植物生物技术 河南农业大学生命科学 学院植物科学系

绪论 第一部分 植物组织培养 第二部分 植物基因工程 第三部分 植物分子标记 第一章 植物离体遗传操作技术 第二章 胚器官培养 第一部分 植物组织培养 第一章 植物离体遗传操作技术 第二章 胚器官培养 第三章 植物愈伤组织的诱导、继代及分化 第四章 植物体细胞无性系变异与植物改良 第五章 原生质体培养和体细胞杂交 第六章 单倍体细胞培养 第二部分 植物基因工程 第七章 植物基因克隆的原理与技术 第八章 植物遗传转化 第三部分 植物分子标记 第九章 分子遗传标记

第六章 单倍体细胞培养

主 要 内 容 第一节 单倍体的起源和遗传行为 第二节 单倍体的应用价值 第三节 培养条件下的小孢子发育 第四节 花药培养 第一节 单倍体的起源和遗传行为 第二节 单倍体的应用价值 第三节 培养条件下的小孢子发育 第四节 花药培养 第五节 花粉（小孢子）培养 第六节 单倍体细胞培养与植物育种

第一节 单倍体的起源和遗传行为

一、单倍体的概念 单倍体概念：是指具有配子染色体数的个体或组织，即体 细胞染色体数为n。由于物种的倍性不同， 可以把单倍体分成两类: 一倍单倍体（monohaploids）:起源于二倍体物种； 多倍单倍体（polyhaploids）: 起源于多倍体（如4X， 6X等）。典型的单倍体只能从多倍体植 物，如小麦、烟草、三叶草等植物中产生， 二倍体植物产生的单倍体只有在加倍后形成 双单倍体才能存活下来。

二、单倍体的产生方法 主要有4种方法可以诱发植物产生单倍体： 1、 种间和属间杂交。 远缘杂交中，异种植物虽然不能与母本授粉、受精，由于远缘花粉的诱导作用，卵细胞在没有受精的情况下受刺激而发育成胚。这一技术在土豆育种中得到应用。远缘杂交诱发单倍体的现象在土豆、大麦、小麦、玉米中都有发生。 2、 物理照射和化学诱变。 花粉用射线照射后失去了受精能力，然后与母株授粉，卵细胞在花粉的刺激作用下进行孤雌发育，从而产生单倍体。这方面的例子可在烟草、小麦、金鱼草中发现。

3、 双生苗的筛选（selection of twins）。 有些植物可产生多胚种子，即两个或多个胚被共同的种皮包裹着，这些种子可产生单倍体-单倍体、二倍体-二倍体和单倍体-二倍体植株。在辣椒(Capiscum)中，双生苗的频率受母本基因型控制。通过筛选可以提高双生苗的频率。其种子可以产生单倍体. 4、花药和花粉培养。

二、单倍体细胞培养 单倍体细胞培养主要包括三个方面： 花药培养 小孢子培养 未受精子房及卵细胞培养 体外诱导单倍体的主要途径

雄核进入卵细胞，但不与卵核相融合，雌核和雄核彼此独立分裂，产生具有来源于母本或父本组织的嵌合体胚，发育成嵌合体，

一倍的单倍体只有一个染色体基数（X），减数分裂时染色体不能配对，分离极不正常，但具有一定同源关系的染色体可以部分配对，从而可以对染色体的演化过程进行研究。

第二节 单倍体的应用价值 1、在植物育种中使后代迅速纯合 杂交育种与单倍体育种的周期比较 母本 × 父本 F1 F2 花药培养 花粉植株 第二节 单倍体的应用价值 1、在植物育种中使后代迅速纯合 母本 × 父本 F1 F2 花药培养 花粉植株 加倍 选择鉴定 品系比较试验 区域试验 品种 5—8代 杂交育种与单倍体育种的周期比较

2、 提高选择效率 如控制一对性状的基因AA×aa F1 F2纯合AA个体占1/4，如F1采用花药或花粉培养纯合AA个体占1/2。 3、排除杂种优势对后代选择的干扰 4、遗传研究的良好实验材料体系 5、突变体的筛选：隐性基因都表现出来，用离子束照射后筛选Mu 6、消除致死基因：杂合体存在使致死基因不易消除。 7、选育新型自交系：由杂种一代的花药或花粉培养得到的双倍体 是纯合自交系，育种中用途很大。 8、遗传转化的受体材料：用体细胞为受体，后代须几代选择才能稳定 下来，但用单倍体细胞为受体，会很快达到纯合。

第三节 培养条件下的小孢子发育 1、小孢子的正常发育 小孢子发生 胼脂壁 小孢子四分体 有丝分裂 小配子发生

2、 培养条件下的小孢子发育 培养条件下花粉的分裂增殖方式有四种类型： 1）营养细胞发育途径； 2）生殖细胞发育途径； 3）营养细胞和生殖细胞并进发育途径； 4）花粉均等分裂途径:花粉先均等分裂形成两个子核，然后两核间产生壁形 成两个子细胞 多细胞团 破壁后形成胚状体或愈伤组织。

C.生殖核重复分裂而营养核败育 图6-2小孢子正常发育途径和培养条件下胚胎发育途径比较 A.自然条件下小孢子的第二次分裂 及萌发形成的花粉管； B.营养核重复分裂而生殖核败育； C.生殖核重复分裂而营养核败育 D.两个核共同分裂形成单倍体胚； E.两个核融合后形成纯合的二倍体

第四节 花药培养 花药培养是将花粉发育至一定阶段的花药接种到人工培养基上进行培养，以形成花粉胚或愈伤组织进而分化成植株的技术。

图6-3 花药培养与单倍体植株的形成

一、影响花药培养的因素 （一）供体植株的生长条件 （二）供体植株的年龄 在烟草中，短光周期（8h）和高光强（16000lux）较有利。而大麦，低温（12 ℃ ）和高光强（20000lux）较好。芸苔属的一些种 （油菜），高光强和一定的温度变化较有利，对于甘蓝型冬油菜来讲，植株在15℃下生长比20 ℃下好。对烟草植株进行氮饥饿处理可以提高花药培养效果。 （二）供体植株的年龄 多数情况下幼年植株优于老年植株，可甘蓝型油菜却相反。

（三）花粉发育时期 1、适宜时期：单核期,尤其是单核中、晚期(单核靠边期) 雄配子体的发育 营养细胞 生殖细胞 精子

Stage of development Dicots – first pollen mitosis Monocots – early uninucleate stage

花粉粒形态： 花粉粒即雄配子体。为2细胞花粉或3细胞花粉 2--细胞花粉 3--细胞花粉

2、花粉发育时期的检测 外部形态观察：在水稻中，一般叶枕距为5-15cm，颖片淡黄绿色、雄蕊长度接近颖片长度的1/2时，可能为单核靠边期的花粉。 压片染色法：是检测花粉发育时期的简便有效方法，常用染色剂为醋酸洋红。镜检以确定花粉的发育时期，找出花粉发育时期与花蕾或幼穗大小、颜色等特征之间的相应关系，从而为取材提供参考。

油菜花蕾、花药长度与小孢子发育时期和培养效果的关系 花蕾大小(mm) 花药长度(mm) 胚数/皿 细胞学时期 2.1 1.4 0 四分体 2.4 1.6 0 单核早期 2.5 2.1 0 单核中期 3.1 2.3 396 单核晚期 3.6 2.4 6495 单核晚期 4.0 2.6 2898 单核晚期和营养-生殖核期 4.7 2.9 0 营养-生殖核期 5.0 3.0 0 营养-生殖核期 ＜4.5mm

水稻花粉二型性 胚性小孢子 在花药/花粉培养时，由于对培养条件的反应不同，花粉在形态上形成两种类型，一类是具胚性的，在烟草和大麦中，花粉小，染色浅；另一类为花粉大，染色深，朝成熟花粉方向发展。这种现象即花粉的二型性。

二形性 配子体

（四） 花蕾和花药的预处理 对于有些物种，培养前对花药和花蕾进行预处理，能显著提高培养效果。如大麦花药，在40℃处理28天，或70℃处理14天，能收到最好效果。 除温度处理以外，其它一些因素的预处理有时也能收效，如用激素处理供体植株可以提高土豆花药单倍体的形成能力。用EMS、酒精、射线、降低气压、高低渗处理进行预处理的也有报道。 （五） 供体植株的基因型 研究表明，小孢子能否进行胚胎发生受基因控制，所以，供体植株的基因型对花药培养效果有重要影响。 烷化剂甲基磺酸乙醇( EMS)

（六）培养基 1、糖：花药培养时往往需要一定的渗透压，成熟花粉是二细胞结 构的，往往需低浓度糖，而成熟花粉为三细胞结构的植物往往 需高渗条件，如油菜小孢子培养时，糖的浓度可用到13-17%。 2、激素：培养基中激素的种类、使用量和配比，对诱发小孢子启 动分裂、生长和分化常常起决定作用，而其它成分一般只起次 要的辅助作用。因此，在进行花药培养时，进行细致的激素方面 的实验是必要的。 3、N：氮素的量和各种氮素的比例对培养效果有明显影响。 4、有机物质：在花药培养中可能起重要作用。在大麦和小麦的花 药培养中，谷氨酰胺对小孢子胚形成具有明显的促进作用。 5、pH：有些作物的花药对培养基的pH值有一定要求。

（七） 培养条件 多数植物在25℃下培养能诱导愈伤组织，可某些植物，尤其是芸苔属，在高温35 ℃下处理几天，然后进入25 ℃培养能收到最好培养效果。 （八） 活性碳的作用 提高雄核发育的机制并不清楚。

9、 培养密度

醋酸洋红染色的小孢子，示培养条件下高频率的分裂 油菜的花药培养 一个花蕾来源的6个花药产生的胚，总产量约1000个

二、 逆境处理对小孢子胚胎发生的诱导作用 关于逆境处理对小孢子胚胎发生的诱导主要集中在油菜和大麦的研究。 饥饿处理 高温处理 低温处理 γ射线 秋水仙素 重金属胁迫 上述多因子的结合 其机理是改变细胞分裂周期，改变细胞发育途径等

低温（3℃ ）处理对四季橘花药愈伤组织和胚状体形成的影响 天数 接种 花药（枚） 发生愈伤组织的 花药 发生胚状体的花数 枚 % 对照 5 10 15 20 25 848 723 902 846 470 434 8 9 18 3 0.59 1.11 1.00 2.13 1.06 0.69 12 2 0.94 1.66 0.43

芸苔 甘蓝

低温处理的作用机理 A、低温可改变花粉粒第一次有丝分裂纺锤体的轴向， 形成两个均等细胞，使得花粉朝着胚胎方向发育； B、低温使花粉保持较长时间的活力，使营养细胞得以 完成细胞质的改组而转向胚胎发生。

三、花药培养操作技术 花药培养诱导单倍体的技术相对于其它细胞工程技术是一种较简单的技术，在合适的植株上选定花蕾后，用一种适当的灭菌剂进行表面消毒，用无菌水冲洗3-4次，然后在无菌条件下，将花药连同花丝一起取出，置于一个无菌的培养皿中，取其中一个花药在醋酸洋红中镜检，确定花粉的发育时期，若发现符合要求，把其余雄蕊上的花药轻轻地从花丝上摘下，水平地放在培养基上进行培养。花药培养2-3周后，花药中的小孢子经大量分裂形成胚或愈伤组织，并逐渐使花药壁破裂，表面上看似从花药表面形成的突出物。二周后，这类花粉粒进行细胞分裂，成为二细胞的“原胚”，并继续分裂形成多细胞的球形胚。随培养时间的延长，球形胚逐渐发育成心形胚、鱼雷形胚等。三周后，转到光下培养，胚状体见光有淡黄色转绿，并逐渐发育成小苗。

水稻花药培养过程 剥去旗叶鞘，取出稻穗 旗叶鞘用70％酒精擦洗一遍 左手持穗，右手用镊子取花药，放无菌培养皿中 无菌水洗3次 10％漂白粉10 min 培养5天，花药变褐，20天后花药裂开，长出淡黄色的花粉愈伤组织，先长芽，后长根，形成幼苗。 用接种环接种到培养基上

评价花药培养体系的好坏需要一些技术指标体系，通常使用的有： 压片或切片观察，计算启动分裂的小孢子/总小孢子或计算愈伤组织块数（胚数、植株数）/花药（花蕾）； 或一定时间内计算尚有活力的小孢子数/总小孢子数。

四、单倍体植株的加倍处理 单倍体植株通常情况下表现为植株矮小，生长瘦弱，由于染色体在减数分裂时不能正常配对，所以表现为高度不育。对单倍体进行加倍处理，使其成为双单倍体，是稳定其遗传行为和为育种服务的必要措施。 自然加倍：花粉细胞核有丝分裂或核融合，染色体可自然加倍，获得纯合二倍体。 氟乐灵，是一种植物特异性微管形成抑制剂，也可使染色体加倍

具体方法是：把幼小的花粉植株浸入过滤灭菌的秋水仙素溶液中96小时，然后转移到培养基上使其进一步生长。 秋水仙素诱导 具体方法是：把幼小的花粉植株浸入过滤灭菌的秋水仙素溶液中96小时，然后转移到培养基上使其进一步生长。 秋水仙素(抑制微管聚合)处理也可通过羊毛脂进行，即把含有秋水仙素的羊毛脂涂于上部叶片的腋芽上，然后将主茎的顶芽去掉，以刺激側芽长成二倍体的可育枝条。 将单倍体植株诱导的愈伤组织反复继代培养，再分化可得到二倍体植株。

第五节 花粉（小孢子）培养 花粉囊 花粉囊壁 花药裂口 成熟花粉粒 油菜成熟花药的结构 第五节 花粉（小孢子）培养 花粉培养：是将花粉从花药中分离出来,接种到人工培养基上进行培养，以形成花粉胚或愈伤组织进而分化成植株的过程。 花粉囊 花粉囊壁 花药裂口 成熟花粉粒 油菜成熟花药的结构

一、花粉培养过程 预培养数天 分离花粉 取花蕾（镜检） 取花药 消毒 培养 愈伤组织发生 接种 药壁向花粉提供营养物质； 通过药壁吸收、贮存和转化培养基中的外源物质

二、花粉培养与花药培养的比较 1d-1g为器官发生途径产生单倍体； 2d-2e为胚胎发生产生单倍体； 3b-3f为花药培养产生单倍体过程

小孢子（花粉）培养在某些方面比花药培养有一定优势： 花药培养有时会由于花药中的有害物质而不能诱导小孢子启动第一次分 裂，小孢子培养则不存在这一问题； 花粉已是单倍体细胞，诱发后经愈伤组织或胚状体发育成的小植株都是 单倍体植株或双单倍体，不含有因药壁、花丝、药隔等体细胞组织的 干扰而形成的体细胞植株； 由于起始材料是小孢子，获得的材料总是纯合的，不管它是二倍体还是 三倍体； 小孢子培养可观察到由单个细胞开始雄核发育的全过程，是一个很好的 遗传与发育研究的材料体系； 由于花粉能均匀地接触化学的和物理的诱变因素，花粉是研究吸收、转 化和诱变的理想材料。

三、分离花粉的方法 自然释放法 研磨过滤收集法 剖裂释放法 玉米和烟草的小孢子培养

花粉的看护培养 四、花粉/小孢子培养方法 液体浅层培养 平板培养法 看护培养法 微室悬滴培养法 5 条件培养法 ：花药沸水中杀死细胞，研磨离心取上清夜，加入到培养基中。 50-80粒/滴 的花粉悬浮培养基 花粉的看护培养 最常用的培养基是MS培养基。

第六节 单倍体细胞培养与植物育种 我国花培育种技术走在世界前列，育成各种农作物新品种几十个，有的已推广很大面积，在生产上发挥着重要作用。 第六节 单倍体细胞培养与植物育种 我国花培育种技术走在世界前列，育成各种农作物新品种几十个，有的已推广很大面积，在生产上发挥着重要作用。 水稻花培育种最突出的成就是李梅芳等育成的“中花8号”、“中花9号”、“中花10号”、“中花11号”粳稻花培新品种，丰产、品质好。 其它花培水稻品种还有“朝花矮”、“宁糯1号”、“宁糯6号”、“单209”、“浙粳66”、“京花101”、“京花103”、“中花12”、“花汕优63”、“花8504”等品种，累计推广面积1360多万亩，社会和经济效益显著。

图6-10 单倍体细胞培养及育种技术路线 杂交和分离测试 A品种 B品种 × F1杂种 小孢子培养或花药培养 单倍体培养 染色体加倍 组合重组系 选择 重组了A和B品种优点的纯系 田间测试 遗传稳定性测试 育种新品系 田间表现调查 杂种优势表现 杂交 自交 自交，田间测试 确定遗传基础 图6-10 单倍体细胞培养及育种技术路线

禾本科植物花药培养中的白化苗现象 禾谷类植物花粉单倍体生产中存在的一个严重问题是出现大量白化苗。白化苗的产生与很多因素有关，包括内部因素和外部因素。 内部因素：基因型和花粉发育时期的影响最为明显； 外界因素：如高温、高浓度2，4-D、延迟转分化培养时间等均可促进白化苗产生。 关于白化苗产生的机制问题一直不甚清楚，可能是由于质体基因组的变异造成，或来自染色体畸变的花粉，也可能是花粉有丝分裂过程中，质体不能分化并降解。

单倍体诱导中存在的问题 对于多数植物来讲，能形成有活力的胚的花药百分率很低，除此之外，还有很多问题存在： 通常花药或花粉离体培养时没有生长和发育的现象，或刚开始生长 便导致胚败育 在产生单倍体的同时也产生二倍体和四倍体 培养时我们需要小孢子分裂，而二倍体组织不分裂，但这种情况往 往难以办到 白化苗难以避免，尤其是禾本科作物 在混倍性的材料中很难分离出单倍体出来，因为单倍体细胞的生长 很易被更强生长力的多倍体细胞掩盖掉 单倍体加倍并不总是能产生纯倍体，纯倍体的双单倍体有时表现出 后代分离

思考题 1、花药培养的意义。 2、花药培养方法。

谢谢！