问题,导致克 隆动物后期死亡