酶谱法检测血清中基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9活性 综合性设计性实验-2 蛋白质高级结构的预测 酶谱法检测血清中基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9活性 食管癌患者血液中MMP-2和MMP-9的活性变化及其临床意义

此实验共包括如下三个部分 第一部分，蛋白质高级结构的预测 第二部分，酶谱法检测血清中基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的活性

第一部分，蛋白质高级结构的预测 蛋白质的三维构象，也称空间结构或高级结构，是指蛋白质分子中原子和基团在三维空间上的排列、分布及肽链的走向。高级结构是蛋白质表现其生物功能或活性所必须的。 X射线晶体学方法是至今为止研究蛋白质结构最有效的方法，所能达到的精度是任何其他方法所不能比拟的，它的缺点是蛋白质的晶体难以培养，晶体结构测定的周期较长。 近年发展起来的多维核磁共振方法可以直接测定蛋白质在溶液中的构象，但是由于对样品的需要量大、纯度要求高，被测定的蛋白质的分子量一般不超过20000 Da等原因，也受到很大限制。

截至2008年6月，与迅速增长的庞大基因组核酸数据相反，已知三级结构的蛋白数量还不到6万个。（来自蛋白结构数据PDB的统计）

利用蛋白质的一级结构所提供的氨基酸序列信息来进行高级结构预测的方法就是应这种需要而发展起来的。 蛋白质的一级结构决定高级结构这一论点，仍然是进行蛋白质三级结构预测的理论基础。 目前蛋白质三级结构预测的方法有： （1）在已知结构（如晶体结构）的基础上利用分子动力学方法研究蛋白质分子、 核酸分子或复合物的动态性质。 （2）利用能量优化或分子动力学方法对结构模型进行优化；或者是在整体结构已知的情况下建立点突变体的结构。 （3）借助于类似物的结构参数建立未知蛋白质的结构。 （4）结合2D-NMR数据或X-RAY粗结构数据或其他的实验数据建立蛋白质的整体模型结构模型。

（5）在上述条件均不符合的情况下，根据一级结构进行二级结构预测，准确度＜65％。（6）在已知二级结构的基础上进行片段堆积，根据从已知结构得出的一些规则进行筛选，挑选可能的结构，往往得到多种可能性，尚不能得到唯一的正确堆积方式。 （7）在单体结构已知的情况下，建立复合物或多聚体的结构，参考复合物或聚合物本 身的性质，利用几何匹配和最大接触面积规则进行。

同源建模法预测蛋白质三级结构一般由四步完成： 从待测蛋白质序列出发，搜索蛋白质结构数据库（如PDB,SWISS-PROT等），得到许多相似序列（同源序列），选定其中一个（或几个）作为待测蛋白质序列的模板； 待测蛋白质序列与选定的模板进行再次比对，插入各种可能的空位使两者的保守位置尽量对齐； 建模：调整待测蛋白序列中主链各个原子的位置，产生与模板相同或相似的空间结构，待测蛋白质空间结构模型； 利用能量最小化原理，使待测蛋白质侧链基团处于能量最小的位置。

SWISS-MODEL 蛋白质结构预测 SWISS-MODEL利用同源建模的方法实现对一段未知序列的三级结构的预测。该服务创建于1993年，开创了自动建模的先河，并且它是讫今为止应用最广泛的免费服务之一。http://swissmodel.expasy.org//SWISS-MODEL.html

First Approach mode(简捷模式） 这种模式提供一个简捷的用户介面：用户只需要输入一条氨基酸序列，服务器就会自动选择合适的模板。如果一条模板与提交的目标序列相似度大于25%，建模程序就会自动开始运行，结果以Email形式返回。

常用观看蛋白三级结构的软件 RasMol Cn3D WPDB

第二部分，酶谱法检测血清中基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的活性

常见电泳技术 按支持介质的不同可分为： 纸电泳（Paper electrophorisis） 醋酸纤维薄膜电泳（Cellulose Acetate electrophoresis） 琼脂凝胶电泳（Agar Gel electrophoresis） 聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel-electrophoresis） SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法） 按支持介质形状不同可它为： 薄层电泳 板电泳 柱电泳

电泳设备 垂直电泳系统

水平电泳系统

聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N′-甲叉双丙烯酰胺(N,N ′ -methylene-bisacylamide,简称Bis)在加速剂 N,N,N,N-四甲基乙二胺(N,N,N,N-tetram-ethyl ethylenedia mine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate (NH4)2S2O3，简称AP) 的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。 催化剂 丙烯酰胺 N,N′-甲叉（亚甲基）双丙烯酰胺 聚丙烯酰胺

聚丙烯酰胺凝胶有下列特性： 在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好； 化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶； 对pH和温度变化较稳定； 几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好； 样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g； 凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径； 分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。

SDS－PAGE的原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应，蛋白质在电泳中保持完整的状态，蛋白在其中依三种因素分开：蛋白大小，形状和电荷。 而SDS-PAGE仅根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白。这个技术首先是1967年由shapiro建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，电荷因素可以忽视。 SDS（Sodium Dodecyl Sulfate）是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使绊胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的蛋白量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。 因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质分子大小。

不同分子量的蛋白质在凝胶中运动示意图

不同聚丙烯酰胺凝胶浓度对不同分子量的 蛋白质混合物分离能力的关系 5％ 10％ 15％ 29 45 66 97 200

肿瘤细胞的侵袭移动 C B A D 肿瘤细胞侵袭是指肿瘤细胞粘附并穿越细胞外基质，包括三个重要的步骤：粘附于基膜，裂解基膜蛋白形成缺口，细胞经缺口移动。 肿瘤细胞对周围组织和血管的侵袭是肿瘤细胞转移的关键步骤。 转移的肿瘤细胞在原灶外存活和增殖，这是癌症对人类生命的最大威胁。

细胞间基质结构示意图 细胞外基质(extracellular matrix，ECM)主要成份由胶原、糖蛋白、蛋白多糖和氨基葡聚糖组成。 ECM在上皮或内皮细胞的基底部，即以基底膜(basement membranes，BM)的形式存在，在细胞间结构以间质结缔组织(interstitial connective tissue)形式存在。 胶原是ECM的主要成分，目前已发现，至少有12种不同胶原类型，其中以I、Ⅱ、Ⅲ型胶原是间质结缔组织中的主要成分。Ⅳ型胶原则主要存在于基底膜内。

肿瘤细胞的侵袭是需要与细胞增殖、分化、移动的相关基因及其表达调控模式的改变和促进细胞移动的外界因素两者的共同作用。 虽然肿瘤细胞侵袭的分子机制还不是十分清楚，但已发现许多调控细胞侵袭转移的关键分子及其信号通路。 肿瘤细胞通过其表面受体与ECM中的各种成分粘附后激活或分泌蛋白降解酶类来降解基质，从而形成局部溶解区，构成了肿瘤细胞转移运行通道。一般恶性程度高的肿瘤细胞具有较强的蛋白水解作用，可侵蚀破坏包膜，促进转移。目前较为关注的酶主要是丝氨酸蛋白酶类，如纤溶酶原激活物(plasminogen activator, PA)和金属蛋白酶(metalproteinase, MMP)类，如胶原酶IV、基质降解酶、透明质酸酶。

基质金属蛋白酶蛋白家族 MMPs家族成员根据其在细胞中表达部位的不同，分为胞质型和膜型两大类。前者分布在胞质中，后者表达在膜上。胞质型MMPs根据其作用底物的特异性、敏感性及氨基酸序列的同源性分为三大类： （1）间质胶原酶，包括MMP-1、MMP-5、MMP-8、MMP-13，其作用底物主要为间质胶原, 即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅶ、Ⅹ型胶原, 但不能降解明胶和Ⅳ型胶原； （2）明胶酶，包括MMP-2和MMP-9,其作用底物主要是Ⅳ型胶原和明胶，还可降解Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ型胶原,但不能降解间质胶原； （3）间充质溶解素，包括MMP-3、MMP-7、MMP-10和MMP-11，其作用底物主要是基质中的蛋白多糖和糖蛋白，如纤维粘连蛋白(FN)、层粘连蛋白(LN)，间充质溶解素对胶原的作用不同于间质胶原酶和明胶酶，它们能降解Ⅳ、Ⅴ、Ⅷ、Ⅹ型胶原酶以及Ⅰ型胶原的氨基端。 通过影响细胞外基质，基质金属蛋白酶蛋白家族参与胚胎发育、形态发生、组织重塑等过程，并参与炎症、肿瘤、心血管、神经等许多疾病过程。

MMP-2又叫明胶酶A， 其蛋白主要由纤维结缔组织细胞和肿瘤细胞产生，分子量为72kDa。 MMP-9又称为明胶酶B，主要由单核细胞、巨噬细胞多形核白细胞和肿瘤细胞产生。分子量为92kDa，是MMPs中分子量最大的酶。 中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL)是1993年Kjeldsen等人在研究MMP-9在细胞内存在形式时发现的，它能够与MMP-9聚合形成异源二聚体，保护和调节MMP-9活性，从而促进恶变细胞的浸润和转移。 检测MMP-9和MMP-2的活性，对分析肿瘤细胞恶性程度和预后提供帮助。

NGAL的三级结构 由N 端的310螺旋、C 端的α螺旋和中间的和中间的八段反平行的β折叠所构成，这八段反平行式β折叠构成了一个β折叠桶结构。 此β折叠桶结构一端是开放的，为与配体结合提供了进口；而另一端则被短的N 端310螺旋所封闭。在β折叠桶底部内侧排列着疏水的芳香族和脂肪族氨基酸残基，形成了一个疏水核或疏水内部，为结合亲脂性配体提供了位点。

MMP-2的结构 Pre: 信号肽序列 Pro: 带巯基的前肽 Zn: Zn离子结合部分 II: 能结合胶原的II型纤维结合素结构域 H: 绞链区 Hemopexin：类血红素蛋白结构，由四段重复序列组成，其中第一个与第四个间存在一 个二硫键。

MMP-9的结构 由三个α螺旋与5个β折叠构成 含有2个锌离子和5个钙离子 右图可见一个小分子化合物位于酶活性中心，并与一个锌离子结合

NGAL能与MMP-9以二硫键的方式结合，能起到保护和调节MMP-9功能的作用，所以NGAL与肿瘤的侵袭移动有密切的联系。 汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民教授课题组以转染有pcDNA3 空白质粒载体的SHEEC 细胞为对照，酶谱法检测结果表明，转染有pcDNA-NGAL (-) 的SHEEC 细胞分泌的MMP-9 和MMP-2的活性均明显降低；而与此同时，转染有pcDNA-NGAL (＋) 的SHEEC 细胞分泌的MMP-9 和MMP-2的活性均明显升高。表明通过有义、反义技术使NGAL 基因表达发生改变可以对SHEEC 细胞分泌的MMP-9 和MMP-2 的活性产生明显影响。 M：蛋白marker；1. 细胞培养基；2. pcDNA3；3. pcDNA-NGAL ( + )；4. pcDNA-NGAL ( - )

实验原理 MMP-2和MMP-9活性的强弱与肿瘤浸润和转移的能力密切相关。明胶是这两种酶的底物。所以在体外通过酶谱法（Zymography）检测样品（组织，细胞培养液，血清，血浆，尿）中MMP-2和MMP-9的活性，对了解肿瘤细胞的恶性程度、监测治疗效果和评价预后具有重要的指导意义。 酶谱法的基本过程是先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含0.1％明胶）电泳分离，然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2和MMP-9恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。

实验操作 样品制备: 血清、血浆和尿样品可取适量直接与2×SDS 样品缓冲液等体积混匀进行下一步实验，如酶活性太高造成显带不理想，可适当进行稀释; 凝胶的制备: 玻璃板对齐后放入夹中垂直卡紧。按表格配10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶，灌胶时，可用5ml加样枪吸取凝胶沿玻璃板加进去，然后胶上加一层异丙醇，以隔离空气中的氧，促进凝胶聚合（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时凝胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡）。约几分钟后当异丙醇和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了，再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。按前面表格配4％的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶，然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出;

在每个加样孔中加入10 µl样品; 电泳： 在4℃ 100V下，约2h; 凝胶的处理： （1）电泳结束后，取下凝胶，放入平皿中，用洗涤缓冲液在室温摇动下洗涤1h，其间换液一次； （2）弃去洗涤缓冲液，然后加入孵育缓冲液没过胶面，至37℃恒温箱中，24h后取出； （3）弃去孵育缓冲液，加入0.1%考马斯亮蓝染液染色约30min，回收染液，加入脱色液脱色至蓝色背景和白色条带均十分明显时，用5％乙酸中止脱色； （4）待凝胶在5％乙酸中恢复到适当大小后，用凝胶图象处理系统分析结果，以白色条带的净光密度值相对定量样品中酶活性。

预期实验结果 N N P P 135kD 92kD 72kD NGAL/MMP-9 Pro-MMP-2 MMP-9

第三部分，食管癌患者血液中MMP-2和MMP-9 的活性变化及其临床意义 癌症的发生发展是多基因多因素参与的慢性长期过程。 癌组织的发生发展有着由单纯增生→不典型增生→原位癌→浸润癌演变过程的连续性。 癌症分期大别分为四期： 第一期：肿瘤局限一处，没有扩散迹象； 第二期：肿瘤已扩散到邻近的淋巴结，但没有波及其它器官或组织； 第三期：肿瘤除了扩散到邻近淋巴结外，还波及附近器官或组织； 第四期：肿瘤已扩散到远处的部位； 一般言之，第一、二期属早期，治疗后痊愈机会高；第三、四期属晚期，治愈及存 活的机会较差。

实验设计 查阅相关资料，讨论MMP-2与MMP-9在食管癌各发展阶段的活性检测能否作为监控癌症发展的一个指标，应该注意什么问题，其临床意义如何？ 若发现MMP-2与MMP-9在癌症病人中出现异常，谈谈你可能采取的方法来遏抑这种情况。