第十三章 程序性细胞死亡与细胞衰老 第一节 程序性细胞死亡 第二节 细胞衰老 作业

第一节 程序性细胞死亡 ●Hayflick界限(Hayflick Limitation） ●细胞在体内条件下的衰老 ●衰老细胞结构的变化 第一节 程序性细胞死亡 衰老（aging，senescence，senility）又称老化，通常指生物发育成熟后，在正常情况下随着年龄的增加，机能减退，内环境稳定性下降，结构中心组分退行性变化，趋向死亡的不可逆的现象。 衰老和死亡是生命的基本现象，衰老过程发生在生物界的整体水平、种群水平、个体水平、细胞水平以及分子水平等不同的层次。 ●Hayflick界限(Hayflick Limitation） ●细胞在体内条件下的衰老 ●衰老细胞结构的变化 ●细胞衰老的分子机理

一、Hayflick界限(Hayflick Limitation） ●概念：关于细胞增殖能力和寿命是有限的观点。 细胞，至少是培养的二倍体细胞，不是不死的，而是有一定的 寿命；它们的增殖能力不是无限的，而是有一定的界限，这就 是 Hayflick界限 ◆癌细胞或培养的细胞系是不正常细胞，其染色体数目或形态 已经不同于原先的细胞 ◆细胞的增殖能力与供体年龄有关 ◆物种寿命与培养细胞寿命之间存在着一定的关系 ●二倍体细胞的衰老是由细胞本身决定的 ◆决定细胞衰老的因素在细胞内部，而不是外部的环境 ◆是细胞核而不是细胞质决定了细胞衰老

不同年龄来源的人成纤维细胞的增殖代数 细胞来源 人胚胎成纤维细胞 中年人成 纤维细胞 老年人成 可增殖 代数 40-60 20 2-4

二、细胞在体内条件下的衰老 ●在机体内，细胞的衰老和死亡是常见的现象，甚至在 个体发育的早期也会发生; ●正常情况下终生保持分裂的细胞，其分裂能力是否随 着有机体年龄的增高而下降？它们 会不会衰老？ ◆衰老动物体内，细胞分裂速度显著减慢，其原因主要 是G1期明显延长; ◆衰老个体内的环境因素影响了细胞的增殖和衰老; ◆骨髓干细胞移植实验说明随着年龄的增加，干细胞 增殖速度也趋缓慢.

三、衰老细胞结构的变化 ●内质网的变化：内质网成分弥散性地分散于核周胞质中，粗面内质网的总量似乎是减少了 ●细胞核的变化：细胞核随着细胞分裂次数的增加不断增大；细胞核的核膜内折（invagination）;染色质固缩化 ●内质网的变化：内质网成分弥散性地分散于核周胞质中，粗面内质网的总量似乎是减少了 ●线粒体的变化：通常细胞中线粒体的数量随年龄的增大而减少，而其体积则随年龄的增大而增大 ●致密体的生成：细胞中致密体包括色素等的生成与积累，亦是 增多 ●膜系统的变化：其膜流动性降低、韧性减小；细胞间间隙连接和细胞膜内颗粒的分布也发生变化

细胞衰老的机理 关于衰老的机理具有许多不同的学说，概括起来主要有差错学派（Error theories）和遗传学派（Genetic /Programmed theories）两大类，前者强调衰老是由于细胞中的各种错误积累引起的，后者强调衰老是遗传决定的自然演进过程。 （一）差错学派 细胞衰老是各种细胞成分在受到内外环境的损伤作用后，因缺乏完善的修复，使“差错”积累，导致细胞衰老。根据对导致“差错”的主要因子和主导因子的认识不同，可分为不同的学说。 （二）遗传学派 认为衰老是遗传决定的自然演进过程，一切细胞均有内在的预定程序决定其寿命，而细胞寿命又决定种属寿命的差异，外部因素只能使细胞寿命在限定范围内变动

正常儿童（左）和婴幼儿早衰症患者（右）

1．代谢废物积累（waste product accumulation） 细胞代谢产物积累至一定量后会危害细胞，引起衰老，哺乳动物脂褐质的沉积是一个典型的例子，在细胞内沉积增多，阻碍细胞的物质交流和信号传递，最后导致细胞衰老。 2．大分子交联（cross linking） 过量的大分子交联是衰老的一个主要因素，如DNA交联和胶原胶联均可损害其功能，引起衰老。

3．自由基学说（free radical theories） 自由基含有未配对电子，具有高度反应活性，可引发链式自由基反应，引起DNA、蛋白质和脂类，尤其是多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty Acids，PUFA）等大分子物质变性和交联，损伤DNA、生物膜、重要的结构蛋白和功能蛋白，从而引起衰老各种现象的发生。 内源性氧自由基是人体自由基的主要来源，正常细胞内存在清除自由基的防御系统，包括酶系统和非酶系统，前者如：超氧化物歧化酶（SOD），过氧化氢酶（CAT），谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX），非酶系统有维生素E、醌类物质等电子受体。 过量表达SOD的转基因动物表现出寿命延长，但是剔除SOD基因的动物并未表现出衰老

1．程序性衰老（programmed senescence） 程序性衰老理论认为，生物的生长、发育、衰老和死亡都由基因程序控制的，衰老实际上是某些基因依次开启或关闭的结果。 2．长寿基因（longevity genes） 线虫中age1基因 酵母中clk1基因

3．复制性衰老（replicative senescence） 细胞增殖次数与端粒DNA长度有关。 细胞DNA每复制一次端粒就缩短一段，当缩短到一定程度至Hayflick点时，可能会启动DNA损伤检测点（DNA damage checkpoint），激活p53，引起p21表达，导致不可逆地退出细胞周期，走向衰亡。 端粒的长度还与端粒酶（telomerase）的活性有关，在精原细胞、干细胞和肿瘤细胞（如Hela细胞）中有较高的端粒酶活性，而正常体细胞中端粒酶的活性很低，呈抑制状态。

第二节 细胞衰老 一、细胞衰老的概念及生理意义 二、细胞衰老的形态学特征 三、细胞衰老的生化特征 四、诱导细胞衰老的因子 五、细胞衰老的检测 六、细胞衰老的分子调控机理 七、细胞衰老与坏死

细胞衰老的概念及生理意义 细胞凋亡：是一个由基因决定的自动结束细胞生命的过程。 生理意义： （1）确保组织器官正常发育、生长 ：在机体的发育、生长过程中，凋亡可以清除多余的和失去功能的细胞，所以，在器官和组织形成中发挥了重要的作用。例如，在人胚胎肢芽发育过程中，通过凋亡使指间组织细胞通过凋亡被逐渐消除，形成指间。 （2）维持内环境稳定 ：如果机体对受损、突变或者衰老的细胞不能及时清除话，就会干扰内环境稳定。例如，突变细胞不及时清除会导致肿瘤发生。 （3）发挥积极的防御功能 ：例如，当细胞受到病毒感染时，受感染的细胞可以通过凋亡来阻止病毒的增殖，或通过 DNA 的降解，把病毒的 DNA 进行分解。

细胞衰老的形态学特征 衰老的起始：细胞表面的特化结构如微绒毛消失，细胞间接触的消失，但细胞膜依然完整，未失去选择通透性；线粒体大体完整，但核糖体逐渐从内质网上脱离，内质网囊腔膨胀，并逐渐与质膜融合；染色质固缩，形成新月形帽状结构等形态，沿着核膜分布 衰老小体的形成：核染色质断裂为大小不等的片段，与某 些细胞器如线粒体一起聚集，被反折的细胞质膜所包围，形成衰老小体，从外观上看，细胞表面发泡，产生了许多泡状或芽状突起，随后逐渐分隔，形成单个的凋亡小体 衰老小体逐渐为邻近的细胞或体内吞噬细胞所吞噬，凋亡细胞的残余物质被消化后重新利用

左图　典型凋亡小体：染色质呈新月状，并可见细胞器　 右图　凋亡细胞：凋亡细胞(↑)与邻近细胞分离

细胞衰老的生化特征 细胞凋亡的主要生化特征是形成由为180～200bpDNA片段或其整倍性片段组成特征性的DNA ladders ◆钙超载 ◆内源性核酸内切酶激活 ◆tTG（组织转氨酶）积累并达到较高水平

诱导细胞衰老的因子 物理性因子，包括射线（紫外线， 射线等），较温和的温度刺激（如热激，冷激）等 化学及生物因子：包括活性氧基团和分子，DNA和蛋白质合成的抑制剂，激素，细胞生长因子，肿瘤坏死因子（TNF），抗Fas/Apo-1/CD95抗体等

细胞衰老的检测 形态学观测：染色法、透射和扫描电镜观察 DNA电泳：DNA片段就呈现出梯状条带 TUNEL测定法，即DNA断裂的原位末端标记法 彗星电泳法（comet assay） 流式细胞分析 根据凋亡细胞DNA断裂和丢失，采用碘化丙啶使DNA产生激发荧光，用流式细胞仪检出凋亡的亚二倍体细胞，同时又能观察细胞的周期状态。

细胞衰老的分子调控机理 Caspase家族与凋亡 非Caspase依赖性细胞凋亡：凋亡诱导因子（AIF）；限制性核酸内切酶G（EndoG）

Caspase家族与衰老 Caspase：Cysteine aspartic acic specific protease，即天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶，活性位点是半胱氨酸(Cysteine)，裂解靶蛋白位点是天冬氨酸残基后的肽键 发现：线虫(C.elegans)凋亡研究发现ced3,ced4基因促进细胞凋亡，ced9基因阻止ced3/ced4的激活，抑制细胞凋亡。ced3哺乳类同源物是ICE（白介素- 1β转移酶)，即Caspase1 在哺乳动物中相应同源物：ced3=ICE, ced4=apaf1, ced9=bcl、2 Caspase家族：Caspase自身以非活化的Procaspase存在，其激活依赖于其他的Caspase在它的天冬氨酸位点裂解活化或自身活化 Caspase依赖性细胞凋亡途径

英国人悉尼·布雷诺尔、美国人罗伯特·霍维茨和英国人约翰·苏尔斯顿 2002年诺贝尔生理与医学奖获得者

级联反应路径 死亡底物的分配

细胞凋亡规律的图示 细胞收缩为膜泡

细胞凋亡抑制

轴突 由靶细胞释放的成活因子

a 正常T细胞杂交瘤细胞 b 凋亡细胞(扫描电镜) c 凋亡细胞(透射电镜)

caspase 超家族成员及其相应底物 凋亡起始者：Caspase-2，-8，-9，-10，-11 凋亡执行者：Caspase-3，6，7

执行Caspase的底物 类 别 代 表 性 蛋 白 作 用 蛋白激酶 黏着斑激酶（FAK）、PKB、PKC、RAF1 类 别 代 表 性 蛋 白 作 用 蛋白激酶 黏着斑激酶（FAK）、PKB、PKC、RAF1 FAK失活，破坏细胞黏着，导致凋亡细胞与邻近细胞脱离 细胞支架 核纤层蛋白、中间丝、肌动蛋白、凝溶胶蛋白 被切割导致核纤层解体，细胞核收缩，细胞形态改变 核酸内切酶 Caspase激活的DNA酶（CAD） 抑制蛋白被切割后激活，导致核内DNA降解 参与DNA修复酶 PARP（聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶，poly(ADP-ribose polymerase） 被切割后失活，丧失修复活性，以便DNA降解

细胞核断裂；大泡形成；细胞碎裂 吞噬细胞吞噬 轻微缓慢卷折，使染色质紧缩 然后分离，细胞质浓缩 正常细胞 细胞凋亡的过程

细胞色素c诱导的凋亡细胞DNA电泳图 1．细胞色素c诱导0 h 2．细胞色素c诱导1 h 3．细胞色素c诱导2 h 4．细胞色素c诱导3 h 5．细胞色素c诱导4 h 6．阴性对照 7．Marker （ 自赵允、翟中和）

TUNEL测定法

彗星电泳法

流式细胞分析

细胞凋亡与坏死(necrosis) 细胞坏死是细胞受到化学因素（如强酸、强碱、有毒物质）、物理因素（如热、辐射）和生物因素（如病原体）等环境因素的伤害，引起细胞死亡的现象。

细胞凋亡和细胞坏死的区别 区别点 细胞凋亡 细胞坏死 起因 生理性 病理性变化或剧烈损伤 范围 单个散在细胞 大片组织或成群细胞 细胞膜 保持完整，一直到形成凋亡小体 破损 染色质 凝聚在核膜下呈半月状 呈絮状、网状 细胞器 无明显变化 肿胀、内质网崩解 细胞体积 固缩变小 肿胀变大 凋亡小体 有，被邻近细胞或巨噬细胞吞噬 无，细胞自溶，残余碎片被巨噬细胞吞噬 基因组DNA 有控降解，电泳图谱呈梯状 随机降解，电泳图谱呈涂抹状 蛋白质合成 有 无 调节过程 受基因调控 被动进行 炎症反应 无，不释放细胞内容物 有，释放内容物。

细胞坏死　 2　细胞和细胞器肿胀、核染色质边集　 3　细胞膜、细胞器膜和核膜破裂、崩解、自溶 细胞凋亡　 4　细胞和细胞器皱缩，胞质致密，核染色质边集 5　胞质分叶状突起并形成多个凋亡小体，并与胞体分离 6　邻近巨噬细胞等包裹、吞噬凋亡小体

作业 一、名词解释 细胞衰老 细胞凋亡 Hayflick界限 二、简答题或论述题 1、细胞凋亡的概念、形态特征及其与坏死的区别是什么? 2、对于多细胞生物，细胞凋亡的生理意义何在? 3、动物细胞凋亡的基本途径有哪些? 4、细胞凋亡受到哪些因素的调控？ 5、什么是“Hayflick界限”? 6．复制衰老可能机制是什么?