第十三章 DNA的生物合成 第一节 DNA复制的概况 第二节 原核生物DNA的复制 第三节 真核生物DNA的复制 第四节 逆转录作用

DNA的生物合成： RNA的生物合成： 蛋白质合成：以mRNA为模板合成 以DNA为模版的，即DNA复制； 以RNA为模版，即RNA复制； 蛋白质合成：以mRNA为模板合成

第一节 DNA复制的概况 一、DNA复制的概况 三、真核生物的DNA复制 （一）DNA复制的通则 （二）DNA复制的起始与复制方式

（一）DNA复制通则 1 DNA合成的模板－－亲代DNA 作为信息分子，DNA的合成必需在模板的指导下完成。 DNA是遗传信息的载体，在合成DNA时决定其结构特异性的遗传信息只能来自其本身，因此必需由原来存在的分子为模板来合成新的分子，称为自我复制（self-replication），即DNA指导的DNA合成。

2 碱基配对是模板DNA信息传递的基础 Watson－Crick提出的DNA双螺旋复制模型。模板链通过严格的碱基配对原则指导子代DNA的合成，该原则由DNA指导的DNA聚合酶执行，新合成的子链与模板链反向平行互补。

3 DNA的复制是半保留的 1958年 Meselson和 Stahl DNA以亲代DNA链为模板，复制时模板双链解开形成单链，按照单链DNA的核苷酸顺序，严格按照碱基配对的原则合成新链，新合成的DNA分子与原DNA分子碱基顺序完全相同，每条子代DNA的一条链来自亲代，一条是重新合成的，这种复制方式称为半保留复制。 1958年 Meselson和 Stahl

4 DNA复制为双链复制型 DNA由两条DNA链盘绕形成，每条单链都含有其互补链所必需的全部遗传信息，故每条单链均可以作为模板。

（二）DNA复制的起始与复制方式

2.1 复制子与复制起点 复制子(replicon):基因能够独立进行复制的单位称为复制子。每个复制子都含有固定的起点。 原核生物DNA和质粒以及真核生物细胞器DNA均为环状DNA，通常都为一个复制子，只有一个复制起点；真核生物DNA含有多个复制子，因而具有多个复制起点。 复制在起始阶段进行控制，一旦复制开始，它即继续下去，直到整个复制完成或复制受阻。

2.2 复制方向与复制叉(replication fork) 对于环状DNA分子，复制从固定的起始点开始，通常向两个方向进行复制，且大多数情况下复制是对称的。

2.3 复制方式 直线双向（单个起始点，双向复制） 直线单向 （多个起始点，单向复制） θ复制（固定起始点，单向或双向对称复制） 滚环复制（单个起始点，单向不对称复制） D环复制 值得注意的是，无论那种方式，都是双链复制（RF型

θ复制 环形染色体复制时形成θ的结构，两条链同时复制。

二、原核生物DNA复制 （一）参与原核生物DNA复制的酶和蛋白质 1.DNA聚合酶 DNA复制过程中最基本的酶促反应是4种脱氧核苷酸的聚合反应。 1956年,从大肠杆菌中分离出催化该反应的DNA聚合酶，即DNA聚合酶I(DNA polyerase I,pol I)。

从分子组成上看，DNA分子是由核苷酸通过3’，5’磷酸二酯键连接而形成的多聚核苷酸，因而核酸的生物合成从化学角度看是核苷酸的聚合过程。 5´ 3´ 从分子组成上看，DNA分子是由核苷酸通过3’，5’磷酸二酯键连接而形成的多聚核苷酸，因而核酸的生物合成从化学角度看是核苷酸的聚合过程。 在大肠杆菌中DNA聚合酶负责核酸链的延伸。

1. DNA聚合反应及DNA聚合酶 DNA聚合酶的特点 大肠杆菌DNA聚合酶的特点 以四种dNTP作为底物，反应需要Mg2＋存在

dNTP是DNA链聚合的原料 该反应由DNA聚合酶催化，核酸的构建分子为dNMP，而其底物为dNTP，可将dNTP理解为dNMP的活化形式。

需要引物,引物为RNA 所谓引物就是指和模板链互补的一线性片段，其上带有能与核苷三磷酸相结合的游离3’羟基，称为3’羟基末端或引物末端，核酸链由此延伸。

以四种dNTP作为底物，反应需要Mg2＋存在 需要模板 需要引物 具有5’ 3’方向的聚合能力，其活性中心对碱基配对具有严格选择性 可以使得碱基错配率减小至（1/104－105）

DNA合成总是沿着5’3’的方向进行

DNA的延伸：单一的DNA链作为模板，引物链必需具有3’羟基末端，在此处一个新的核苷酸单元被加入。每个被增加的核苷酸部分通过碱基配对被模板上合适的核苷酸选择，反应产物具有新的游离的3’羟基末端，允许另一个核苷酸加入。

大肠杆菌DNA聚合酶的特点 以四种dNTP作为底物，反应需要Mg2＋存在 需要模板 需要引物 具有5’ 3’方向的聚合能力，其活性中心对碱基配对具有严格选择性 具有3’ 5’外切酶活性，有纠正作用 可以使得碱基错配率减小至（1/104－105） 可使得DNA复制的精确性提高102－103倍

DNA聚合酶Ⅰ的外切核酸酶活性校正

在聚合酶继续前进之前，胞嘧啶经历由C*到C的互变异构转变，新的核苷酸被错配 是胞嘧啶C的罕见的互变异构型，与A配对，被掺入生长链 在生长链错配的3‘-OH端阻碍链的延伸。DNA聚合酶后滑，3’-5’外切酶活性部位滑到错配碱基位置 错配的核苷酸被去除 DNA聚合酶继续向前滑动，恢复聚合活性

大肠杆菌DNA聚合酶的特点 以四种dNTP作为底物，反应需要Mg2＋存在 需要模板 需要引物 具有5’-3’方向的聚合能力，其活性中心对碱基配对具有严格选择性 具有3’-5’外切酶活性，有纠正作用 具有5’-3’外切酶的活性 ，可用于切除引物

大肠杆菌DNA聚合酶的种类 DNA聚合酶Ⅰ： DNA聚合酶Ⅱ： DNA聚合酶Ⅲ：

大肠杆菌DNA聚合酶的比较 DNA聚合酶的类型 Ⅰ Ⅱ Ⅲ 结构基因 polA polB polC 亚基数 相对分子量 3′–5′外切酶活性 1 ≥7 ≥10 相对分子量 103 88 830 3′–5′外切酶活性 有 5′–3′外切酶活性 无 聚合速度（核苷酸/S） 16～20 40 250～1000 连续聚合能力（核苷酸） 3～200 1500 ≥500 000

DNA聚合酶的分工 DNA聚合酶Ⅰ：切除RNA引物或有损伤的DNA片段，并用正确的DNA片段填补 DNA聚合酶Ⅱ：主要参与DNA的损伤修复 DNA聚合酶Ⅲ：主要的复制酶，负责DNA链的延伸

Ⅲ DNA聚合酶Ⅲ的聚合作用

DNA聚合酶Ⅲ的结构

DNA链延长的半不连续性 DNA聚合酶Ⅲ的异二聚体结构保证了DNA复制过程中两条模板链复制的同步性。 前导链（leading strand）：复制时，DNA的一条链按与复制叉移动一致的方向，沿5’3'方向连续合成。 后随链（lagging strand）：另一条链是在已经形成一段单链区后，先按与复制叉移动的相反的方向，沿5’3'方向合成冈崎片段，再通过连接酶将冈崎片段连在一起构成完整的链。

DNA聚合酶Ⅲ的异二聚体结构保证了DNA复制过程中两条模板链复制的同步性。

Ⅳ DNA聚合酶Ⅰ负责切除引物

后随链中的RNA引物被DNA聚合酶Ⅰ的5’-3’外切核酸酶活性切除，并通过同样的酶催化合成DNA取而代之。

Ⅴ 连接酶负责封闭切口 与模板配对的一段DNA或RNA可同时被DNA聚合酶Ⅰ上的5’-3’外切酶降解和替换。酶的这些活性对复制过程中的DNA修复和RNA引物的去处均有作用，DNA链平移切口被连接酶封闭。

2. 参与原核DNA复制的其他酶和蛋白质 解旋酶:使双螺旋DNA解链 引物酶:合成RNA引物 单链结合蛋白（SSB）:稳定单链区 DNA连接酶:连接DNA片段末端 DNA旋转酶（DNA拓扑异构酶）:引入或松解超螺旋

DNA聚合酶Ⅲ（含Mg离子）：负责DNA链的延伸 DNA聚合酶Ⅰ：切除引物并填满缺口 DNA连接酶：连接DNA片段末端 单链结合蛋白（SSB）：稳定单链区 引物合成酶：合成RNA引物 DNA聚合酶Ⅲ（含Mg离子）：负责DNA链的延伸 DNA聚合酶Ⅰ：切除引物并填满缺口 DNA连接酶：连接DNA片段末端

DNA旋转酶与DNA解旋酶共同作用使DNA双链解旋 第一步： 复制的起始 DNA旋转酶与DNA解旋酶共同作用使DNA双链解旋

原核生物DNA的合成 第一步： 复制的起始 第二步：DNA链的延长

原核生物DNA的合成 第一步： 复制的起始 第二步：DNA链的延长 第三步：DNA合成的终止

DNA复制完成后两个子代分子以连环体的形式存在，需要拓扑酶切开。

DNA复制视频

第三节 真核生物DNA的复制

真核DNA的合成的基本过程类似于原核DNA，不同之处： 多复制起点 至少有五种聚合酶αβγδε 端粒的复制依赖于端粒酶 α β γ δ ε 亚基数 4 2 5 分子量（KD) ＞250 36-38 160-300 170 256 细胞内定位 核 线粒体 5′→3′聚合活性 ＋ 3′→5′外切活性 － －  功能 复制、引发 修复 复制

原核生物与真核生物DNA复制的差异 原核生物 真核生物 复制起点 单个 多个 复制叉的移动速度 900 nt/s 50 nt/s 冈崎片段的大小 1000-2000 nt 100-200 nt 引物酶 有 由DNA pol α的两个小亚基承担 复制周期 可重叠 不可重叠 末端缩短 不存在 存在 （端粒酶）

第四节 逆转录作用

逆转录作用 催化逆转录过程的酶为逆转录酶（RT）。 以RNA为模板合成DNA，与转录过程中遗传信息从DNA到RNA的方向相反，称为逆转录（reverse transcription）。 催化逆转录过程的酶为逆转录酶（RT）。

逆转录酶在分子生物学中的应用 cDNA的合成： 以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链(complementary DNA,cDNA)。 分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。

第五节 DNA的损伤与修复

DNA损伤与突变 损伤可造成突变或致死 突变（mutation）：指一种遗传状态，可以通过复制而遗传的DNA结构的任何永久性改变。携带突变基因的生物称为突变体，未突变的称为野生型。 损伤原因 物理（紫外、高能射线、电离辐射） 化学（烷基化试剂、亚硝酸盐、碱基类似物） 生物因素（碱基对置换、碱基的插入/ 缺失造成移码）

突变与损伤： 遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变，均可称为突变。 从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改变。 在复制过程中发生的DNA突变称为DNA损伤(DNA damage)。

DNA的修复系统 一、直接修复 二、切除修复 三、重组修复 四、应急反应（SOS）和易错修复

一、直接修复（光修复）

光复活（photoreactivation） 可见光（最有效波长400nm）激活生物界广泛分布（高等哺乳动物除外）的光复活酶，该酶分解嘧啶二聚体。 是一种高度专一的修复形式，只分解由于UV照射而形成的嘧啶二聚体。

当DNA受到大剂量紫外线（波长260nm附近）照射时，可引起DNA链上相邻的两个嘧啶碱基共价聚合，形成二聚体，例如TT二聚体。

二、切除修复

切除修复（excision repair） 即在一系列酶的作用下，将DNA分子中受损伤的部分切除掉，并以完整的那一段为模板，合成出切去的部分，从而使DNA恢复正常。这是一种比较普遍的修复机制。

三、重组修复

重组修复（recombination repair） 又称复制后修复（postreplication repair） 受损伤的DNA在进行复制时，跳过损伤部位，在子代DNA链与损伤相对应部位出现缺口。通过分子间重组，从完整的母链上将相应的碱基顺序片段移至子链的缺口处，然后再用合成的多核苷酸来补上母链的空缺，此过程即重组修复。

四、SOS修复 指DNA受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种DNA修复方式，修复结果只是能维持基因组的完整性，提高细胞的生成率，但留下的错误较多，又称倾错性修复（Error-Prone Repair ）。

DNA重组和克隆 DNA重组： 同源重组（homologous recombination）： 位点特异性重组（site-specific recombination）： 将两个短的DNA特定序列（即特异位点）之间的基因从染色体上切除或组合到染色体另一个特定位点。

基因克隆的基本步骤

PCR的原理与流程 PCR即聚合酶链式反应，也称体外酶促基因扩增，原理类似天然DNA复制。 其原理为：靶DNA分子变性后解链，两条单链DNA分别与两条引物互补结合，在4种dNTP存在和合适的条件下，由耐热的Taq DNA聚合酶催化引物由5’－3’扩增延伸，形成两条新的双链DNA分子，并作为下一循环的模板。 每经过一个变性、复性、延伸循环，模板DNA增加一倍。 经过30～50个循环，可使原DNA量增加106～109倍。

PCR的主要步骤： • 模板DNA的变性：一般选用95℃左右1 min，使DNA双链解为单链； • 循环数：按初始模板浓度确定，一般25－45之间。

基因克隆中的工具酶： 限制性内切酶：能识别DNA特定核苷酸序列的核酸内切酶 分布：主要在微生物中。 特点：特异性，即识别特定核苷酸序列，切割特定切点。 结果：产生黏性未端（碱基互补配对）。 一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切割点上将DNA 分子切断。目前已发现的限制酶有400～500多种。

基因克隆中的载体： 载体种类：质粒、噬菌体和动植物病毒。 质粒的特点: 细胞染色体外能自主复制的小型环状DNA分子； 质粒是基因工程中最常用的运载体； 最常用的质粒是大肠杆菌的质粒； 存在于许多细菌及酵母菌等生物中； 质粒的存在对宿主细胞无影响； 质粒的复制只能在宿主细胞内完成。

内容小结 一、DNA复制是半保留复制、半不连续复制 二、原核生物DNA的复制的特点是1.原核只有一个起始位点。2.原核复制起始位点可以连续开始新的复制，特别是快速繁殖的细胞。3.原核的DNA聚合酶III复制时形成二聚体复合物。4.原核的DNA聚合酶I具有5'-3'外切酶活性。 三、真核DNA的合成的基本过程类似于原核DNA，不同点为1.多复制起点 2.至少有五种聚合酶αβγ 3.端粒的复制依赖于端粒酶 四、逆转录酶及其在分子生物学中的作用 五、DNA的损伤是由DNA突变所造成的，修复包括直接修复、切除修复、重组修复与启动紧急反应修复（SOS） 六、DNA重组包括同源重组和位点特异型重组；DNA克隆的PCR技术包括变性、复性及延伸多个循环。

参考书目 生物化学原理.杨荣武主编，北京:高等教育出版社出版，2012. 生物化学简明教程（第四版）.罗纪盛等主编，北京:高等教育出版社出版,2009. 生物化学（第三版）.王镜岩、朱圣庚等主编，北京:高等教育出版社. 2002. 生物化学.张部昌主编，合肥：安徽教育出版社，2010. 基础生物化学.陈惠主编，北京:中国农业出版社，2014. Nelson D L, lehninger Principles of Biochemistry. 4th ed. New York: W. H. Freeman,2004.