石河子大学大学生创新训练项目结题答辩 绵羊包虫病新型诊断方法 初步研究 项目研究团队：营瑞文 张琪 指 导 老 师：孟庆玲
一、研究背景及目的 二、技术路线与预期成果 三、实验内容 四、实验结果 五、小组分工及实验心得 六、项目取得的成绩 七、经费使用情况 汇报提纲 一、研究背景及目的 二、技术路线与预期成果 三、实验内容 四、实验结果 五、小组分工及实验心得 六、项目取得的成绩 七、经费使用情况
一、背景及目的 包虫病是由细粒棘球绦虫（Eg）和多房棘球绦虫（Em）的续绦期幼虫寄生于动物或人体体内所引起的人畜共患病，该病在我国西部牧区绵羊和牧民中广泛流行，严重威胁人民健康，已经成为当地群众因病致贫的重要原因之一。 本项目运用基因工程技术对细粒棘球蚴抗原B进行重组和表达，建立特异性强、敏感性高、检测绵羊包虫病特异性抗体的免疫胶体金诊断方法。在新疆牧区初步推广应用，为我区绵羊包虫病的科学防控提供技术支撑，促进新疆畜牧业的持续、健康发展。
二、技术路线与预期成果 1.技术路线 2.预期成果 细粒棘球蚴抗原B基因的克隆与表达 重组蛋白的纯化 免疫胶体金诊断方法的建立 特异性、敏感性和重复性分析 与现有诊断试剂准确性比较 免疫胶体金诊断试剂的初步应用 （1）免疫胶体金诊断方法的建立； （2）发表核心期刊论文1篇。
三、实验内容 1、细粒棘球蚴候选抗原B的克隆 采取病料，设定特异性引物，对细粒棘球蚴候选基因Ag B进行克隆，并测序。 2、候选基因的原核表达 将克隆的Ag B基因在大肠埃希菌BL21(DE3)中进行表达，并进行SDS-PAGE试验，随后进行Western-Blot检测。 3、重组蛋白的纯化 对表达的Ag B蛋白进行纯化，然后进行SDS-PAGE试验，然后进行Western-Blot检测其反应原性。
4、免疫胶体金诊断方法的建立 应用枸橼酸三钠还原法制备胶体金— SPA及抗体的处理—免疫金的制备—免疫金的纯化—试纸的制备。 5、特异性、敏感性分析 对试纸条进行特异性、敏感性、准确性、稳定性检测。
四、实验结果 1、CE Ag B基因的PCR扩增结果
2.重组质粒pMD18T-CE-Ag B双酶切结果
2、PET-28a-1-CE-Ag B双酶切结果
3、CE Ag B蛋白的SDS-PAGE分析
4、表达产物的Western blot鉴定
5、纯化蛋白的Western blot
6、烧制的胶体金溶液
7、免疫金
8、细粒棘球蚴特异抗体SPA胶体金检测试纸条的组装
8、特异性、敏感性分析 1 特异性检测结果 试纸条检测绵羊细粒棘球蚴阳性血清时为两条线，检测羊肺炎支原体阳性血清、衣原体阳性血清均为阴性。
2 敏感性检测结果 试纸条最低可检出1: 100倍稀释的细粒棘球蚴AgB免疫的绵羊血清；1: 128倍稀释的细粒棘球蚴Ag B免疫的小鼠血清。 3 准确性检测结果 采用本实验建立的胶体金免疫层析试纸条与包虫IgG试剂盒分别对50份绵羊血清进行检测，阳性率分别为90% ( 45/50 )，和94 % (47/50)，试纸条与试剂盒符合率为92%。
4 稳定性检测结果 用离心管加干燥剂密封的试纸条，在室温下可保存3个月，在4℃的试纸条可保存6个月。
五、小组分工及实验心得 1.小组分工 姓名 学 号 专业 所在学院 分 工 营瑞文 2011513128 动物医学 动物科技学院 学 号 专业 所在学院 分 工 营瑞文 2011513128 动物医学 动物科技学院 候选抗原基因的克隆、表达 张琪 2011513161 免疫胶体金诊断方法的建立
2.实验心得 在项目实施过程中我们在观察、收集、分析、解读数据的能力、文献检索、阅读、表达和写作能力得到了很大的提高。同时锻炼了我们及时发现问题及解决问题的能力、共同目标下的分工协作与配合及组织与协调能力、沟通交流能力、表达力及理解力、自我认识能力都得到了充分的锻炼及提高。通过此次实验我们深深认识到了我们自己在专业技能上的不足，这更促使我们不断学习与反思。
六、项目取得的成绩 1.掌握了基因克隆技术，蛋白表达及纯化的方法; 2.胶体金免疫层析方法的检测以及相关检测分析; 3.细粒棘球蚴候选抗原B基因的克隆、表达与纯化研究，家畜生态学报（已投稿）。
七、经费使用情况 1.业务费 计算、分析、测试费（仪器使用费）： 1000元 文献检索费（查新费）：200元 论文出版费（版面费）：1300元 2.实验装置试制费：300元 3.材料费（仪器的购置）：2200元．
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