多肽的化学合成.

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多肽的化学合成

多肽的化学合成 多肽的化学合成,是按照设计的氨基酸顺序,通过定向形成酰胺键方法得到目标多肽分子; 氨基酸之间形成酰胺键的反应相当复杂; 要成功的合成具有特定氨基酸顺序的多肽,必须采用定向形成酰胺键方法,即对暂时不参予形成酰胺键的氨基和羧基,以及侧链活性基团进行保护。同时还要对羧基进行活化。

(一)氨基酸常用的保护方法

多肽合成必须解决下面四个问题 1.氨基保护 2. 羧基保护 3. 侧链保护 4. 接肽方法 保护基必须具备的条件 1.氨基保护 2. 羧基保护 3. 侧链保护 4. 接肽方法 保护基必须具备的条件 易在预定的部位引入,在接肽时能起保护作用; 在某特定的条件下,保护基很易除去; 引入和除去保护基时,分子中的其它部位 不会受到影响,特别是已接好的肽键。

1、氨基的保护 常用氨基保护基的方法:酰化 最广泛应用的氨基保护基(PG)是叔丁氧甲酰基(t-Boc) 三苯甲基、对甲苯磺酰基、芴甲氧羰基(Fmoc),可用HBr/CH3COOH在室温下除去; 苄氧酰基(CBz),通过催化加氢或用金属钠在液氨中处理除去;

(1)用芴甲氧羰基保护 N’-芴甲氧羰基(Fmoc)基团作为保护基的优点: Fmoc基团可被碱脱除 对酸稳定,用三氯乙酸较强酸处理不受影响; 仅用温和的碱处理,通过β-消除反应即可脱去,不需要三级胺中和; Fmoc基团有特征性的紫外吸收,易于监测反应的进行,给使用仪器自动化合成多肽带来许多方便。

(2)用叔丁氧羰基保护 t-Boc是常用的氨基保护基。 t-Butoxycarbonyl 简写BOC

在多肽中的应用 CF3COOH -OH, 25oC 上保护基 接肽(过程略) 去保护基

Benzoxycarbonyl(简写Z) (3)用苄氧酰基(或称苯甲氧基甲酰氯)保护 C6H5CH2OH+COCl2(光气) Benzoxycarbonyl(简写Z) Z在弱酸性条件下比较稳定,但在催化氢解条件下容易被除去。产物也容易分离。

反应过程 返回 +NH3CH2CO2- (1mol) 上保护基 接肽 去保护基 H2 Pd/C OH- H+ SOCl2 +NH3CH2CO2-, OH- (1mol) 上保护基 接肽 去保护基 返回

2、羧基的保护 与氨基保护基比较,羧基保护基种类较少; 一般以盐或酯的形式加以保护; 常用的有钾盐、钠盐、三乙胺盐等; 常用的酯类有:甲酯和乙酯、苄酯 、叔丁酯; 叔丁酯是近年来最常用的羧基保护基。 返回

3、侧链的保护 返回 氨基酸 保护基团 功能性基团 Ala(A) None —— Arg(R) Pbf, Mtr, Pmc 胍基Guanidine N Asn(N) Trt, Mebh, Tmob 酰胺amide Asp(D) OtBu, OAI° 羧基carboxyl Cys(C) Trt, Acm°,tBu°,Stbu 疏基sulfhydryl Gln(Q) Trt, Mbh, Tmob Glu(E) Gly(G) His(H) Trt, Boc 咪唑imidazole Ile(I) Leu(L) Lys(K) Boc, Aloco,Fmoc° 氨基amino Met(M) Orn(O) Boc Phe(F) Pro(P) Ser(S) tBu 羟基hydroxyl Thr(T) Trp(W) 吲哚indole Tyr(Y) 苯基phenol Val(V) none 返回

实例:巯基的保护 巯基经常用苄基和对甲氧苄基,如下式苯甲基保护 上保护基 空气中氧化 去保护基 保护基可以在钠、液氨作用下除去。 Na, NH3(l) 保护基可以在钠、液氨作用下除去。

(二)肽键的形成方法 具有游离氨基的组分称为氨基组分,具有游离羧基的组分称为羧基组分。 肽键生成的原理是:将N-保护氨基酸或肽的羧基转化成活化型的RCOX,使得羰基碳原子带有较强的正电性而有利于氨基组分对它进行亲核反应生成肽键。 RCOOH—— RCO-X ——— RCONHR’+HX R’-NH2

1、羧基活化法 羧基的羟基不是一个好离去的基团; 羧基本身不是一个最好的酰基化剂; 羧基的活化是将羧基转变成一个活泼的羧基衍生物,提高羧基的酰化能力。 叠氮法、混合酸酐法和活化脂法均是温和的方法,已经被广泛应用于肽的合成

(1)酰氯法 最早使用的方法; 氨基酸的酰氯容易与氨基作用形成肽键; 由于反应过程中容易引起氨基酸消旋化,实际应用价值小。

(2)混合酸酐法 氨基酸的羧基可以转化成酸酐; 酸酐有两个亲电中心,在形成肽键时能够产生几乎等量的副产物,应用不对称酸酐可以克服此缺点; 氨基被保护的氨基酸在低温且有叔胺的存在下与氯甲酸乙酯生产成混合酸酐能与另一个氨基酸脂缩合成肽 在无水溶剂中可以减小消旋,保持很低的水平。

Z-氨基酸的三乙胺盐和氯代甲酸酯反应生成混合酸酐 -OH, 25oC N(C2H5)3 -5-0oC -(C2H5)3N•HCl H2/Pd-C 接肽 C6H5CH2OCOCl

(3)活化酯法 普通的氨基酸烷基酯就可以酰化另一氨基酸的氨基; 氨基被保护的氨基酸对硝基苯脂能与另一氨基酸的氨基缩合成肽,此法作用温和、产率较高; 但如不够活泼时,可以在酯基内加入强吸电子基因,以增加羧基的亲电能力,使更容易形成酰胺键。

实例:对硝基苯酯,就是一个更为活泼的酯基 N(C2H5) 3 H+

(4) 叠氮法 氨基酸酯与肼作用生成酰肼,酰肼与亚硝酸作用则生成叠氮化合物,这个叠氮化合物与另一氨基酸酯作用即能缩合成二肽。此法可称为叠氮法; 用此法合成的肽能保持光学纯度。

2、偶联剂缩合法 偶联剂本身是一种脱水剂,能够促进羧基和氨基之间的缩合反应 缩合剂可以直接与一个羧基被保护的氨基酸和一个氨基被保护的氨基酸一起反应;

N,N’ -二环己基碳二亚胺 dicyclohexylcarbodimide (DCC) 接肽 H2 / Pd-C 去保护基 反应中产生的二环已脲(DCU),不溶于大多数有机溶剂,容易与产物分离。

3、脱保护基 脱保护基的方法形形色色,其重要性不亚于多肽的合成。 三氟乙酸(TFA)是最常用的脱保护基试剂,可以脱除一些不耐酸的保护基如Boc、tBu等。 TFA法比较温和,副反应少,因此得到越来越多的应用。 不足是用量比较大。

(三)多肽的固相合成 液相合成法 固相合成法

液相合成法 可以分为逐步延长法(stepwise elongation)和片段缩合法(fragment condensation)。 前者常用于合成小肽,后者用于合成比较长的肽链。其中的片段缩合法可以分为大片段缩合法、较大片段缩合法和较小片段缩合法三种。 液相合成法最经典的例子是牛胰RNaseA的合成。

Solid phase peptide synthesis 多肽的固相合成法 Solid phase peptide synthesis 以往的多肽合成是在溶液中进行的; 自从1962年麦瑞菲尔德-Merrifield发展新的固相多肽合成方法以来,经过不断的改进和完善,到今天固相法已成为多肽和蛋白质合成中的一个常用技术,表现出了经典液相合成法无法比拟的优点。 固相合成法的特点是不必纯化中间产物,合成过程可以连续进行,已经发展成为多肽自动合成仪。

固相合成法的基本原理 先将所要合成目标肽链的C-末端氨基酸的羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连; 然后以这个氨基酸的氨基作为起点,与;另一分子氨基酸的羧基作用(用DCC做偶联剂)形成肽键; 重复(缩合→洗涤→去保护→中和和洗涤→下一轮缩合)操作,达到所要合成的肽链长度,最后将肽链从树脂上裂解下来,经过纯化等处理,即得到目标的多肽。

树脂的选择 将固相合成与其他技术分开来的最主要的特征是固相载体,能用于多肽合成的固相载体必须满足如下要求: 必须包含反应位点(或反应基团); 必须对合成过程中的物理和化学条件稳定; 允许在不断增长的肽链和试剂之间快速、不受阻碍的接触; 提供足够的连接点,以使每单位体积的载体给出有用产量的肽,并且必须尽量减少被载体束缚的肽链之间的相互作用。

固相法合成多肽的高分子载体 主要有三类: 聚苯乙烯-苯二乙烯交联树脂 聚丙烯酰胺 聚乙烯-乙二醇类树脂及衍生物

聚苯乙烯树脂

固相法合成多肽的高分子载体作用 这些树脂只有导入反应基团,才能直接连上第一个氨基酸; 根据所导入反应基团的不同,又把这些树脂及树脂衍生物分为氯甲基树脂、羧基树脂、氨基树脂; 氨基酸的固定主要是通过保护氨基酸的羧基同树脂的反应基团之间形成的共价键来实现的。

高分子载体共价键形成的方法 氯甲基树脂:通常先制得保护氨基酸的四甲铵盐或钠盐、钾盐、铯盐,然后在适当温度下,直接同树脂反应或在合适的有机溶剂如DMF或DMSO中反应; 羧基树脂,通常加入适当的缩合剂如DCC或羧基二咪唑,使被保护氨基酸与树脂形成共酯以完成氨基酸的固定; 氨基树脂或酰肼型树脂,加入适当的缩合剂如DCC后,通过保护氨基酸与树脂之间形成的酰胺键来完成氨基酸的固定。

固相合成法的类型 在固相合成绝大多数常用二氯甲烷为溶剂; a-氨基用Boc(叔丁氧羰基)保护的称为Boc固相合成法, a-氨基用Fmoc(芴甲氧羰基)保护的称为Fmoc固相合成法。

丁氧羰基(Boc)固相合成法 侧链保护基采用苄醇类; 常用树脂为氯甲基化聚苯乙烯树脂或羟甲基化聚苯乙烯树脂或对乙酰基苄脂树脂; Boc保护α-氨基的氨基酸衍生物共价交联到树脂上,用TFA脱除Boc,三乙胺中和游离的氨基末端 再偶联下一个氨基酸,……。 缺点:反复用酸脱除保护基,然后用氟化氢把肽段从树脂上裂解下来,不可避免地会引起或多或少的副反应;某些侧链保护基的不稳定,已经延长的肽链从固相支持物上的逐步损失,还有天冬氨酸、谷氨酸残基的侧链变化……

丁氧羰基(Boc)固相合成法

Fmoc固相合成法 C末端氨基酸与树脂结合 Na-Fmoc的脱除、洗涤 偶联、洗涤 重复(2)~(3)步 脱保护基

裂解及合成肽链的纯化 Boc法用TFA+HF裂解和脱侧链保护基,Fmoc法直接用TFA,有时根据条件不同,其它碱、光解、氟离子和氢解等脱保护方法也被采用。合成肽链进一步的精制、分离与纯化通常采用高效液相色谱、亲和层析、毛细管电泳等。

固相合成法对于肽合成的显著的优点 简化并加速了多步骤的合成; 因反应在一简单反应器皿中便可进行,可避免因手工操作和物料重复转移而产生的损失; 固相载体共价相联的肽链处于适宜的物理状态,可通过快速的抽滤、洗涤未完成中间产物的纯化,避免了液相肽合成中冗长的重结晶步骤,可避免中间体分离纯化时大量的损失; 固相载体上肽链和轻度交联的聚合链紧密相混,彼此产生一种相互的溶剂效应,这对肽自聚集热力学不利而对反应适宜。

固相合成存在的主要问题 固相合成的主要存在问题是固相载体上中间体杂肽无法分离,这样造成最终产物的纯度不如液相合成物; 必需通过可靠的分离手段纯化。

可溶性的问题 许多合成的肽粗品,尤其是那些经过几次沉淀和干燥的,在标准的HPLC溶剂中十分难溶,原因为: 含有大量的疏水性残基,它们会象油一样紧密的拥成一簇,以减少与水的接触并增大  分子之间的疏水性作用。  非特异性的聚集。 含有Cys的肽中形成二硫键。  二级结构的形成,特别是较长的分子。 活性侧链(包括各种类型的氢键、盐桥等)之间的特异性相互作用

肽的溶解 对于含有芳香或者烃侧链的氨基酸(Val、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Ala),加入DMF至50%溶解;或者加入最少量的DMF,然后用缓冲液稀释即可。但应当注意有机溶剂对于后续试验的影响。   如果含有较多的碱性氨基酸,可以用醋酸的水溶液(1-10%)进行溶解。 如果含有酸性的氨基酸,可以用挥发性的碱性缓冲液(pH可以达到8)如乙酸乙脂吗啉或重碳酸盐等溶解。 如果序列比较长,有可能溶解于盐溶液。高浓度的离液盐,如盐酸胍或脲等可以通过破坏其二级结构而帮助其溶解。 对于中等大小的分子,丙醇可以加速溶解。 少量的TFA可以帮助溶解聚集物 可以加入去垢剂如SDS进行处理,但是需要注意的是含有聚醚的去垢剂可能会产生过氧化物从而损害某些肽。可从公司订购非过氧化去污剂。

多肽的保存 大多数多肽可以保存在-20℃,特别是冷冻干燥并保存在干燥器中,能够在-20℃的条件下保存两年而没有问题。在将它们暴露于空气之前, 冷冻的多肽和容器应当至少在室温中放置30 min以上时间,然后取用。 这将避免多肽样品吸收潮气。当无法冷冻干燥时,最好的方法是以小的工作样量存放。 对于含Cys, Met 或 Trp的多肽,很容易受到空气中的氧气和溶解试剂的氧的影响而氧化。因此,避免此类多肽和氧接触是很重要的。对其溶解时脱氧缓冲溶剂是必不可少的,在封瓶前,慢慢流过多肽的氮气或氩气也会降低氧化作用。

知识延伸 多肽合成仪 1996年,Merrifield等报道了最初的多肽合成仪,由5部分组成: 氨基酸溶液和选择阀 洗涤溶液、脱保护试剂、中和试剂 反应容器和振动装置 送液、加压装置 废液装置

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