第五章 原位杂交组织化学 (in situ hybridization histochemistry) 刘颖 组织学与胚胎学教研室

第一节 原位杂交组织化学基本原理 变性 变性温度（Tm） 复性 1962, after Rosalind Franklin's death, Watson, Crick, and Wilkins are awarded the Nobel Prize, giving no credit to Franklin for her invaluable work. 共价键 酯键 James Watson and Francis Crick (Cambridge) discover the structure of DNA.

变性温度（melting temperature,Tm） 影响Tm的因素 DNA变性(denaturation) 指DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。 变性温度（melting temperature,Tm） 热变性使DNA分子双链解开所需温度称为熔解温度。 影响Tm的因素 DNA的均一性 DNA分子中的（G+C）含量 溶剂的性质 低离子强度，Tm低 高pH 变性剂甲酰胺 DNA的变性指DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。确切地就是维持双螺旋稳定性的氢键和疏水键的断裂。断裂可以是部分的或全部的，是可逆的或是非可逆的。DNA变性不涉及到其一级结构的改变。凡能破坏双螺旋稳定性的因素都可以成为变性的条件，如加热、极端的pH、有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等,均可破坏双螺旋结构引起核酸分子变性。

复性（renaturation） 复性的影响因素 指变性的DNA(单链)在适当的条件下，两条彼此分开的多核苷酸链又可以重新结合成双螺旋 结构 温度 DNA浓度 DNA片段长度 DNA分子的复杂性 离子强度

第二节 核酸分子杂交 两条互补DNA或RNA单链之间以复性的原理形成双链核酸的过程 影响杂交体稳定性的因素 杂交双链的碱基组成 杂交双链的长度 碱基错配程度 离子强度 变性剂浓度

核酸分子杂交 液相杂交 固相杂交

原位杂交组织化学(ISH) 应用特定标记的已知核酸探针与组织或细胞中待测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合，形成杂交体，杂交后的信号可以在光镜或电镜下进行观察。 可进行细胞内核酸定性、 定位的一种技术。

第三节 核酸分子探针 定义：一种带有标记物的、已知的、仅与靶分子特异反应的分子。 探针的种类 DNA探针 cRNA探针 寡核苷酸探针

DNA探针 最常用的核酸探针，指长度在几百碱基对以上的双链DNA或 单链DNA探针 互补于mRNA的DNA分子，是由逆转录酶催化而产生的 cDNA探针 互补于mRNA的DNA分子，是由逆转录酶催化而产生的 优点：制备方法简便，不易降解，标记方法较成熟 cDNA 探针是目前应用最为广泛的一种探针。 DNA探针（包括cDNA探针）的优点： 　　①这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。 　　②不易降解（相对RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。 　　③DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移，随机引物法等，能用于同位素和非同位素标记。

cRNA探针 以cDNA为模板在体外转录而成的探针 优点 cRNA和mRNA之间形成的杂交体要比cDNA-mRNA杂交体稳定．因此杂交反应后可经受高严格度洗涤。 cRNA-mRNA杂交体不受RNA酶的影响，故杂交后还可用RNA酶处理，以除去未结合的探针。 缺点 制备过程较复杂，需要较高的分子生物学实验条件， cRNA对RNA酶敏感，易被RNA酶破坏，因而在操作过程中需严格防止RNA酶污染。

根据已知的核酸序列，采用DNA合成仪合成一定长度的寡核苷酸片段。 寡核苷酸探针 根据已知的核酸序列，采用DNA合成仪合成一定长度的寡核苷酸片段。 优点： 　　①短的探针比长探针杂交速度快，易穿透组织。 　　②制备简易，可以在短时间内大量制备，序列任定。 　　③在合成中进行标记制成探针。 　　④使用简便，可合成单链探针，避免了用双链DNA探针在杂交中自我复性，提高杂交效率。 　　⑤寡核苷酸探针可以检测小DNA片段，在严格的杂交条件下，可用于检测在序列中单碱基对的错配。 若不知核酸序列，可根据蛋白质的氨基酸顺序推倒出核酸顺序，但要考虑到密码子的兼并性。多用于克隆筛选和点突变分析。 筛选寡核苷酸针的原则 ： 　　①长18～50bp，较长探针杂交时间较长合成量低；较短探针特异性会差些。 　　②碱基成分：G+C含量为40%～60%，超出此范围则会增加非特异杂交。 　　③探针分子内不应存在互补区，否则会出现抑制探针杂交的“发夹”状结构。 　　④避免单一碱基的重复出现（不能多于4个），如-CCCCC-。 　　⑤一旦选定某一序更符合上述标准，最好将序列与核酸库中核酸序列比较，探针序列应与含靶序列的核酸杂交，而与非靶区域的同源性不能超过70%或有连续8个或更多的碱基的同源，否则，该探针不能用。

探针的标记 探针标记物 探针标记方法 放射性同位素 3H 、35S或32P 易掺入，敏感，易检测，时间长，污染 非放射性标记物 稳定，分辨率高，时间短，操作简便，无污染 酶类：HRP,AKP 半抗原：生物素,地高辛，2，4-二硝基苯（DNP） 荧光素：FITC,罗丹明 探针标记方法 半抗原 hapten 能与对应抗体结合出现抗原-抗体反应、又不能单独激发人或动物体产生抗体的抗原。它只有反应原性，不具免疫原性，又称不完全抗原。大多数多糖和所有的类脂都属于半抗原。

根据探针的标记物 是否能直接检测 直接法 间接法

第四节 原位杂交组织化学基本程序 标本制备 杂交前处理 杂交反应 杂交后处理 检测杂交信号

标本制备 取材 固定 切片 固定剂 4％PFA 固定方法 石蜡切片 冰冻切片 培养细胞 硅化载玻片是通过对玻璃表面起化学修饰作用，改变其表面的化学物理特性，使组织切片或细胞牢固的贴于玻璃片上，防止抗原修复过程中由于高温、高压的诸多因素所造成的脱片现象。 玻片经过硅化处理后具有束水性。 简单操作是先配制2％二甲基二氯硅烷（dimethyl dichlorosilane, DMDC）（DMDC 2ml, 三氯乙烷98 mL, 按比例两者充分混匀，静止待气泡消失即可使用)。经过洗净的玻璃片插入2%的DMDC 溶液中，使其均匀地涂上2%DMDC， 40℃烤干，再用锡箔纸包裹，于180－250℃烘烤4h以上，最好过夜。冷却后备用。 也有用2% 氨丙基三乙氧基硅烷(aminopropyltriethoxysilane，APES)丙酮液处理。

杂交前处理 增强组织通透性和核酸探针穿透性 减低背景染色 去污剂处理 Triton X-100处理15min 蛋白酶处理 蛋白酶K ，37℃孵育15~30 min 减低背景染色 酸酐和稀酸处理 0.25%乙酸酐处理10 min 预杂交 不含探针的预杂交液在杂交温度下预先孵育标本1~2h 内源性生物素和酶的抑制 用5%脱脂奶粉缓冲盐液来稀释标记的卵白素以及将标本浸于含2%牛血清白蛋白的缓冲液 对于内源性的AKP和过氧化物酶可通过将标本分别浸于20%乙酸(4℃)中15秒或过碘酸淋洗和用含1%H2O2的蒸馏水或甲醇溶液室温孵育30min加以阻断。

杂交反应 用杂交液孵育组织切片，杂交液中标记的核酸探针在适当的条件下与组织细胞内相应的靶核酸互补结合形成杂交体的过程。 双链DNA探针和靶DNA变性 杂交反应进行时，探针和靶核酸必须是单链。 杂交液 探针 探针长度 50-100bp，最长不宜超过400个碱基。探针短易进入细胞，杂交率高，杂交时间短。 探针浓度 0.5-5.0μg/ml 。 甲酰胺可使Tm降低，可避免因杂交温度过高而引起的组织形态结构的破坏以及标本的脱落。 硫酸葡聚糖能与水结合，提高探针有效浓度。 牛血清白蛋白阻断探针与组织结构成分之间的非特异性结合，以减低背景。 杂交温度和时间 大约在30~60℃之间。一般将杂交时间定为16~20h，或为了方便，将杂交液和标本孵育过夜 双链DNA探针和靶DNA变性 微波高火状态煮30 分钟，自然冷却2-3 分钟。

杂交后处理 杂交后处理主要包括系列不同浓度、不同温度盐溶液的漂洗 一般而言，盐浓度由高到低，而温度由低到高，漂洗10~15min。高浓度的盐可减少探针与组织标本间的静电结合。 漂洗过程中，还必须注意防止切片干燥，因干燥的切片即使用大量溶液漂洗也很难减少非特异性结合。

杂交体检测 是通过一定的方法使杂交反应形成的杂交体成为在显微镜下可识别的产物。 放射性同位素标记探针的检测 非放射性标记探针的检测 32P、125I、35S等放射性同位素均可用来标记探针，利用感光乳胶记录被研究材料中放射性物质分布和定位。 非放射性标记探针的检测 常用非放射性标记物多为半抗原，以半抗原标记探针的原位杂交信号可通过免疫酶组织化学或亲合组织化学技术显示。 非放射性标记系统主要包括三大类：半抗原类、荧光色素类、酶类。其中半抗原类使用最为广泛，商品化选择最多。 半抗原类主要有生物素(biotin)、地高辛、二硝基苯(dinitrophenyl)、雌二醇等，前两者使用最为广泛，且均有商品化试剂盒选用。 半抗原 　　hapten 　　能与对应抗体结合出现抗原-抗体反应、又不能单独激发人或动物体产生抗体的抗原。它只有反应原性，不具免疫原性，又称不完全抗原。大多数多糖和所有的类脂都属于半抗原。 1.生物素系统工作原理是 将生物素化的( d )UTP掺人探针后，加人酶(AP/HRP)联亲和素(avidin/streptavidin)，利用生物素与亲和素之间存在特异亲和力使亲和素与探针结台；而后加入该酶的显色或发光底物显示结果.然而,生物素系统存在一个较大的缺陷，即生物素是一种维生素分子，它普遍存在于各种细胞中,因而在原位杂交时内源性背景大。 地高辛是一种类固醇半抗原化合物，化学名为异羟基洋地黄毒甙，来源于植物毛花洋地黄。自1988年由德国宝灵曼将其开发为非放标记系统。与生物素相比较，它不存在于一般生物体中，因而消除了内源性背景的问题。并且有报导表明，在原位杂交中，地高辛系统标记效率更高，达到每20碱基带有一个地高辛配基，且杂交后又有灵敏的酶免疫检测体系，因而其灵敏度在原位(膜)杂交中10倍于生物素系统。地高辛现已成为使用最广的非放射性标记物，尤其在原位杂交中已基本取代生物素系统，是迄今为止较为完善的一种非放射性标记系统。 2. 荧光色素类 荧光色素类主要包括荧光素、异硫氰酸荧光素、香豆素、德州红等。其工作原理(以荧光素为例)是通过酶促合成将荧光素化的( d )NTP掺人到探针分子中，杂交后直接在荧光显微锛下观察结果。该法简单快捷，但没有放大过程，灵敏度较低，仅适用于检测高拷贝序列；而且荧光强度随着激发光照射时间的增加而衰退。 利用不同荧光色素在激发光下可发出不同颜色的荧光的特征，不同颜色荧光色素标记探针的使用可进行多重原位杂交以同时检测多个基因的表达情况。 荧光探针多用于染色体、培养细胞或冰冻切片标本. 荧光色素既可用于荧光标记，又可作为半抗原标记。用作后者时，其原理与地高辛系统类似，只需将酶联地高辛抗体换为荧光色素抗体即可。此时，其灵敏度高于前者的直接检测法；同时也为多重标记检测增加了一种标记途径. 3. 酶标法 以Amersham Pharmacia公司开发的ECL系统为代表。它是在戊二醛的作用下将辣跟过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)与寡棱苷酸探针片断直接共价相连，此法简化了检测步骤，减少了非特异污染的可能。有研究表明，其灵敏度甚至超过了多重半抗原标记的探针。但酶标法有一个缺点，由于酶是具有生物活性的蛋白质分子，易变性。因而，从标记到杂交以及其后的洗脱整个过程不能采用剧烈的条件：温度不超过42℃，不能使用强酸、强碱及去污剂，离子强度要适中。而以上条件正是除去非特异性杂交的有效手段，因而选择直接酶联法要注意其非特异性背景的问题。 非放射性标记物发展方向为灵敏度高、稳定性好、实验周期短、检测方法简单、安全。 在这些系统中以新的荧光色素类标记物最具潜力。潜力股 光促生物素标记核酸技术: 在强光下，不需酶反应，光敏生物素的光敏基团即可与核酸中的碱基相结合。光敏生物素标记核酸，方法简单，灵敏度也不低，但标记效率不高，每100～150个碱基才能标记一个生物素，对于短的基因探针特别是寡核苷酸探针不宜使用，以免因标记数过少而影响灵敏度

放射性同位素标记探针的检测 非放射性标记探针的检测

对照实验 组织对照 探针对照 杂交反应对照 检测系统对照 Southern/Northern 免疫组织化学 已知阳性组织和已知阴性组织 用有意义链RNA探针 吸收试验 杂交反应对照 空白实验 杂交前用核酸酶预处理标本 检测系统对照 放射自显影检测系统对照 非放射性原位杂交检测系统对照

原位杂交组织化学技术进展 原位PCR技术 荧光原位杂交技术 胚胎原位杂交技术 双重和多重原位杂交技术 原位杂交结合免疫组织化学技术 电镜原位杂交技术 肽核酸原位杂交

原位PCR技术原理 将PCR技术与原位杂交技术结合起来，不改变周围组织的原有位置，直接在组织、细胞或病原体原位研究基因变化的技术。 根据在扩增反应中所用的dNTP或引物是否标记，原位PCR可分为： 直接法原位PCR 间接法原位PCR

原位PCR技术 在标本进行PCR扩增时，标记物掺入到扩增产物中，无需分子杂交。 优点:操作简便、省时. 缺点:特异性较差、扩增效率较低、易出现假阳性，特别是在组织切片上，假阳性信号主要来自标本中受损DNA的修复过程。 固定组织 蛋白酶K消化 PCR扩增 显微镜观察 dNTP--荧光素 或dNTP-地高辛 -生物素 或荧光染料－抗地高辛抗体 －抗生物素抗体

原位PCR技术 固定组织 蛋白酶K消化 PCR扩增 显微镜观察 间接法原位PCR 先将引物、核苷酸及酶等反应物引入细胞内进行扩增，然后用特异性 标记探针与扩增产物进行原位杂交，检测细胞内扩增的DNA产物。 优点:克服由于DNA修复或引物错配引起的非特异性染色问题，使扩 增效率提高，特异性增强. 缺点:操作步骤繁琐，用时长。 固定组织 蛋白酶K消化 PCR扩增 显微镜观察 原位杂交

原位PCR技术 原位逆转录PCR 原理:是将逆转录反应和PCR相结合，在原位检测细胞 内低拷贝mRNA的方法。 分类:直接法和间接法. 步骤:1.用DNA酶处理以破坏组织细胞中的DNA。 2.逆转录 3.扩增 优点：不需从标本中提取mRNA,不会因在核酸的 分离中造成靶序列破坏而致信号丢失。

荧光原位杂交技术(Fluorescent in situ hybridization,FISH) 原理:一种利用荧光信号对原位杂交样本进 行检测的技术。 直接FISH 间接FISH

直接FISH

直接FISH 将已知碱基序列的特异DNA片断作为探针，并标记上不同荧光素，在组织切片、染色体标本上与靶核酸进行DNA-DNA原位杂交，因所形成的杂交体带有荧光素，故可在荧光显微镜下直接观察. 常用的荧光素有异硫氰酸荧光素(FITC)、得克萨斯红(Texas Red)、罗丹明(rhodamin) 等。 简单、快速 信号较弱，敏感性较低。

间接FISH 使用非荧光标记的探针，如生物素或地高辛等标记探针，再通过亲和连接或免疫反应带入各种发光物质来检测杂交体的存在。

间接FISH 地高辛or生物素

Down(21三体)综合征间期细胞中的杂交信号

多色FISH 通过选用多种具有可分辨光谱的荧光染料与不同的探针结合(直接法)，在一个细胞核中可呈现多种颜色标记，同时检测多种染色体异常。

Figure 1. Upright optical slice of an intact embryo in blastoderm stage. Double staining for mRNA and protein. Target mRNAs for in situ probes (sog and sna) and protein stained by primary antibody (anti-Dorsal) are indicated in the figure. DAPI was used to label the nuclei. Note that the expression of sog and sna are located apically in the cytoplasm, while the expression of Dorsal is nuclear. Strong signals from sog nascent transcripts that are located in nuclei can also be seen at this magnification.

各染色体标记的探针池组合 十二色荧光原位杂交技术鉴定食管癌KYSE450细胞系核型

FIBER FISH 将细胞的全部DNA在玻片上制备出高度伸展的染色质DNA纤维，然后用标记不同颜色荧光物质的探针与DNA纤维进行杂交，最后用荧光显微镜观察结果并分析. Metaphase and Interphase FISH  Metaphase FISH is used to map the location of a DNA sequence on a chromosome, using fluorescence microscopy. Metaphase FISH identifies the position of DNA sequences ranging in length from IMAGE clones to YACs. Chimerism and sequence homology can also be established. The location of integrated sequences can be determined via metaphase FISH using probes made from the transfected products in combination with chromosome banding or painting. Two, three and four colour FISH is used to determine clone order. Similarly, the DNA probe sequence can also be visualised within the cell nucleus using interphase FISH. Fibre FISH FISH to DNA fibres with BAC and PAC allows rapid visualisation of the extent of overlaps and gaps in contigs. Small clones can be hybridised against larger YAC clones to confirm clone order over longer distances. Fibre FISH with transfected clones allows the quantitation of integrated sequences and can be used to demonstrate the final integrity of the construct.

胚胎原位杂交技术 全胚胎原位杂交 从整体水平反映胚胎发育过程中基因表达的时空顺序, 是一种广泛应用于胚胎发育调控基因表达研究的技术。 胚胎组织切片原位杂交 A：小鼠10.5 dpc胚胎ERβ反义RNA探针的杂交： RE(菱脑), MA(颌弓), PC(心包), SNT(脊神经管), GR(生殖脊), LB(肢芽); B：小鼠10.5 dpc胚胎ERb 有意义链RNA探针的杂交; C: 13.5 dpc胚胎ERb 反义RNA探针的杂交结 果:TE(端脑), ME(中脑), MO(延髓), SC(脊髓), LB(肢芽)： D：小鼠13.5 dpc胚胎ERb 有意义链RNA探针的杂交。

原位杂交结合免疫组织化学

电镜原位杂交

肽核酸(peptide nucleic acids，PNA)原位杂交 肽核酸是一类人工合成的电中性的肽链, 以多聚酰胺键形成的类似核苷酸的物质。 具有一个拟肽骨架，没有磷酸戊糖骨架. PNA链更容易和带有负电荷的互补序列的DNA或RNA链结合. PNA对互补DNA的错配容忍程度比相应的DNA/DNA更低. PNA不被目前已知的任何核酸酶或蛋白酶所降解。  肽核酸(PNA, peptide nucleic acid)是一种全新的DNA类似物，于1991年由Dr.Nielsen, Dr.Egholm,Dr.Berg,和Dr.Buchardt发明。

LNA(Locked Nucleic Acid) 是一种核酸类似物，和普通核酸分子区别在于在其碳环的2’氧原子和4’碳原子位置引入亚甲基桥形成锁状结构，因此也称锁核酸。 探针中每融合一个LNA能够使Tm值升高2-10度 Tm值升高说明增加了杂交体的稳定性

LNA的优势 增强热稳定性、杂交的特异性、提高探针TM值、增加亲和性 LNA的应用 LNA技术目前已经广泛应用于分子生物学各个领域，如：芯片、原位杂交等等

A long way to go!!

M-FISH and CGH Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization (M-FISH) and Comparative Genomic Hybridization (CGH) are complementary fluorescent molecular cytogenetic techniques. M-FISH acquires images of each human or mouse chromosome in a different color, allowing semi-automatic karytyping and the identification of chromosomal aberrations.

The complimentary technique of CGH visualises the hybridization of differentially labeled reference DNA sequences to generate a high resolution map of DNA copy number changes in the genome. We can further investigate copy number variation using the Affymetrix GeneChip Cytogenetics Array system.                                       In addition we carry routine classical cytogenetics techniques like Giesma DNA staining for chromosome banding image acquistion and semi-automatic human chromosome karyoyping.