第十一章 蛋白质的生物合成 主讲人：陶芳 副教授

本章主要内容 第一节 遗传密码 第二节 蛋白质的生物合成 第三节 蛋白质翻译后的加工　　　

第一节 遗传密码 1944年，Avery 的肺炎双球菌试验证明DNA是遗传物质。 第一节 遗传密码 1944年，Avery 的肺炎双球菌试验证明DNA是遗传物质。 1953年，Watson and Crick提出DNA双螺旋结构。 1954年，Gamov 首先对遗传密码进行探讨。 1961年，Brenner等将遗传密码定位于mRNA。 1961年，Nirenberg 和Matthaei 开始时用人工合成的mRNA在无细胞蛋白质合成系统（Cell-Free Polypeptide Synthesis）中寻找氨基酸与三联体密码子的对应关系。

The Genetic Code Was Cracked Using Artificial mRNA Templates Nirenberg的三核苷酸技术（Triplet Binding Assay）和Khorana的重复顺序技术（Repeating Copolymers），终于在1966年将遗传密码完全破译。二人共同获得1968年的诺贝尔奖。

实验1 无细胞蛋白质合成系统的制备 1961年Nirenberg等 实验1 无细胞蛋白质合成系统的制备 1961年Nirenberg等 (1) E.coli温和破碎，离心留上清（DNA、mRNA、tRNA、核糖体、氨酰-tRNA合成酶及蛋白质合成必要的其他各因子）。 (2) 37℃保温，能合成蛋白质，但一段时间后，内源性mRNA被降解，合成停止。 (3) 补充外源mRNA以及ATP、GTP、氨基酸*等，则继续合成。 上述上清液中不存在完整细胞结构，但能合成蛋白质，所以称为无细胞蛋白质合成系统，即无细胞系统（cell free system）。

实验2 制备多聚尿（胞、腺）苷酸 Nirenberg等 以UDP、CDP和ADP为底物，在多核苷酸磷酸化酶的催化下，分别合成多聚尿苷酸（poly U）、多聚胞苷酸（ poly C） 、和多聚腺苷酸（ poly A）。 UDP → UUUUUU poly U CDP → CCCCCC poly C ADP → AAAAAA poly A *Poly G易形成多股螺旋，不宜作为mRNA

实验3 破译Phe、Pro和Lys的密码子 Nirenberg等 无细胞系统 + GTP ATP Phe + Pro Lys … Poly U + Poly C Poly A Phe-Phe- Pro-Pro- Lys-Lys- Mg2+

实验4 随机三联体的合成 Nirenberg等进一步利用两种核苷酸合成共聚物，如U和G，组成8种不同的三联体，如下表（各三联体在共聚物中出现的频率不一样）。 无序poly UG对氨基酸的密码（U:G=5:1） 可能的密码子 相对频率% 氨基酸的相对量 UUU UUG UGU GUU UGG GUG GGU GGG 100 20 4 0.8 Phe(100) Cys(20) Val(20) Gly(4) Trp(5) - *此方法可以确定20种氨基酸的碱基组成，但不知道它们的排列顺序。

实验5 核糖体结合技术 1964年Nirenberg等 实验5 核糖体结合技术 1964年Nirenberg等 人工合成三核苷酸取代mRNA，无GTP时不能合成蛋白质，但三核苷酸能与其对应的氨酰- tRNA一起结合在核糖体上，将此反应混合物通过硝酸纤维素滤膜时，三联体+氨酰-tRNA+核糖体形成的复合物留在膜上。

核糖体-tRNALeu + tRNAVal + tRNACys 核糖体结合技术 + 核糖体 UUG tRNALeu + tRNAVal tRNACys 温育 核糖体-tRNALeu + tRNAVal + tRNACys 硝酸纤维素滤膜 tRNAVal + tRNACys *证明UUG编码Leu

实验6 Poly（UG）和 Poly（UAC）的合成 1964，Khorana将化学方法与酶法结合，合成含有重复序列的多聚核苷酸． Poly（UAC） Poly（UG） 5’ …UACUACUACUACUACUAC …3’ + 无细胞系统 各种氨基酸 GTP ATP -Cys-Val-Cys-Val 5’ …UGUGUGUGUGUG …3’ + 无细胞系统 各种氨基酸 GTP ATP -Tyr- Tyr- Tyr- Tyr- Tyr- Tyr- -Thr- Thr- Thr- Thr- Thr- Thr- -Leu- Leu-Leu- Leu-Leu-Leu-

64种密码子，61种编码氨基酸（AUG也是起始密码）， UAA、UAG、UGA是终止密码。

遗传密码的基本特征： （1）通用性 ：动植物微生物都可使用。 （2）读码的连续性：不重叠无间隔。

开放阅读框 Open reading frame （3）方向性：密码子的阅读方向为5’→3’。 mRNA AUG GUA GCC UAC GGA UAG ----- --------- ---------- 5’ 3’ 开放阅读框 Open reading frame

（4）简并性 除Met 和 Trp只有一个密码子外，其余氨基酸有一个以上 的密码子为其编码。 同义密码子：编码同一种氨基酸的密码子。 遗传密码的简并性意味着：一个氨基酸有一个以上的tRNA与其相对应，或一个tRNA分子可以识别一个以上的密码子。

同义密码子

（4）简并性 除Met 和 Trp只有一个密码子外，其余氨基酸有一个以上 的密码子为其编码。 同义密码子：编码同一种氨基酸的密码子。 遗传密码的简并性意味着：一个氨基酸有一个以上的tRNA与其相对应，或一个tRNA分子可以识别一个以上的密码子。

（5）摆动性（变偶性） ： tRNA上的反密码子与mRNA上的密码子配对时，密码子的前两位与反密码子精确配对，而第三位可以有一定的变动。

密码子与反密码子之间的摆动配对 密码子第三位碱基 反密码子 第一位碱基 因此细胞中只需要32种tRNA就能识别61个编码氨基酸的密码子。

mRNA ······ ······ UUG GCA CUG ······ ······ ······ UUG GCU CUG ······ 肽链 ······ ····· Trp Ala Leu ······ ······ ····· Trp Ala Leu ······ 密码子的简并性与摆动性在一定程度上保证了生物遗传的稳定性。

（6）偏倚性：蛋白质生物合成时对简并密码子的使用频率不同。 例：E.coli 编码Thr的4个密码子使用频率 ACU ACC ACA ACG 36次 26次 3次 未使用

练 习 1. 与mRNA的ACG密码子相对应的tRNA的反密码子是（ ） A、UGC B、TGC C、CGU D、CGT C 练 习 1. 与mRNA的ACG密码子相对应的tRNA的反密码子是（ ） A、UGC B、TGC C、CGU D、CGT 2. 密码子AUC能与哪个反密码子配对结合（ ） A、AUG B、AUI C、IUA D、IAU 3. 反密码子UGA能与下列哪个密码子配对结合（ ） A、UCA B、CAU C、ACU D、ACT C D A

一、参与蛋白质生物合成的物质 二、原核生物蛋白质的生物合成 三、真核生物蛋白质的生物合成 第二节 蛋白质的生物合成 一、参与蛋白质生物合成的物质 二、原核生物蛋白质的生物合成 三、真核生物蛋白质的生物合成

一、参与蛋白质生物合成的物质 20 amino acid energy：ATP、GTP Protein factors：IF、EF、 RF Mg2+、K+ mRNA、tRNA、核糖体 主要的酶：氨酰-tRNA合成酶、肽基转移酶

1. mRNA —— 翻译的模板 原核生物多顺反子 真核生物单顺反子 原核生物mRNA在起始密码子上游有SD序列； B. 原核生物mRNA在起始密码子上游有SD序列； 真核生物mRNA在 5´末端有帽子结构（m7G）。

原核生物mRNA起始密码子上游的SD序列 SD序列：Shine-Dalgarno sequence，又名核糖体结合位点（ribosome binding site，RBS）序列， AUG上游约8～13核苷酸处，4 ～6个核苷酸组成，富含嘌呤。

原核生物mRNA的SD序列与16S rRNA 3’端序列互补，这一结合使得核糖体能够识别正确的起始密码AUG。

真核生物翻译时，核糖体先识别mRNA帽子结构，并向下游扫描寻找起始密码子，翻译的起始通常开始于从核糖体进入部位向下游扫描到的第一个AUG。

2. tRNA —— 翻译的接合体

tRNA中与蛋白质合成有关的四个位点： 氨基酸结合位点 核糖体识别位点 氨酰-tRNA合成酶识别位点 反密码子位点

3. 核糖体 —— 肽链合成的场所 原核细胞中，核糖体以游离形式存在，2000 个 /细胞。 真核细胞中，核糖体可分为两类：一类与细胞内质网相结合，形成粗糙内质网，主要参与分泌性蛋白质的合成；另一类游离于胞浆，主要参与细胞固有蛋白质的合成。106~107 个 / 细胞 。线粒体、叶绿体也有自己的核糖体。

核糖体由大小两个亚基组成

核糖体的功能部位

3个tRNA结合位点 A P E 肽基转移酶中心 A位：氨酰接受位 （ aminoacyl site，受位）大部分位于大亚 基，结合一个新进入的氨酰-tRNA的位置。 P位：肽酰结合位 （peptidyl site，给位）大部分位于小亚基，结合起始tRNA并向A位提供肽酰基的位置。 E位：排出位，卸载tRNA (exit site)的位置。

二、原核生物蛋白质的生物合成 氨基酸的激活 肽链合成的起始 肽链合成的延长 肽链合成的终止 蛋白质翻译后的加工

（一）氨基酸的激活 —— 氨酰-tRNA的合成 AAcyl-tRNA + AMP + ppi AA + ATP + tRNA 氨酰-tRNA合成酶 Mg2+ 每个氨基酸的活化，净消耗2个高能磷酸键 氨酰-tRNA的表示方法 Gly-tRNAGly Arg-tRNAArg .....

氨酰-tRNA合成酶 催化tRNA氨酰化 ☆反应分步进行： 1.AA +ATP→ AA-AMP+ppi 2.AA-AMP + tRNA → 酸酐键 1.AA +ATP→ AA-AMP+ppi 氨酰-腺苷酸 AA的羧基端通过酯键连接 2.AA-AMP + tRNA → AAcyl-tRNA + AMP 氨酰-tRNA

（Aminoacyl-tRNA synthetases） 氨酰-tRNA合成酶 胞液 高度特异性 校正活性 tRNAs (green) ATP (red)

第二套遗传密码系统(second genetic code) 氨酰-tRNA合成酶和tRNA之间的相互作用，及tRNA分子中某些碱基或碱基对决定着携带专一氨基酸的作用。 （反密码子在决定tRNA的特异性并非是唯一的关键） 辅密码区 Structural elements of tRNAAla that are required for recognition by Ala-tRNA synthetase

原核生物起始氨基酸 （ N-甲酰甲硫氨酸，fMet） （二） 肽链合成的起始 原核生物起始氨基酸 （ N-甲酰甲硫氨酸，fMet） 装载形式：fMet- tRNAfMet （起始tRNA） 区别：内部甲硫氨酸Met 由tRNAMet携带

甲酰转移酶 （ ） N10-甲酰四氢叶酸

肽链合成起始所需原料 30S小亚基 50S大亚基 mRNA GTP 起始氨酰-tRNA (fMet-tRNAfMet) 三种起始因子 IF3：亚基分离 IF2：结合GTP，促进fMet-tRNAfMet就位。 IF1：辅助IF3 、 IF2

肽链合成的起始过程 （1） 起始因子IF3使70S亚基解离， 促使mRNA与30S亚基结合形成30S• mRNA • IF3复合体，30S亚基上的P位对准起始密码子AUG。

（2）起始氨酰-tRNA（fMet-tRNAfMet）和IF2 、GTP结合， 进入 30S亚基P位，形成一大复合体。

（3）70S起始复合物的形成

起始全过程小结： 注意mRNA与起始氨酰-tRNA进入的先后顺序! 70S亚基解离 mRNA与小亚基结合 fMet-tRNAfMet进入 大亚基进入 70S起始复合物形成

（三） 肽链合成的延长 进位→转肽→移位 需要： 70S 起始复合物 氨酰-tRNA 三种延伸因子： EF-Tu、EF-Ts、EF-G（移位因子） GTP 、Mg 2+、K+

AA2 （1）进位 EF-Tu·GTP·氨酰-tRNA Ts循环 进入 A位!

（2）转肽 肽基转移酶（23S rRNA） 催化反应的实质是使一个酯键转变成了一个肽键。

（3）移位 需要移位因子EF-G的参与，由一个GTP水解提供能量。 蛋白质合成方向：N端→C端！

（四） 肽链合成的终止与释放 1）释放因子（release factor，RF ）进入A位，识别终止密码子。 2）释放因子使肽基转移酶的催化作用转变为水解作用，使多肽链从tRNA上解离出来。 3）在核糖体再循环因子（ribosome recycling factor，RRF）参与下， tRNA、 mRNA离开核糖体。核糖体的两个亚基分离， 投入新一轮的反应。

释放因子（release factor, RF） RF1 识别UAA、UAG RF2 识别UAA、UGA RF3 是一种和GTP形成复合体的结合蛋白，能 刺激RF1、RF2的活性？

肽链的起始 2 AA活化 核糖体的移位 形成一个肽键需要： 蛋白质合成所需的能量 1 GTP →GDP+Pi 肽链的起始 起始复合物形成后，多肽链中每形成一个肽键需要4个高能磷酸键 2 ATP→AMP+PPi AA活化 氨酰-tRNA进位 GTP →GDP+Pi 1 核糖体的移位 GTP →GDP+Pi 1 形成一个肽键需要： 4

原核生物蛋白质合成的特点 原核生物起始密码除AUG外，还有GUG，UUG 合成起始需要起始密码子前的SD序列 肽链的合成是在A位进行的 肽链的合成方向是N端→C端 mRNA的阅读方向是5’ →3’ 转录与翻译是偶联的 为提高效率，多个核糖体同时翻译一个mRNA分子 每延长一个AA残基需要消耗4个高能磷酸键

原核生物转录与翻译偶联

多核糖体 翻译过程中，在细胞内一条mRNA链上结合着多个核糖体，甚至可多到几百个，构成多核糖体(polyribosome)，形成念珠状。这种多核糖体可以在一条mRNA链上同时合成多条相同的多肽链，这就大大提高了翻译的效率 。

三、真核生物（eucaryote）蛋白质合成 真核生物与原核生物蛋白质合成的差异 真核生物起始密码只有AUG，由Met-tRNAiMet 识别； 起始因子eIF约有9~10种； 真核生物40S亚基与5’-Cap接触沿mRNA寻找AUG，无需SD序列信号； 起始复合物形成： Met-tRNAiMet先与 40S亚基形成43S，再与mRNA结合成48S，最后与60S亚基结合成80S； 延长因子：eEF1A、 eEF1B 、eEF2； 释放因子： eRF，对三个终止密码子都能识别。

起始复合物形成： Met-tRNAiMet先与 40S亚基形成43S；再与mRNA结合成48S；最后与60S亚基结合成80S。

第三节 蛋白质翻译后的加工

一、蛋白质翻译后的修饰加工 1．N末端甲酰甲硫氨酸（fMet）或甲硫氨酸（Met）的去除 2．蛋白质前体中不必要肽段的切除 3．对多肽链中特定氨基酸侧链基团的修饰 磷酸化 、糖基化 、羟基化 、酰基化等 4．二硫键的形成 5．辅基的加入 6．多肽链的正确折叠： 分子伴侣、 折叠酶

二、蛋白质合成后的定向转运 核蛋白体合成的蛋白质有三个去向： ①保留在胞浆 ②进入细胞核、线粒体或其他细胞器 ③分泌出细胞经体液运输到达靶细胞、靶器官。

定向转运（protein targeting） 蛋白质合成后定向到达其执行功能的目标地称蛋白质的定向转运。 信号肽理论由Sabatini 和Blobel 于1970年提出。 N————————————————————-- 信号肽被切除的位点 碱性氨基末端 疏水核心区 加工区 ☆信号肽(signal peptide) ：靶向输送蛋白质前身中可被转运系统识别的特征性氨基酸序列。在蛋白质的靶向输送中起决定性作用。

☆信号识别颗粒（SRP） ：SRP由6种蛋白质和7SRNA构成。

内容小结 遗传密码的特点：通用性、连续性、方向性、简并性、摆动性、偏倚性 真核生物与原核生物mRNA结构的区别 核糖体上3个tRNA结合位点：P位（肽酰结合位，给位）； A位（氨酰接受位 ，受位）；E位（排出位） tRNA中与蛋白质合成有关的四个位点：氨基酸结合位点，氨酰-tRNA合成酶识别位点，核糖体识别位点，反密码子位点 蛋白质的生物合成过程：氨基酸的激活，肽链合成的起始，肽链合成的延长，肽链合成的终止，翻译后的加工

参考书目 生物化学简明教程（第四版）.罗纪盛等主编，北京:高等教育出版社出版, 2009. 生物化学（第三版）.王镜岩、朱圣庚等主编，北京:高等教育出版社. 2002. Biochemistry, Reginald H. Garrett and Charles M. Grisham, 2rd edition, Higher Education Press. China , 2005. Nelson D L, lehninger Principles of Biochemistry. 4th ed. New York: W. H. Freeman, 2004.

致 谢 对课件中未及注明出处的图片的作者 表示感谢！