（三） 电子显微镜方法 1．电子显微镜 何谓电子显微镜？ 电子显微镜（电镜）是使用电子来展示物件的内部或表面的显微镜。 电子显微镜主要有哪些类型？ 电子显微镜包括透射电镜、扫描电镜，以及电子探针、分析电镜、扫描透射电镜。

1938年，德国工程师Max Knoll和Ernst Ruska制造出了世界上第一台透射电子显微镜（TEM）。 ● 电子显微镜的发展史 1938年，德国工程师Max Knoll和Ernst Ruska制造出了世界上第一台透射电子显微镜（TEM）。 Max Knoll(1897-1969) Ernst Ruska(1906-1988) 电子显微镜的分辨率可以达到纳米级（10～9nm）。可以用来观察很多在可见光下看不见的物体，例如病毒。

1952年，英国工程师Charles Oatley制造出了第一台扫描电子显微镜（SEM）。 电子显微镜下的蚊子

（1）透射电镜（TEM） 什么叫透射电镜？有哪些分类？ 透射电镜即透射电子显微镜，利用电子射线（或称电子束也称电子波）穿透样品，而后经多级电子放大后成像在荧光屏上。它的主要优点是分辨率高，可用来观察组织和细胞内部的超微结构以及微生物和生物大分子的全貌。

透射电镜又分为一般TEM、高压TEM和超高压TEM： 1）一般TEM：最常用的是100KV电镜。这种电镜分辨率高（分辨率0.3nm，晶格分辨率0.14nm），但穿透力小，观察样品必须很薄，约为30～100nm，如细胞和组织的超薄切片、复型膜和负染样品等。这种电镜在生命科学领域中应用已非常普及。

工作原理：利用电子射线（或称电子束也称电子波）穿透样品，而后经多级电子放大后成像于荧光屏。 主要优点：分辨率高，可用来观察组织和细胞内部的超微结构以及微生物和生物大分子的全貌。

2）高压TEM：目前常用的是200KV电镜。这种电镜对样品的穿透力约为100KV电镜的1 3）超高压TEM：目前已有500KV、1000KV和3000KV的超高压TEM。这类电镜具有穿透本领强、辐射损伤小、可配备环境样品室及进行各种动态观察等优点，分辨率也已达到或超过100KV电镜的水平。在超高压电镜上附加充气样品室，人们可以观察活细胞内的超微结构动态变化。

（2）扫描电镜（SEM） 什么叫扫描电镜？有哪些分类？ 扫描电镜即扫描电子显微镜，利用电子射线轰击样品表面，引起二次电子等信号的发射，经检测装置接收后成像的一类电镜。 扫描电镜又分为一般SEM、场发射电子枪SEM和生物用SEM。

1）一般SEM：目前一般扫描电镜采用热发射电子枪，分辨率为6nm左右，如果采用六硼化镧电子枪，分辨率可提高到4～5nm。这种电镜在生命科学领域中的应用也已相当普及。

扫描电镜原理

工作原理：利用电子射线轰击样品表面，引起二次电子等信号的发射，经检测装置接收后成像的一类电镜。 主要优点：景深长，所获得的图像立体感强，可用来观察生物样品的各种形貌特征。

2）场发射电子枪SEM：由于场发射电子枪具有亮度高、能量分散少，阴极源尺寸小等优点，这种电镜的分辨率已达到3nm。其另一个优点是可以在低加速电压下进行高分辨率观察，因此可以直接观察绝缘体而不发生充、放电现象。 3）生物用SEM：这种SEM备有冰冻冷热样品台，可把含水生物样品迅速冷冻并对冰冻样品进行观察，可以减少化学处理引起的变化，使观察样品更接近于自然状态。如要观察内部结构，还可用冷刀把样品进行切开，加温使冰升华，并在其上喷镀一层金属再进行观察，所有这些过程都在SEM中不破坏真空的状态下进行。

什么情况下采用扫描电镜比较好？ 扫描电镜的特点是景深长，图像立体感强，可用来观察生物样品的各种形貌特征。如采用临界点干燥法可观察样品的表面形貌；冷冻割裂方法可观察样品割裂面的结构；铸型方法可观察管腔内表面的结构等。

（3）电子探针 电子探针主要用于探测微小区域的元素成分。其原义仅是一个物理学名词，指聚焦了的电子束。当电子束照射样品表面时，可激发X射线，X射线光量子的能量及波长与元素的原子序数有关，称为特征X射线。采用晶体分光光谱法测定X射线的波长和强度来分析样品成分的仪器，称为X射线分光光谱仪或电子探针；用锂漂移硅探头测定X射线能量和强度的仪器称为X射线能谱仪。

（4）分析电镜 分析电镜是利用电子射线轰击样品所产生的X射线或俄歇电子对样品元素进行分析的一类电镜。其特点是能在观察超微结构的同时，对样品中一个极微小的区域进行化学分析，从而在超微结构水平上测定各种细胞结构的化学成分及其变化规律。 1）分析TEM：在TEM上配备X射线能谱仪后即成为分析TEM，目前很多100KV和 200KV TEM都可以装上X射线检测附件，进行样品的元素分析。 2）分析SEM：在SEM上配备X射线能谱仪后，便可兼有电子探针分析样品化学成分的功能。 3）扫描俄歇电镜：把SEM与俄歇电子能量分析仪相结合，即成为扫描俄歇电镜，它能对样品表面进行微区元素分析，是一种表面微观分析电镜。

分析电镜 X线微区分析

（5）扫描透射电镜 SEM中电子射线作用于样品后，其中一部分电子可透过样品成为透射电子，另一部分则在样品表面形成散射电子，将透过样品的透射电子和散射电子用检测器接收成像，就成为扫描透射电镜。这种电镜一般用场发射电子枪，兼有TEM、SEM和分析电镜的特点，能观察较厚的样品，分辨本领和成像质量都很好，是近年来电镜技术的最大改进之一。

2．电子显微术 电子显微术即电镜样品制备技术。 广义的指以电子显微镜为工具，揭示样品的亚显微结构的显微科学技术。包括电镜的研制和使用，以及样品制备技术等。 （1）与TEM有关的电子显微术 透射电镜的电子显微术主要包括哪些？与普通光镜有什么区别，为什么？ 与TEM有关的电子显微术主要包括：超薄切片技术、负染色技术、冷冻蚀刻技术、电镜细胞化学技术、免疫电镜技术、电镜放射自显影技术等。

超薄切片技术主要包括取材、固定、包埋、切片、染色等步骤。

1）超薄切片技术：这是所有电镜生物样品制备技术中最常用、最基本的一种技术。要求把生物标本切得很薄才能在TEM下观察。厚度超过0 1）超薄切片技术：这是所有电镜生物样品制备技术中最常用、最基本的一种技术。要求把生物标本切得很薄才能在TEM下观察。厚度超过0.1μm的切片电子束就很难透过。超薄切片技术就是通过固定、脱水、包埋、切片和染色等步骤，将生物标本切成薄于0.1μm的超薄切片的样品制备技术，用于生物组织的内部超微结构研究。

上图 超薄切片机局部 下图 玻璃刀制作仪

2）负染色技术：利用电子密度比标本高的重金属盐（如磷钨酸钠、醋酸铀等）将生物标本包围起来，增强背景散射电子的能力以提高反差，在黑暗的背景下显示标本的形态结构，称负染色技术。这种技术操作简便，主要用于颗粒状标本（如细菌、病毒、分离细胞器等）的研究。 3）冷冻蚀刻技术：在快速冷冻下对生物样品进行断裂、蚀刻和复型，制备生物样品复型膜的技术称冷冻蚀刻技术。在电镜下观察复型膜可获得立体感强的超微结构图像，主要用于生物膜结构的研究。

4）电镜细胞化学技术：在超微结构水平上，通过电镜细胞化学反应来研究细胞成分的分布和变化的方法称电镜细胞化学技术。这一技术把细胞超微结构与其化学组成有机地结合起来，目前主要用于研究细胞内各种大分子物质和酶的定位等。 5）免疫电镜技术：这是一种使抗原在超微结构水平上定位的技术，应用与抗原相应的标记抗体，在电镜下观察标记物的位置，从而定位相应抗原。这一技术具有灵敏度高、特异性强的特点。 6）电镜放射自显影技术：这是电镜技术与放射自显影技术相结合，观察放射性物质在超微结构水平上的定位和变化，从而了解细胞的各种代谢活动。这一技术使结构与功能的研究结合起来，是一种动态的研究方法。

与SEM有关的电子显微术主要包括：SEM常规制样技术、生物标本割裂技术、铸型技术。 扫描电镜的电子显微术主要包括哪些？ 与SEM有关的电子显微术主要包括：SEM常规制样技术、生物标本割裂技术、铸型技术。 CPD030 临界冷冻干燥装置 LDM-150D型离子溅射镀膜机 等设备

1）SEM常规制样技术：SEM适合于研究生物样品的表面特征，样品制备包括样品观察面的暴露、固定、干燥和导电等步骤，使表面特征充分暴露而不变形。这一技术是 SEM样品制备的常规技术，主要用于组织、细胞、寄生虫等表面形貌的研究。

2）生物标本割裂技术：将生物标本放在特殊包埋剂中经冷冻或其他方法固化，然后把固化的标本割裂，暴露组织和细胞的内部结构，再经干燥和导电后在 SEM下观察。这一技术使 SEM能观察生物标本的内部结构，目前最常用的是冷冻割裂技术。 3）铸型技术：用铸型技术（如甲基丙烯酸酯和ABS等）注入生物体的腔性器官，制成铸型标本，可在 SEM下观察管腔内表面的结构。目前最常用的是血管铸型技术，用以研究微小血管的分布和形貌。

3．病理超微结构观察 运用透射及扫描电子显微镜对细胞的内部和表面超微结构进行更细微的观察。主要用于确定细胞的种类，如上皮起源或黑色素细胞起源的组织细胞，找到一些特征性结构可以纠正从光学显微镜观察中得到的错误印象。该技术还有助对肿瘤进行分类，而正确的分类有助于选择正确的治疗方案。另外，该技术对识别新发现的疾病的组织起源也是十分重要的。

大鼠卵巢 间质细胞 左上 青年对照 左下 老年对照 右上 二仙汤组 右中 温肾组 右下 泻火组

大鼠睾丸 精子细胞 左上 青年对照 左下 老年对照 右上 二仙汤组 右中 温肾组 右下 泻火组

大鼠睾丸 精子 左上 青年对照 左下 老年对照 右上 二仙汤组 右中 温肾组 右下 泻火组

二、实验中医学应用形态学方法的现状与案例 （一）藏象理论 藏象理论的形态学研究取得了哪些成就？

1．肾的研究 （1）肾本质的研究 肾虚证与下丘脑-垂体-靶腺轴密切相关，是有物质基础的。肾阳虚证动物模型建立，并能被温补肾阳中药所纠正。 （2）肾主生殖的研究 卵巢、子宫、阴道，睾丸、精囊腺。 （3）肾主水液的研究 腺嘌呤饲养大鼠肾病模型。 （4）肾主骨生髓的研究 涉及骨髓造血抑制、脑神经、骨等研究。 （5）肾开窍于耳的研究 听觉。 （6）肾与二十四节气相关性研究 肾上腺皮质。

2．脾的研究 （1）脾主运化的研究 口腔到胃肠消化道各段及肝、胆、胰等研究，以及骨骼肌、心肌等研究。以及脾虚大鼠造模、脾阳虚证造模。 （2）脾气散精的研究。 （3）内伤脾胃百病由生的研究 细胞免疫功能和调节，胸腺和脾脏形态。 （4）脾虚衰老的研究 大鼠大脑海马。

3．肝的研究 （1）肝主疏泄的研究 中枢神经生物学，涉及下丘脑不同核团、海马、杏仁核等；下丘脑-垂体-肾上腺轴；小肠细胞；肝细胞。 （2）肝藏血的研究 肝硬化。 4．心的研究 （1）心主血的研究 超声心动图临床研究、心气虚证动物模型。 （2）心主脉的研究 甲皱微循环。 5．肺的研究 （1）肺主气司呼吸的研究 患者，以及慢性阻塞性肺疾病大鼠模型。 （2）肺与大肠相表里的研究。

（二）证候理论 1．实热、虚热证候的研究 2．血瘀证候的研究 3．温病营血证候的研究

（三）经络理论 1．经脉研究 包括疏松结缔组织、神经、血管、淋巴和组织液等解剖结构。外周神经、中枢神经，提出脊髓是针刺传入的初级中枢，丘脑是感觉上升到意识之前的一个调整中枢，大脑皮层是多种感觉信号进入意识领域的关键部位，循经感传是由于在中枢神经系统特别是大脑皮质体表感觉代表区所产生的兴奋沿某种特定空间构型进行定向扩散的结果。 2．络脉研究 中小血管、微血管研究。

3．穴位研究 （1）穴位大体解剖研究。 （2）穴位巨微、显微形态研究 分辨其其神经、微血管及淋巴管分支等组织分布，真皮-皮下组织边界、血管-神经束，神经-肥大细胞联接。发现穴位普遍存在着大神经分支、淋巴管襻数量同非穴位处比较也有显著性差异，认为穴位的针刺感受组织是神经、血管及淋巴管的复合结构。

（四）新近发展形态学技术的引进 1．数字化可视人技术应用于中医学研究 2．CT、MRI（NMR）、PET技术应用于中医对形态观察的研究 还有磁共振功能成像（fMRI-BOLD）技术等。

三、展望 形态学方法是中医实验研究的重要途径之一。我们相信，该领域将会有长足的发展。如何更有效地利用好形态学研究技术，在研究思路、研究方法上还有待探索和创新。 （一）实验中医学运用形态学方法存在的问题 以往的研究暴露出一些问题，主要如下： 1．中西医对五脏形态认识的差异 2．形态学改变的客观表述 3．形态学研究的动物模型

（二）实验中医学运用形态学方法的思路 1．形态与功能相结合 2．宏观与微观相结合 3．系统与局部相结合 4．形态技术与其他先进技术相结合