植物脱毒技术 植物快繁技术 植物种质保存技术 　植物组织培养最新技术 植物脱毒技术 植物快繁技术 植物种质保存技术

第一节 植物脱毒技术

一、植物病毒对生产的影响 引起多种植物病害，大多数植物都不同程度地受到病毒的危害。 茄科和十字花科植物上，有50%的病害为病毒病。 在烟草,马铃薯上成为重要的病害。 在花卉上，病毒病使品质和产量降低，甚至影响进出口。

大麦黄矮病毒，在使美国小麦损失6000万美元，加拿大损失1700万美元。 草莓感染62种病毒、类菌质体，每年都必须更新母株。 以特定的无毒植株取代有毒植株后，产量最多可增加300%（平均为30%）

大部分病毒都不通过种子传播 无性繁殖传播率极高

无性繁殖材料和嫁接传播 以球茎、块根、接穗芽为繁殖的作物，如马铃薯、大蒜、郁金香、苹果树等，如母株受侵染则无一幸免。这些无性繁殖材料都可以带毒，故成为重要的检疫对象。 嫁接可以传播任何种类的病毒、植物菌原体和类病毒病害。

二、研究历史 White在1943年首先在感染烟草花叶病毒植株生长点发现病毒浓度很低，甚至没有。 Holmes（1948）通过茎尖扦插由受感染的大丽花中获得了无病毒植株。 Morel,Martin(1952)将100μm长的大丽花茎尖切下，在培养基中进行培养，长成无根苗，后嫁接到健康大丽菊砧木上，获得无病毒植株。

三、目前研究较热的植物 草莓、马铃薯、生姜、大蒜、苹果、葡萄、中药、香蕉

1　脱毒种蒜大量繁殖（东北农大） 大蒜是营养繁殖作物，在长期栽培过程中，病毒感染严重，致使蒜头变小，产量降低。利用植物茎尖组织培养技术，培养脱毒种蒜，可提高大蒜蒜头的直径和产量。 目前，国内外市场对优质大蒜的需求大量增加，每年美国、日本、韩国、东南亚等国家和地区都从我国进口大蒜，但由于我国目前生产大蒜未能全面达到出口标准，造成外贸出口量逐年下降。外汇收入降低。

脱毒种蒜大量繁殖（东北农大） 利用优质种蒜的茎尖外植体、应用组织栽培技术，培养脱毒菌与微麟茎，提高培养效率，缩短培养周期，扩大繁殖系数，同时根据大蒜的生物特性，开辟了脱毒种蒜大量繁殖的新途径，为实现产业化生产奠定了基础。

生产工艺简介 蒜瓣→ 茎尖培养→ 增殖培养 →形成微麟茎 ↓ 生根培养→ 驯化成苗→ 原原种→ 原种→ 良种

主要设备投资 培养架、蒸馏设备、超净平台、温室、灭菌锅、网棚、化验室仪器试剂 设备投资180万元

2　果树脱毒课题组（河南）     本课题组主要从事落叶果树病毒脱除、组织培养、病毒检测、苗木快繁及无病毒栽培技术研究，同时开展果树生理及设施栽培技术研究。先后承担多项国家、农业部、河南省科技攻关课题，其中“苹果无病毒生产体系的建立”获河南省科技进步三等奖。现承担河南省重大科技攻关项目“苹果、葡萄、草莓脱毒快繁及产业化开发应用”，获得了苹果、葡萄、草莓共计60余个品种的无病毒苗，部分优良品种正在向生产推广应用。

经济效益分析 按40万株/年脱毒苗的生产规模 每亩地增收500元

3 脱毒种薯生产新方法研制成功 黑龙江省农科院研制出一种工厂化快速生产马铃薯脱毒原种新方法——无基质定时气雾栽培法，最近通过了专家鉴定。 3　脱毒种薯生产新方法研制成功 黑龙江省农科院研制出一种工厂化快速生产马铃薯脱毒原种新方法——无基质定时气雾栽培法，最近通过了专家鉴定。 　　无基质定时气雾栽培法就是将马铃薯脱毒苗直接固定在空气中，定时、定量向其根部喷施营养液，促使植株生长，达到结薯目的。

马铃薯靠块茎无性繁殖来繁衍后代，在种植过程中极易感染和积累病毒，造成减产。利用生物技术离体培养带有一二个叶原基的茎尖生长点，脱除或减少病毒粒子的含量，培养和快速繁殖脱毒试管苗和脱毒原原种供生产应用，是目前解决马铃薯病毒性退化的唯一途径。传统的原原种生产方法生产周期长、效率低，并由于栽培基质不能年年更换，潜在传毒的可能性，产品质量不能保证。

工厂化生产马铃薯脱毒原原种新技术科技含量高、方式新颖，同原有生产技术相比产量提高30％以上，单个小薯的体积增长5到7倍、2克以上微型薯达到70％，出芽率达到95％。每平方米结薯800粒以上，单株结薯最高可达120粒，每年可生产2至4茬。 据悉，这项技术已获国家发明专利，深受脱毒种薯生产者的欢迎，并已在省内外多家单位转让和推广

4　烟台市农业科学研究院 我院投资100万元组建了烟台市最大的生物组培研究及苗木脱毒中心，开展对草莓、甘薯、马铃薯、葡萄、花卉等作物苗木的脱毒技术研究，年生产能力可达500多万株，生产的苗木在生产上供不应求。与烟台“百年张裕”公司联合进行葡萄脱毒苗的研究、开发，每年为其提供100万株以上的酿酒专用苗。   多年实践证明：脱毒苗木生产健壮，整齐度高，耐寒、抗病性强，果实成熟早，上市早，能明显改善果品品质，产量增长显著，一般在30-50%之间，高者可达80%以上，经济效益十分显著。 

烟台市农业科学研究院 脱毒草莓：丰香、宝交早生、明宝。最有发展前途的是丰香，个大、优质、耐贮运、休眠浅，适宜于促成或半促成栽培。 脱毒葡萄：酿酒品种：赤霞珠、梅鹿特、神索、黑佳美、黑比诺、歌海娜、赛比尔、霞多丽、丽珠。 鲜食品种：红提、黑提、紫珍香、京亚、京秀、氏普罗莎等。 脱毒甘薯：鲁薯6、烟薯16等 脱毒马铃薯：鲁引1号、津引8号、美国1号。

脱毒草莓个大、新鲜、口感好

5　重庆市薯类脱毒快繁中心         2003年2月24日重庆市薯类脱毒快繁中心正式启动，该中心位于重庆市现代农业园区，占地面积25亩，组培大楼总建筑面积2900平方米，目前已在3360平方米的大棚中栽种10苗脱毒马铃薯试管苗，品种8个，长势良好。在中心的5亩展示地中栽种早熟菜用型、炸片、高淀粉加工型等8个品种，本中心可年产200万粒脱毒微型马铃薯，我们正致力于加工型（薯条、薯片）马铃薯品种的选育和生产，促进我市马铃薯产业化的快速发展。其次我中心还进行花卉、药材、经 济作物等组培方面的探索和研究，

三年时间内，共扦插脱毒组培苗80万株，生产原原种薯150万粒。                                                                                                              三年时间内，共扦插脱毒组培苗80万株，生产原原种薯150万粒。　

优选品种－－费乌瑞特

6　中药脱毒种苗试验繁育中心 目前开发成功的品种已达8个，如桔梗、玄参、紫丹参、薄荷、白芍、草莓等。近年可以再开发20个以上品种的无毒苗，以后每年可开发2-3个脱毒品种，每年将可推广2万亩以上的脱毒种苗。 　　 中国农业科学院科技与经济发展咨询中心

四、植物无毒区 植物旺盛生长的分生组织很少含有病毒，如茎尖、根尖，这也是通过分生组织培养获得无毒植株的依据。 为什么分生组织一般不易感染病毒？

病毒通过维管束输导组织系统的转移称作长距离转移，转移速度较快。 病毒在植物叶肉细胞间的移动称作细胞间转移，速度很慢。病毒靠产生运动蛋白去修饰胞间联丝，进而使其孔径扩大几倍甚至几十倍，以便侵染性病毒结构的通过。

茎尖无维管束，病毒不能进行长距离转移，只能通过胞间连丝传递，速度很慢，赶不上细胞分裂速度，故生长点病毒非常少，几乎检测不到。

五、植物脱毒一般步骤 高温处理（低温处理、化学处理） 取材（取茎尖） 消毒 茎尖培养 鉴定 脱毒苗的隔离保存

热处理 热水浸渍法：适于切下的材料，500C，数分钟到数小时，极易致材料受伤 热风处理法：35-400C，几十分钟到数月，如草莓360C6周；变温最好，每日400C处理4小时，16-200C处理20小时，最初几天温度应逐步上升。应保持适当的湿度和光照，且植株应有丰富的碳水化合物贮备（事前对植物进行缩剪）

冷处理 如菊花植株在5度条件下分别4处理或7.5个月，无菊花矮化病毒的无毒苗分别是67%和73%。

化学处理 　许多化学药品(包括嘌呤、嘧啶类似物、氨基酸、抗菌素等)对离体组织和原生质体具有脱毒效果。常用的药品有：8—氮鸟嘌呤、2—硫脲嘧啶、杀稻瘟抗菌素、放线菌素D、庆大霉素等。 　例如，将100μg 2—硫脲嘧啶加入培养基可除去烟草愈伤组织中的PVY(马铃薯病毒)。

但也有人认为 嘌呤和嘧啶类似物、氨基酸、抗生素处理，可在某种程度上抑制植物体内或离体叶片病毒的合成，但仍不能使病毒失活。 三氮唑核苷可有效地使病毒失活。

茎尖培养 由于微小的茎尖组织很难靠肉眼操作，因而需用带有适当光源的简单解剖镜(8—40倍)。 　由于微小的茎尖组织很难靠肉眼操作，因而需用带有适当光源的简单解剖镜(8—40倍)。 　剥离茎尖时，应尽快接种，茎尖暴露的时间应当越短越好，以防茎尖变干。 　在切取外植体之前一般须对茎芽进行表面消毒。叶片包被严紧的芽，如菊花、兰花，只须在75%酒精中浸蘸一下，而叶片包被松散的芽，则要用0.1%次氯酸钠表面消毒10min。

　将接处好的茎尖置于22℃左右的温度下。 　每天以16h 2000—30001x的光照条件下培养。 　由于在低温和短日照下，茎尖有可能进入休眠；所以较高的温度和充足的日照时间必须保证。 　微茎尖需数月培养才能成功。

脱毒苗鉴定 直接观察法 指示植物法 抗血清法 酶联免疫吸附法 电镜检查法 免疫吸附电镜法

1　指示植物(indmatingplant)法 利用病毒在其他植物上产生枯斑，作为鉴别种类的标准，即枯斑和空斑的测定法。 这种专门选用以产生局部病斑的寄主即为指示植物，又称鉴别寄主。 它只能鉴定靠汁液传染的病毒。 常用的指示植物有：千日红、各种烟草、苋色藜、昆诺阿藜

指示植物法最早是美国的病毒学家Holmes 1929年发现的。 由于病毒的寄生范围不同，所以应根据不同的病毒选择适合的指示植物。此外还要求所选择的指示植物不但一年四季都容易栽培，并且在较长的时期内还能保持对病毒的敏感性和容易接种，而且在较广的范围内具有同样的反应。 指示植物一般有两种类型：一种是接种后产生系统性症状，其病毒可扩展到植物非接种部位，通常没有局部病斑；另一种是只产生局部病斑，常由坏死、褪绿或环状病斑构成。

2　抗血清(antisemm)鉴定法 植物病毒为抗原，注射到动物体内产生抗体，存在着这种抗体的血清称为抗血清。 　用已知抗血清可以鉴定未知病毒的种类。高度专一，特异性高，测定速度快，一般几小时甚至几分钟就可以完成。 　抗血清法成为植物病毒鉴定中最有用的方法之一。

3　电子显微镜(elecmc microscope)检查法 　采用电子显微镜既可以直接观察病毒，检查出有无病毒存在，了解病毒颗粒的大小、形状和结构，又可以鉴定病毒的种类。这是一种较为先进的方法，但需一定的设备和技术。 这一方法的优点是灵敏度高和能在植物粗提取液中定量测定病毒。

4酶联免疫鉴定法(Enzyme linked immunity absorption assay ELISA) 　采用酶标记抗原或抗体的定量测定法。将抗原固定在支持物上，加入待检血清，然后加入酶(过氧化物酶或碱性磷酸酶)标记的抗体，使待检血清中与对应抗原的特异性抗体结合，最后用特殊分光光度计测定。 　现在灵敏度较高和常使用的方法。

六　其它植物脱毒方法 愈伤组织脱毒 茎尖微体嫁接脱毒

愈伤组织培养脱毒 通过植物的器官和组织的培养去分分诱导产生愈伤组织，然后从愈伤组织再分化产生芽，长成小植株，可以得到无病毒苗。

茎尖微体嫁接 木本植物茎尖培养难以生根成植株，将实生苗砧木在人工培养基上种植培育，再从成年无病树枝上切取0.4—1.0mm茎尖，在砧木上进行试管微体嫁接，以获得无病毒幼苗。

七　马铃薯脱毒

马铃薯病毒病 马铃薯卷叶病毒、马铃薯A病毒、马铃薯Y病毒、奥古巴花叶病毒、马铃薯M病毒、马铃薯X病毒、马铃薯S病毒、纺锤块茎病毒 其中前三种不进行高温处理，只进行茎尖培养也可获得较多的无病毒植株（80%）。其它病毒在进行高温处理后可大大提高其脱毒效果。

马铃薯病毒病症状（P99）

离体茎尖的大小对病毒去除的影响 茎尖长度 叶原基数 发育的小植株数 去除病毒的植株数 0.12 1 50 24 0.27 2 42 18 0.6 4 64

马铃薯脱毒程序 1　在正常的湿度和光照条件下，在土中种一块单芽眼块茎，当第一个芽长到约15cm高时，将顶端切下6-8cm长，去掉下面的2个叶片，在切口处涂上生根激素后，把切条植入一个口径为10cm内装消毒土壤的花盆中，然后用玻璃烧杯罩上，保持10天。

2　植入花盆3-4周后，将其移入生长箱中，其中光照强度为3000-4000lux，光照时间每天16小时，气温白天约为36度，夜间为33度 3　2周后打掉幼株的茎尖，以促使腋芽的生长

4　经过6周的热处理后，折下1个腋生枝以从其上取芽，在植株上至少留下2个叶片以促其进一步生长。由折下的腋生枝上剪去叶片，但要把小段基部叶柄留在枝上。把这个腋生枝包在湿纸内以防枯萎。

5　在双筒解剖镜下将茎尖解剖出来（枝条不必消毒） 6　当只剩下2个最幼小的叶原基时，用装在一根合适刀把上的一小片碎刀片切下茎尖（300-600μ），放在培养基上。 7　在23度，每天16小时光照条件下培养。

8　当茎长到3cm并已生根时，即可移入土壤，起初要把植株保持在高湿度环境中，若有些品种茎不生根，可把它们嫁接到无病砧木上。 9　移入土壤后，立即对植株进行第一次带病情况的检查，数周后再进行一次。　　　　　　

2857 NH4NO3 1650 Na2MoO4.2H2O 0.25 KNO3 1900 KI 0.83 CaCl2.2H2O 440 成分 数量（mg/L) NH4NO3 1650 Na2MoO4.2H2O 0.25 KNO3 1900 KI 0.83 CaCl2.2H2O 440 H3BO3 6.2 MgSO4.7H2O 370 肌醇 100 KH2PO4 170 烟酸 0.5 FeSO4.7H2O 27.85 盐酸吡哆醇 Na2.EDTA 37.25 盐酸硫胺素 0.1 MnSO4.4H2O 22.3 甘氨酸 2 ZnSO4.7H2O 8.6 激动素 0.04 CoCl2.6H2O 0.025 IAA CuSO4.5H2O GA3 活性炭（可有可无） 2857