Methods of cell biology research 细胞生物学的研究方法 Methods of cell biology research

显 微 镜 技 术

显微镜技术 ㈠分辨率可达0.2m的光学显微镜 ㈡分辨率可达2nm的电子显微镜

一、光学显微镜技术 1.普通光学显微镜 2.荧光显微镜 3.相差显微镜 4.暗视野显微镜 5.共聚焦激光扫描显微镜

1.普通光学显微镜 照明系统 光学系统 机械装置 镜筒 物镜转换器 镜臂 镜台 调节旋钮 光源 镜座

光学显微镜的参数 (1)分辨率(resolution，R): 是指能够区分相近两点的最小距离。 Rx,y=0.61λ/n•sinθ Rz=2λ/(n•sinθ)2

Rx,y=0.61λ/n•sinθ n :聚光镜和物镜之间 介质的折射率。 空气为1,油为1.3-1.5 θ :标本对物镜镜口 张角的半角. sinθ的最大值为1 λ :照明光源的波长。

(2)最大放大倍数： 最大放大倍数= 人眼分辨率(～ 100 m ) 光镜分辨率(～ 0.2 m ) =～500倍

(3)光学显微镜总放大倍数： 光学显微镜总放大倍数 物镜放大倍数 × 目镜放大倍数

标 本 制 备 目的：使大分子交联而保持固定，不 第一步.固定(fixation) 至于在后面过程中移位或丢失。 试剂：甲醛、戊二醛 机理：可与蛋白质的游离氨基形成共 价键，将邻近蛋白分子交联。

第二步.脱水（dehydration） 试剂：乙醇 第三步.包埋（embed） 目的：包埋使组织变得坚硬,便于切片。 试剂：蜡、树脂 机理：可进入细胞内，起支持作用。 第四步.切片（section） 目的：切成薄片，便于切片黏附在载 玻片上进行染色。 仪器：切片机 切片厚度：1～10 m

第五步.染色（staining） 目的：使细胞成为可见。 方法： A.选择性染色 苏木精－细胞内核酸的分布 伊 红－细胞质染色

B.特异性染色: 酶 + 底物 抗原 + 抗体 酶标记 荧光标记

2.荧 光 显 微 镜

荧光分子可吸收特定波长的光线（激发光），并发射出比原来吸收波长更长的光（发射光）。 原理: 荧光分子可吸收特定波长的光线（激发光），并发射出比原来吸收波长更长的光（发射光）。 可见光 紫外光 红外光 short long λ 基本构造： A 光源：紫外光 B 二向色镜：反射短波光线，透过长波光线 C 二组滤光片：得到纯的激发光和发射光

第二滤光片：阻断不需要 的荧光信号，仅让绿色荧 光通过 第二滤光片：阻断不需要 的荧光信号，仅让绿色荧 光通过 二向色镜： 反射短波光线，透过长 波光线 ⑴一组滤光片：激发滤片和吸收滤片。⑵双色镜。 第一滤光片：仅让蓝光通过

荧光的观察 1.自发荧光 某些天然物质本身能发出荧光，如叶绿 素。 2.二次荧光 非荧光性物质用荧光色素染色后，可产生 某些天然物质本身能发出荧光，如叶绿 素。 2.二次荧光   非荧光性物质用荧光色素染色后，可产生 荧光（二次荧光），以便于进行观察 。 3.免疫荧光显微镜技术   带荧光标记的抗体与标本中的抗原结合， 这样就能通过抗体结合的荧光观察到抗原 4.绿色荧光蛋白

免疫荧光显微镜技术（Immunofluorescence microscopy） ⑴原理: 荧光抗体与标本中组织或细胞的抗原进行反应，在荧光显微镜下可观察到明亮的特异荧光。 ⑵荧光素标记抗体的方法 ①直接法：荧光素直接和第一抗体偶联。 ②间接法：荧光素先和第二抗体(抗一抗的抗体)偶联，再与第一抗体作用。

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绿色荧光蛋白 green fluorescent protein GFP ⑵特点: 可在光镜水平，对特异蛋白等生物大分子进行定位及显示一些细胞超微结构。 ⑶应用: a.特异蛋白等大分子的定位 b.观察过氧化物酶体

特异蛋白质生物大分子定位 荧光显微下观察 载体(GFP基因＋待定位蛋白基因) 导入特定的细胞 待定蛋白质在细胞内的位置分布 科研人员通过一种荧光促进剂来激发诸如叶绿素等玫瑰内部潜在的发光物质，让玫瑰花自然产生荧光。

观察过氧化物酶体 载体（GFP ＋过氧化物体内酶的基因） 导入不同细胞 荧光显微镜下观察 各种细胞的过氧化物酶体

3.直视活细胞的相差显微镜 1).特点: 可用以观察活细胞。 2).原理: 波长 颜色 振幅 亮度 速度 相位

⑴普通显微镜: 光通过染色标本时，波长和振幅发生变化，人眼才能观察到。但光通过活细胞时，波长和振幅几乎无改变，这就无法用人眼观察。

⑵相差显微镜： 细胞内的各结构可因密度不同而产生相位差(即光程差)，不过人眼无法鉴别这种微小的变化。相差显微镜能够把这种“相位差”变成“振幅差”，即图像的明暗差。

通过致密部分(如细胞核),速度慢 通过疏松部位(如细胞质),速度快 相位差 (光程差) 相差显微镜 振幅差 (明暗差)

倒置相差显微镜 载物台的上方： 光源 载物台的下方： 物镜 长焦距聚光器 应用：直接对培养的细胞进行观察                                                                                                                                                                                                                           倒置相差显微镜 载物台的上方： 光源 长焦距聚光器 载物台的下方： 物镜 应用：直接对培养的细胞进行观察 载物台面积较大，在物镜上方，载物台上方有一个长焦距聚光器和照明光源，因此聚光器与载物台之间的工作距离提高可以放置培养皿、培养瓶等容器， 直接对培养的细胞进行观察。

                                                                                                                                                                                                                                        4.观察物体轮廓的暗视野显微镜 在日常生活中，室内飞扬的微粒尘土是不易被看见的，但在暗的房间中若有一束光线从门缝斜射过来，灰尘便粒粒可见了，这是光学上的丁达尔现象。 ——制造暗视野显微镜的灵感

原理: 利用特殊装置使照射光斜照到样品上，照射光无法进入物镜，故呈暗视野。只有从样品发出的散射光才能进入物镜被放大,在暗的背景中呈现明亮的像。

应用： 能观察物体轮廓,分不清内部的微细结构。 用以观察活细胞内的细胞核、线粒体, 以 及液体介质中的细菌等微粒的运动 。

四种不同的光镜成像技术下的培养的成纤维细胞图像 A.亮视野显微镜 B.相差显微镜 C. Normarski相差显微镜（微分干涉差显微镜）图像具有浮雕效果 D.暗视野显微镜

5.共聚焦激光扫描显微镜

共聚焦针孔 双色镜 由针孔来的光线聚集成一点照射到荧光样品上 B.由焦点发射出的荧光聚集在针孔到达检测器 C.焦点外发射出的光不能聚集在针孔，检测器无法检测

"显微CT" 激光作扫描光源 扫描焦平面上样品，得样品切面像 载物台上下移动,改变焦平面 得不同层次的切面图像 计算机图像三维重组获样品立体图像

分辨率： 因激光束波长较短，光束很细，所以激光扫描共焦显微镜有较高的分辨率，约是普通光镜的3倍。 应用： 观察细胞形态 统计光密度来定量细胞内成分 三维重建

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二、电子显微镜 1.透射电子显微镜 2.扫描电子显微镜 3.透射电镜增大反差的方法

1.透射电子显微镜 分辨率 理论上d = 0.002 nm 实际上d = 0.1 nm 生物标本d = 2 nm 是光学显微镜分辨率的100倍。

光学显微镜 透射电镜

透射电镜的成像原理 电子束通过标本时，根据标本各部位密度的不同，部分电子发生散射，只有剩余的电子成像，经物镜和投射镜放大后投射到照相底片或荧屏上。 由于散射的电子不参加成像，故标本中密度大的部分成像后形成电子流量减少的暗区；相反密度小的部分散射电子少而形成明区。

透射电镜生物标本制备过程 ⑴取材 ⑵固定:防止产生结构改变。 戊二醛：在蛋白质分子之间形成 共价键，将它们交联在一起。 四氧化锇：除与蛋白共价结合外, 还对脂类有良好的固定效果。

脱水：标本必须置于高真空中进行电镜观察,所以电镜生物标本不能含水。梯度乙醇。 包埋:为使柔软生物组织制成超薄切片,并使切片耐受高真空、电子轰击，应在切片前将标本进行包埋,常用环氧树脂。 切片:电子穿透力很弱,需将样品制成50～100nm厚薄片。约为细胞的1/200厚度。 染色:生物分子由原子序数低的轻元素组成，它们散射电子能力弱,在电镜下几乎不存在明暗反差,需加大生物样品反差,进行染色。重金属浸染。

电镜三维重建技术

2.扫描电子显微镜

成 像 原 理 二次电子

扫描电镜的成像原理 电子束在扫描线圈驱动下，在样品表面按一定时间、空间顺序作栅网式扫描。聚焦电子束与样品相互作用，产生二次电子。二次电子发射量随样品表面形貌而变化； 二次电子信号被收集、转换、放大，在电视荧光屏上同步扫描成像。

A .原理 二次电子 B .分辨率 3-10nm C .样品的制备 * 固定 * 干燥 * 染色 （离子溅射镀膜） D. 应用 标本表面的三维结构

3.透射电镜样品提高反差的方法 ⑴ 负染法 ⑵ 金属投影法 冰冻断裂 两个应用特例 冰冻蚀刻

负 染 法 原理：用只沉积于样品周围的、比样品密度高的物质(如磷钨酸)对样品进行染色，使样品和背景形成显著的明暗对比,这种染背景而不染样品的方法叫负染。 应用：适用于颗粒或纤维等游离的样品。特别是在病毒性致病因子的超微病理诊断中广泛应用。

金属投影法 随样品表面 结构的高低 起伏，重金 属形成不同 厚度的薄膜， 显示了投影 效果，给出 了一个样品 表面结构的 三维图像。

⑴冰冻断裂（freeze-fracture）

B 样品的制备 * 冰冻组织 ( N2，_196℃) * 切割 * 喷镀 (铂) * 加固 (C) * 复型

⑵冰冻蚀刻（freeze-etching） A. 应用 观察膜内部及外部结构 B. 样品制备 真空中升华 水有固态、液态、气态三中态相.根据热力学中的相平衡理论,随压力的降低,水的冰点变化不大,而沸点却越来越低,向冰点靠近.当压力降到一定的真空度时,水的沸点和冰点重合,冰就可以不经液态而直接汽化为气体,这一过程称为升华.

优点 * 样品不经固定、脱水、包埋，更接近自然状态 * 对样品无损伤 * 研究膜分子结构的唯一显示方法 * 可获得立体结构图象

三、纳米显微技术 （一）扫描隧道显微镜 可直接观察大分子的三维结构，如DNA分子双螺旋结构中的大沟和小沟以及大肠杆菌的环状DNA的结构。

（二）原子力显微镜 可对单个分子进行操控，通过检测操作后引发的生物化学反应来研究生物大分子和大分子复合物的功能，即进行所谓的分子手术(molecular surgery)。