实验四 α-淀粉酶活力测定 及影响酶作用的因素

【实验预习】 什么是淀粉酶？能催化什么反应？ 淀粉与碘有什么反应？原理是什么？ 淀粉-碘复合物在____有最大吸收？ 什么是酶的活力？影响酶活力的因素有哪些？ 什么是酶的最适反应温度？ 什么是酶的抑制剂和激活剂？

【实验目的】 掌握α-淀粉酶活力测定的基本原理、方法和操作技能。 了解激活剂和抑制剂对酶活力的影响； 了解温度对酶活性的影响。什么叫最适温度? 学会测定酶最适温度的方法；

【实验原理】 1. 淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和异淀粉酶。α-淀粉酶是一种液化酶，广泛分布于微生物中，且几乎都是分泌型的。此酶以Ca2+为必需的稳定因子，既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，随机作用于淀粉分子的非还原端的 α-1,4- 糖苷键，迅速地将直链淀粉分子切割为大量长短不一的短链糊精或寡糖，使淀粉溶液的黏度急剧下降。

【实验原理】 2. 由于碘液与不同分子量的糊精反应后呈现不同的颜色，根据与碘呈现不同的颜色可分为蓝色淀粉、紫糊精、红糊精以及无色糊精，最后失去对碘的呈色反应，水解的最终产物是麦芽糖和少量的葡萄糖。因此可以根据蓝色消失速度来衡量淀粉酶液化能力的大小。淀粉-碘复合物在660 nm处有较大的吸收峰，可用分光光度计来测定。

多糖链的螺旋构象是碘显色反应的必要条件。当碘分子落入螺旋圈内时。糖的游离羟基成为电子供体，碘分子成为电子受体，形成淀粉-碘络合物，呈现颜色。如果将显色的溶液加热至70℃以上，因为糖链螺旋构象破坏，伸展成直链，颜色随之消失，冷却后，颜色重现。

3. 酶活力（Enzyme Activity）也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力的大小可用在一定条件下酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。 酶活力单位（U，active unit） 1961年国际酶学会议规定：1个酶活力单位是指在特定条件（25℃，其它为最适条件）下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量,称为一个国际单位（IU，又称U）。 在本实验条件下，每小时所分解的淀粉毫克数来衡量。

4. 酶催化反应的活力受到温度、酸碱度和离子强度等因素的影响。一般，温度每增高10℃，反应温度增加一倍，但同时，酶作为蛋白质，温度过高会发生变性逐渐失活，反应速度达到最大值时的温度称为某种酶的最适温度； 5. 酶活力与环境酸碱度密切相关，某种酶只在一定pH范围才具有活力，酶活最高时的pH称为该酶的最适pH（本实验不进行考察）； 6. 酶的活性受某些物质影响，有些物质能增加酶的活性，称为酶的激活剂；另一些物质则降低酶的活性，称为抑制剂。如，C1-为唾液淀粉酶的激活剂，Cu2+为抑制剂。

【实验仪器与试剂】 器材： 1. 唾液(吃食前的)。 2. 试管1.5cm×15cm (×3)。 3. 吸管1.0m1(×4)、2.0ml(×1)。 4. 白瓷板6孔。 6. 盐冰冰浴。 7. 恒温水浴锅 8. 电炉。 9. 铁三角架及石棉网。 10．试管架及试管9支，吸量管(2 ml x 2)，吸量管架，恒温水浴(37℃)，秒表一块(两人共用),滴板一块，滴管1支。 11. 漏斗 12. 烧杯 13．温度计 14. 恒温水浴锅 15. 脱脂棉

试剂： 1．0.1％淀粉液：称取可溶性淀粉0.1g，先用少量水加热调成糊状，再加热水稀释至100ml。 4．1％氯化钠溶液：1g NaCl溶于100m1蒸馏水。 5．1％硫酸铜溶液：1g CuS04溶于100ml蒸馏水。 6．稀碘液：于2％碘化钾溶液中加入碘至淡黄色。 7. 碘-碘化钾溶液：取碘4g，碘化钾6g，同溶于100ml蒸馏水中，贮于棕色瓶内。 8. 3%氯化钠的O.5％淀粉溶液(新鲜配制)。 9. 嗽口后收集唾液，用小漏斗加脱脂棉过滤，用蒸馏水稀释5-20或100—200倍倍（根据各人的酶活性而定），混匀后备用。 10. 用0.2mol／L磷酸氢二钠溶液和0．1 mol／L柠檬酸溶液配制pH5.O，5.5，6.0，6.4，6.8，7.4，8.0，8.5的缓冲液。

为什么在碘指示剂中加入碘化钾？ 碘化钾作为助溶剂 在三种可溶于水中的卤素单质中碘的溶解度是最小的 每个碘的阴离子可以接受两个碘原子的两个电子，形成了一种I3-的原子团 而这种原子团和很多阴离子或酸根一样是可溶于水的，所以间接增加了碘单质在水中的溶解度

【实验方法】 1、酶液的收集制备： 漱口后，收集唾液 > 0.5mL,加入30倍去离子水稀释，混合。 2、碘液复合物消色法测定α-淀粉酶活力 1.1 标准曲线的制作（已给出） 1）将2%可溶性淀粉稀释成0.2~2%梯度。 2）吸取淀粉稀释液1 mL到试管中，加入磷酸氢二钠-柠檬 酸缓冲液0.5 mL, 40℃水浴保温5min。 3）加入蒸馏水0.5 mL, 40℃反应30 min后加入0.5 mol/L 乙酸 5 mL。 4）吸取反应液300 μL，加入稀碘液 3mL,混匀，在660 nm下测的吸光度A。

Abs Abs Abs C淀粉/ %

1.2 淀粉酶活力的测定 1）吸取淀粉稀释液1 mL到试管中，加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液0.5 mL, 40℃水浴保温5min。 2）加入稀释浓度的粗酶液0.5 mL, 40℃反应30 min后加入0.5 mol/L 乙酸 5 mL。 3）吸取反应液300 μL，加入稀碘液 3mL,混匀，在660 nm下测的吸光度A。 （注意：用 1 mL 蒸馏水代替步骤1中的淀粉稀释液，同上操作，作为空白对照） 4）从标准曲线中查出相应的淀粉浓度，求出被消耗的淀粉量。 5）酶活力计算：酶活力以每毫升粗酶液在40℃, pH 6.0的条件下每小时所分解的淀粉毫克数来衡量.

3、激活剂和抑制剂对酶活力的影响 取试管3支，按下表编号并加入试剂 加毕，摇匀，同时置40℃水浴保温，每隔2min取液体1滴置白磁板上用碘液试之，哪支试管内液体最先不呈蓝色反应，哪一管次之，说明原因。

4、温度对酶活性的影响 先取试管2支，各加稀释唾液2ml，一管直接加热煮沸，另一管冰浴中预冷5min。 取试管4支,按下表操作

【思考题】 1. 碘液复合物消色法测定α-淀粉酶活力的原理是什么？ 2. 还有哪些测定α-淀粉酶活力的方法？ 3. 酶活性在代谢途径中的快速调节方式有哪几种重要的方式？ 4.本次实验中影响实验成败的关键环节有哪些？ 5.你认为本项实验设计还可以有哪些改进？为什么？