第六章 中药指纹图谱技术简介 （FingerPrinting of TCM）

第一节 概 述 一、中药指纹图谱(TCM/F)的定义及基本属性 1．TCM/F的定义及其特点 第一节 概 述 一、中药指纹图谱(TCM/F)的定义及基本属性 1．TCM/F的定义及其特点 定义：中药指纹图谱是指中药经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示该中药特性的共有峰的图谱，是一种新的中药质量控制模式。

TCM/F特点： ① 通过指纹图谱的特异性，能有效鉴别样品的真伪或产地； ② 通过指纹图谱主要特征峰的含量或比例的制订，能有效控制样品的质量，确保质量的相对稳定。

2．中药指纹图谱的两个基本属性 ① 整体性: 是指将指纹图谱作为一个整体进行考察，而不是孤立地以其中单个峰的有无、高低以及峰面积的大小来判断药材或成品的质量。它强调的是多个成分以相对稳定的比例及位置顺序的完整性特征。 指纹图谱是在特定的“环境”中由若干具有指纹特征的“峰”（或平面色谱图像的斑点）组成，它们之间的排列顺序、大小、高低及相互的牵制构成了整体的特征，反映的质量信息是综合的。

② 模糊性：是指在共同特征的基础上个体之间又互有差异，不能保证所得的指纹图谱中每一个峰都没有重叠，也不能保证所得的图谱包含了样品的所有特征，况且在不同的实验条件下所得的图谱会有很大的差异。 指纹图谱的模糊性是中药本身的属性，首先不可能将中药化学成分都搞清楚，再者中药材因受生长环境、采收加工及贮藏等的影响，作为次生代谢产物的化学成分具有不确定性，难以精确地测定，从而决定了由这些化学成分组成的指纹图谱也是“模糊”的。  指纹图谱分析强调的是：准确的辨认，而不是精密的计算；比较图谱强调的是相似，而不是相同。

3．制订指纹图谱的目的与意义 ① 指纹图谱是对中药质量控制的补充和提高； TCM/F不仅能用于定性鉴别，理想的指纹图谱也可用于定量分析。 ② 指纹图谱有利于控制中间体及成品的一致性，减少批间差异。 通过指纹图谱研究，可以掌握每个批次原药材、中间体中成分的变化，从而进行有指导的合理“勾兑”。

 中药指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴别手段，在现阶段，通过色谱指纹特征相似程度的比较，判断真伪、评价优劣、考察稳定性和一致性，是一种符合中药特色的质量控制模式。 4．建立中药指纹图谱的原则 （1）特征性(专属性)： 能够表达某品种特征的性质，即专属性或唯一性，这是指纹图谱首先必须具备的。指纹图谱反映的化学成分应包括中药所含大多数组分的类别或指标成分的全部。 指纹图谱中反映的化学信息(表现为保留时间或比移值)具有高度的选择性，能特征地区分中药的真伪与优劣，成为中药自身的“化学条码”。

（2）重现性（稳定性）： 所制定的指纹图谱在规定条件下应能再现指纹特征（如共有峰数目、大小、位置等），其误差应在允许的范围内。同一样品，在同一操作条件下，结果的重复性要好。因此，根据不同的要求要考虑选用何种分析方法建立指纹图谱最合适。 （3）可操作性 可操作性是指针对不同用途，选用不同分析方法来达到不同的目的。如用于质量控制，应考虑生产企业和药检部门常规配备的仪器设备来建立相应的方法，一般以光谱和气相色谱、高效液相色谱为主。如用于配伍理论或新药开发研究，特别是化学成分和药理、药效相关性研究，就应考虑采用联用技术，如GC-MS、HPLC-DAD-MS／MS等方法，获取大量信息，更有利于得到明确的结果。

二、中药指纹图谱的类型 1．按测定手段分类 （1）中药化学（成分）指纹图谱 采用光谱、色谱和其他分析方法建立的用以表征中药化学成分特征的指纹图谱。 中药材DNA指纹图谱 中药基因组学指纹图谱 中药蛋白组学指纹图谱 （2）中药生物指纹图谱

中药基因组学指纹图谱是用于描述中药作用于生物细胞后引起的基因表达特征的变化规律的图谱，用以阐明中药作用的个体差异及其与特定基因的作用模式。 中药DNA指纹图谱 利用现代分子生物学技术把这种DNA序列中的信息以图谱的形式表现出来即为DNA指纹图谱。DNA指纹图谱包括随机扩增多态性（RAPD）指纹图谱和限制性内切酶片段长度多态性（RFLP）指纹图谱。DNA指纹图谱具有高度的个体特异性，常用于中药的真伪、品种及种质资源的鉴定。 中药基因组学指纹图谱 中药基因组学指纹图谱是用于描述中药作用于生物细胞后引起的基因表达特征的变化规律的图谱，用以阐明中药作用的个体差异及其与特定基因的作用模式。

中药蛋白组学指纹图谱 描述中药作用于生物细胞后引起的蛋白表达特征的变化规律的图谱，能够较全面地提供中药复杂物质基础的大量信息，同时还能提供量效的相关信息，起到鉴定和研发的双重作用。比较不同蛋白质指纹图谱体现的不同药效结果，可以确定该制剂的主要活性物质。 中药生物指纹图谱学是从分子水平研究中药作用的本质特征，解决化学成分和药效活性的相关性问题，是中药指纹图谱研究的一个重要方面和最高级阶段。

2．按应用对象分类 中药材指纹图谱 中药原料药（包括饮片、配伍颗粒）指纹图谱 中间产物（中间体或提取物）指纹图谱 中药制剂（中成药）指纹图谱

三、中药指纹图谱研究的现状 美国食品药品管理局（FDA）、世界卫生组织（WHO）以及欧共体（EEC）等均在有关文件中指出可使用指纹图谱控制和评价中药（天然药物）的质量。故指纹图谱已被国际医药界认可。 目前我国已规定中药注射剂质量标准中必须建立指纹图谱检测方法，并对此作出了具体的技术要求。此外，该方法在中药材规范化生产（GLP）实施过程中亦得到广泛的应用。

第二节 中药指纹图谱测定方法 色谱法 (TLC、 HPLC、 GC、 HPCE) √ 光谱法 (UV-VIS、IR、NMR、MS、XRD) 第二节 中药指纹图谱测定方法 色谱法 (TLC、 HPLC、 GC、 HPCE) √ 光谱法 (UV-VIS、IR、NMR、MS、XRD) 联用技术: 建立多维多息特征谱 生物学方法(中药DNA、基因组学、蛋白组学) 包括

 其中以色谱法为主流方法，尤其是HPLC、TLCS和GC已成为公认的三种常规分析手段。由于HPLC具有分离效能高、选择性高、灵敏度高、速度快、应用范围广等特点，大多数中药成分可在高效液相色谱仪上进行分析，且积累了丰富的经验。因此，高效液相色谱法已成为中药指纹图谱的首选方法。对于成分复杂的中药材及其制剂，特别是中药复方注射剂，可考虑采用多种检测方法，建立多张指纹图谱。

 中药指纹图谱举例 TLCFG 银杏提取物的HPLC指纹图谱 陈皮的TLC指纹图谱

※ 指纹图谱对高效液相色谱仪的要求 1.选择在线脱气 在线式脱气技术是把真空脱气装置串接到贮液系统中，并结合膜过滤器，实现流动相在进入输液泵前的连续真空脱气。在线式脱气法的脱气效果明显优于离线式脱气法，并适用于多元溶剂系统。

2.选择低压梯度洗脱 梯度洗脱在中药指纹图谱分析中广泛应用。 梯度洗脱可分为高压梯度洗脱和低压梯度洗脱两种方式。 低压梯度洗脱是在常压下将多元溶剂输至混合器中混合，然后用高压输液泵将流动相输入色谱柱中，其优点是：① 仅需使用一个高压输液泵；② 减少了溶剂可压性的影响，并能完全消除由于溶剂混合引起的热力学体积变化所带来的误差。

梯度洗脱装置 低压梯度洗脱 高压梯度洗脱

目前常用的进样装置有六通阀手动进样器和自动进样器。 3.选择六通阀手动进样或自动进样 目前常用的进样装置有六通阀手动进样器和自动进样器。 Load inject

4.色谱柱的选择 一般选5~10 μm C18 填料柱，以4.6 mm × 250mm 较适宜。其他特殊填料的色谱柱，如辛基柱（C8）、氨基柱（NH2）、腈基柱（CN）、 硅胶柱（Silica）、酸性柱和碱性柱等，可视研究对象的不同而采用。

常用流动相：乙腈、甲醇、水和四氢呋喃等。 5.流动相的选择 常用流动相：乙腈、甲醇、水和四氢呋喃等。 RP-HPLC 梯度洗脱：乙腈-水系统(醇-水系统易导致 基线漂移)。 常用改性剂: 磷酸、乙酸、三乙胺、二乙胺、正丁基溴 化胺、十二烷基磺酸钠等。 常用缓冲溶液: 磷酸-磷酸盐、乙酸-乙酸盐。 黄酮类、酚酸类：乙腈－水－酸系统 皂苷类：乙腈－水系统 生物碱类：乙腈-水-三乙胺

6.柱温的选择 在不同柱温下同一成分的保留时间往往发生迁移，有时还会影响成分的分离效果。由于中药样品成分的复杂性，尤其是中药指纹图谱要求色谱峰的相对保留时间、峰面积比值应相对恒定，因此对柱温应严格控制，以保证分析方法的重现性。 ---当色谱图中某个色谱峰因溶解度差而峰形较“钝”时，可 适当提高柱温（30～50℃）； ---若样品中组分在常温或高温下不稳定，易发生水解或分解 （如鸟头生物碱）等变化时，可降低柱温。

7.进样量的选择 应避免超载，一般控制最高色谱峰的吸光值在100mAU左右。 8.检测器的选择 大多数中药成分在可见或紫外光区有吸收，故UVD在现代高效液相色谱中应用最广泛。其特点是灵敏度高、线性范围宽，对流动相的流速和温度变化不敏感，波长可选择，可用于梯度洗脱。

蒸发光散射检测器（ELSD）和二极管阵列检测器（DAD）在中药指纹图谱分析中亦有重要作用。

蒸发光散射检测器示意图 1.HPLC流出物 2.雾化气体 3.浓缩雾化器 4.雾化室 5.废液（沉降液滴） 6.漂移加热管 7.光源 8.光束 9.散射光 10.透射光 11.光电倍增管 12.排除的气体

9.指纹特征的选择与技术参数 （1）共有指纹峰的标定 色谱法采用相对保留时间标定指纹峰(相对于参照物的保留时间)。 （2）共有指纹峰面积的比值 以参照物峰面积作为1，计算各共有指纹峰面积与参照物峰面积的比值。  各共有指纹峰的面积比值必须相对固定(依据单峰面积占总峰面积比值的不同，对其相对偏差值要求也不同 ) 。

（3）非共有峰面积 三组分混合物的三维色谱图 中药材供试品的图谱与指纹图谱比较，非共有峰总面积不得大于总峰面积的10％。注射剂及其有效部位或中间体供试品的图谱与指纹图谱比较，非共有峰总面积不得大于总峰面积的5％。 三组分混合物的三维色谱图

第三节 中药指纹图谱研究程序及技术要求 中药指纹图谱研究的主要程序包括：样品采集、方法建立、数据分析、样品评价和方法检验等。样品采集要求有一定的数量，以保证供试品的代表性和均一性；方法建立是指选取适当的方法建立指纹图谱并进行考察；数据分析是对研究过程中所获得数据进行处理，找出共性和不同点，确定评价指标；样品评价是指按所确定指标对样品进行的品质评价；方法检验是指在方法确立后的一段时间内对更多未知样品进行的检验，以进一步考察方法的可行性和实用性。

中药指纹图谱研究的整个过程示意图 6-1

1.方案的设计 （1）研究对象的确定 在充分调研的基础上确定成品中的药效成分，作为成品和中间体指纹图谱的研究对象，即检测目标。 复方注射剂应以君药、臣药中的有效成分作为指纹图谱的主要研究对象，佐使药中的成分可采用其它方法进行辅助补充性研究。

例如: 黄芪含黄酮、皂苷及多糖三类有效成分，黄芪多糖注射液及其中间体的指纹图谱则以多糖为研究对象，黄芪原药材的指纹图谱应把黄酮、皂苷及多糖作为研究对象。

（2）研究方法的选择 应根据研究对象的物理化学性质来选择相应研究方法。 大多数化合物可采用 HPLC，例如黄芪中黄酮、皂苷、多糖等。 挥发性成分应采用GC，例如鱼腥草中的鱼腥草素、土木香中的土木香内酯等。 此外，还可考虑使用TLC和CE。

主要研究内容有原药材、中间体、注射剂的指纹图谱，涉及样品名称、来源、制备、测定方法，指纹图谱及技术参数等。 （3）研究内容 主要研究内容有原药材、中间体、注射剂的指纹图谱，涉及样品名称、来源、制备、测定方法，指纹图谱及技术参数等。

2.样品的采集（注意样品的代表性） (1) 至少要采集10个批次样品，切不可将同一批 次样品分散成数个批次充当样品。 (2) 原药材尽可能固定产地 (来自GAP基地药材或道地药材)、采收期、炮制方法。对光线稳定、疗效稳定、无临床不良反应的药材批次应重点选择。还应采集不同产地、不同采收期的药材，以便进行指纹图谱的比较研究。

(3) 中间体、注射剂样品的收集应重点选择工艺稳定，疗效恒定，无不良反应的批次。 (4) 取样应不少于3次检验量，并留有足够的观察样品。

3.供试品溶液的制备 （1）药材供试液的制备 根据所含成分的理化性质，通过溶剂提取、液液萃取、沉淀、吸附等方法，分离富集样品。 例如，黄芪中黄酮类成分通过碱的萃取；皂苷类通过大孔吸附树脂吸附；苦参中总生物碱通过阳离子交换树脂分离；挥发性样品常用水蒸汽蒸馏法制备。

（2）中间体供试液制备 可针对有效成分进行处理，并参照原药材供试液的制备方法。 （3）注射剂供试液制备 液体注射剂一般无需特殊处理，可直接分析检测。  根据研究对象所含化学成分的理化性质和检测 方法的需要，制备方法须确保其注射剂、有效 部位或中间体主要化学成分在指纹图谱中能够 再现。

一般选取样品中容易获得且含量较高的一个主要活性成分或指标成分作为参照物。 4.参照物的选择  首选对照品作为参照物；如果没有适宜的对照品，也可选择适宜的内标物作为参照物；并根据检测方法的需要，选择适宜的方法进行参照物的制备。 一般选取样品中容易获得且含量较高的一个主要活性成分或指标成分作为参照物。 参照物主要用于指纹图谱技术参数的确定，如特征峰（共有峰）的相对保留时间，峰面积比值等；并有助于图谱的稳定性、重现性的考查。

例如: 三七药材的指纹图谱中以三七皂苷R1为参照物（S）。由于指纹图谱比较复杂，内标物不易选择、插入，故一般不以内标物做为参照物。

5.实验方法和条件的优化 其目的是通过比较实验，从中选取相对简单易行的方法和条件，获取足以代表品种特征的指纹图谱，以满足指纹图谱的专属性、重现性和普适性(可操作性)的要求。 方法和条件须经过严格的方法学验证。例如稳定性试验，精密度试验，重复性试验等。

稳定性试验 取同一供试品，分别在不同时间（0、1、2、4、8、12、24、36、48 h）检测，考察色谱峰的相对保留时间、峰面积比值的一致性，确定检测时间。 精密度试验 取同一供试品，连续进样5次以上，考察色谱峰的相对保留时间、峰面积比值的一致性。在指纹图谱中规定共有峰面积比值的各色谱峰，其峰面积比值的相对标准偏差（RSD）不得大于3％，各色谱峰的相对保留时间应在平均相对保留时间±1 min内。 主要考察仪器的精密度。

重复性试验 取同一批号的供试品5份以上，分别按照选定的提取分离方法制备供试品溶液，并在选定的色谱条件下进行检测，考察色谱峰的相对保留时间、峰面积比值的一致性。在指纹图谱中规定共有峰面积比值的各色谱峰，其峰面积比值的相对标准偏差（RSD）不得大于3％，备色谱峰的相对保留时间应在平均保留时间±1 min以内。 主要考察实验方法的重复性。

例：淫羊藿提取物指纹图谱的优化 初始条件 0~55min：水-乙腈（100:0→20:80） 55~60min：水-乙腈（20:80→0:100）

0~40min：水-乙腈（100:0→70:30） 40~60min：水-乙腈（70:30→60:40） 一次优化 0~40min：水-乙腈（100:0→70:30） 40~60min：水-乙腈（70:30→60:40）

二次优化 0~40min：水-乙腈（80:20→60:40） 40~60min：水-乙腈 （60:40→50:50）

① 供试液的制备和色谱分析时均须定量操作以保 证图谱在整体特征上进行半定量（差异程度或 相似程度）的比较。 【注意事项】 ① 供试液的制备和色谱分析时均须定量操作以保 证图谱在整体特征上进行半定量（差异程度或 相似程度）的比较。 ② 指纹图谱分析不同于含量测定，提高其分离度应 以不牺牲色谱的整体特征为前提，故不应孤立 地苛求分离度达到含量测定的要求。 ③ 采用HPLC和GC制定指纹图谱，记录时间一般为1 小时（实测2小时）。

6.标准指纹图谱及其技术参数的建立 （1）测得的大量色谱数据需经分析和数据处理，才能获得标准指纹图谱（拟合指纹图谱）及其技术参数，以此作为评价药品指纹图谱的依据。

（2）技术参数主要包括： 总峰面积、共有峰序号、参照峰(S)、共有峰相对保留时间(RRT)、共有峰峰面积比值(RA)和非共有峰面积等。 RRT=RTi/RTs RA=Ai/As 共有峰亦称特征峰（包括参照峰）系指所有被检批次中均含有的相同色谱峰，主要来源于样品中主要有效成分或指标成分。

例：天然虫草标准指纹图谱的建立 10批样品HPLC图谱横向叠加图

10批样品（天然虫草）HPLC图谱纵向叠加图

天然虫草标准指纹图谱

例：复方丹参注射液标准指纹图谱9个特征峰的技术参数 ① 相对保留时间(峰序号) : 0.145(1) 0.186(2) 0.298(3) 0.378(4) 0.425(5) 0.499(6) 0.594(7) 1.000(s 原儿茶醛) 1.145(8) ② 峰面积比值(峰序号) : 0.059(1) 0.064(2) 0.036 (3) 0.112±30％(4) 0.054(5) 0.297±25％(6) 0.055(7) 1.000(s原儿茶醛) 0.040(8)

（3）指纹图谱相关性的考察 注射剂中各特征峰均可在原药材及中间体指纹图谱中得到追踪，以验证所建指纹图谱的正确性。中间体与注射剂的指纹图谱应非常接近，药材图谱中的色谱峰应比注射剂多。必要时可采用加入某一原药材、有效部位或中间体的供试品或制备某一原药材、有效部位或中间体阴性供试品的方法标定各指纹图谱之间的相关性。应提供相关性研究的指纹图谱。

第四节 中药指纹图谱分析及评价 中药指纹图谱的分析及评价系指以建立起来的标准指纹图谱为依据，将样品指纹图谱与之进行相似性分析比较，从而对中药质量做出判断和评价。 根据指纹图谱所获取的信息，建立指纹图谱分析比较的重要参数，如共有峰、重叠率、n强峰、特征指纹峰等；计算特征指纹的相似率与差异率，进行指纹图谱评价；应用主成分分析、聚类分析、人工神经网络或相似度分析等计算机技术，进行解析、识别图谱信息以及图谱相似度评价，以建立可行、实用的中药指纹图谱量化评价标准。

－、重要参数的建立 1．共有指纹峰 中药指纹图谱中，多个样品所具有的相同相对保留值的色谱峰，即为共有指纹峰。根据参照物的保留时间，计算指纹峰的相对保留时间，根据10批次以上供试品的检测结果，标定共有指纹峰。以对照品作为参照物的指纹图谱，以参照物峰面积作为1，计算各共有指纹峰面积与参照峰面积的比值；以内标物作为参照物的指纹图谱，则以共有指纹峰中其中一个峰（要求峰面积相对较大、较稳定的共有峰）的峰面积作为1，计算其他各共有指纹峰面积的比值。各共有指纹峰的面积比值必须相对固定。未达基线分离的共有峰，应计算该组峰的总峰面积作为峰面积，同时标定该组各峰的相对保留时间。

中药供试品图谱与指纹图谱中的共有峰数乘以2，占两者色谱峰总数的百分率，称重叠率。其计算公式为： 2．重叠率 中药供试品图谱与指纹图谱中的共有峰数乘以2，占两者色谱峰总数的百分率，称重叠率。其计算公式为： 重叠率反映指纹图谱的相似程度，重叠率愈大，指纹图谱愈相似。在实际工作中，应根据具体情况，给重叠率规定一个合理的区间范围。重叠率是重要的定性依据，为中药品种鉴定提供了可靠的证据。

3．n 强峰 n强峰应视实际的出峰情况、峰面积值而定。首先从众多的色谱峰中，按其峰面积值的大小，选择列前的n个色谱峰为强峰，这n个强峰的总峰面积和应占整个峰面积和的70％以上。 n值的大小取决于两方面，一是出峰总数的多少，一般以总峰数的1/5～l/3为宜；二是根据n个强峰总峰面积和的大小而定。其次，应注意n强峰中各色谱峰在供试品图谱中出现的频次和所列的次序。 n强峰反映了中药中各主要成分的相对含量情况，是评价中药质量的重要信息和依据。

4．特征指纹峰 所有供试品图谱中均存在的色谱峰，可以认为它们是该中药品种所特有，故称之为特征指纹峰。特征指纹是指由一系列特征指纹峰所组成的固定峰群，实现了从多组分的角度来反映中药内在特征的目标，为原药材或饮片品种鉴定，特别是同属不同种或含相同有效成分不同种的药材的鉴别，提供了更多更细致的信息和依据。

相似率与差异率是表示供试品图谱与指纹图谱之间相似程度的数值，它将定性信息与定量数据综合于一体，作为最终鉴定的重要依据。 二、特征指纹的相似率与差异率 相似率与差异率是表示供试品图谱与指纹图谱之间相似程度的数值，它将定性信息与定量数据综合于一体，作为最终鉴定的重要依据。 特征指纹总相似率应等于或小于1，当相似率等于1时，表示两者完全相同；当小于1时，则表示两者的相似程度；若相似率大于1，则失去计算相似率的意义。

差异率 差异率是以供试品图谱中每个特征指纹峰与其相应的指纹图谱中特征指纹峰的峰面积间的差值与指纹图谱中该特征指纹峰的峰面积值的比值，表示该特征指纹峰的差异程度。特征指纹总差异率是将每个特征指纹峰的差异率求和即得，显示出两者在特征指纹上的差异性。其计算公式为：

中药指纹图谱的评价不同于含量测定，它强调的是相似性(Similarity)，而不是相同性(Identity)，也即着重辨识完整图谱“面貌”，而不是求索细枝末节。分析比较的目的是对供试品与对照品之间的差异或一致性作出的评价。 相似性的比较可以用“相似度”表示，相似度可借助国家药典委员会推荐的“中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件”计算，一般情况下相似度在0.9～1.0之间即符合规定。

三、指纹图谱的计算机解析 （一）图谱信息获取 指纹图谱中主要特征峰与相邻峰的分离度应达到有效的分离，即分离度在1.2以上，其他特征峰也应达到一定的分离，峰顶到峰谷的距离至少应大于该峰高的2/3以上，如果达不到则两个峰可以合并为一个峰计算。为了有助于特征峰的辨认和特征峰的匹配，峰保留时间的波动应控制在该峰保留时间的±5％～±10％以内，且选择参照物或在同一色谱中选择一个适当的色谱峰作为内参照物，计算特征峰的相对保留时间和相对峰面积比，用来考察指纹图谱的稳定程度和重复性。以特征峰的相对保留时间和相对峰面积比作为参数，峰面积大于10％的峰规定其相对峰面积值的范围，建立对照用指纹图谱（共有模式），用以判断样品的真实性。

（二）图谱信息处理 中药指纹图谱相当复杂，图谱中反映出的信息，既有对分类决策有用的，也有对分类决策无用的，人工比较难免影响结果的准确性。若将其与计算机图谱解析和识别技术结合起来，其应用将大为扩展。图谱解析就是从图谱中分析和提取有用的特征信息（即能反映不同样本在化学成分及含量上差异的特征信息），并将其转化为计算机能接受的数量化矩阵，以获取能够反映中药质量的客观指标，为建立中药质量评价系统提供规范化标准。图谱解析目前尚无一个普遍适用的方法，视具体情况灵活选择合适的化学模式识别方法。

1．模糊信息分析法 该法是对模糊事物进行划分、判断或推理的方法。事物的模糊性是指客观差异的中介过渡性所引起的划分上的一种不确定性。所谓差异的中介过渡性，是指从差异的一方（如中药真品）到差异的另一方（如中药伪品），所经历的从量变到质变的中间过程。中药的指纹图谱特征具有模糊性，通常采用“隶属度”来反映这种模糊性，即用隶属度来判别中药的真伪。 计算机模糊识别的基本步骤是：① 特征提取，即从中药的指纹图谱中获取能够反映其品质的数量化特征。特征提取时应遵循的原则为：尽可能舍弃对分类决策无影响的信息，而对分类决策有影响的信息全部保留，否则会影响分类决策的准确性。② 依照某种方式确定该中药指纹特征对“真模式”、“假模式”的隶属度。③用最大从属原则或阈值原则确定该中药样品的真伪。

2．人工神经网络法 该法是模拟人脑功能的全新信息处理方法，其理论基础是神经网络的数学模型。此处所说的神经网络并不是生理上所说的真实的神经网络，而是真实神经网络的一种数学抽象。神经网络系统中包含着大量的基本信息处理单元，称为神经元或节点。 反向传播（back propagation，BP）模型是目前应用最广泛的人工神经网络模型，具有判别分类可靠性大、判别速度快等优点。BP网络由具有多个节点的输入层、隐含层和输出层组成，它们分别对应于系统的输入、过渡和输出。

3．灰色关联聚类法 灰色系统是既包含已知信息，又包含未知信息的系统。由于中药指纹图谱信息具有灰色性，可用灰色系统理论中的灰色关联聚类法进行处理。该方法以定义的相对关联度为测度，构建一种全新的模式识别模型。 用灰色关联度作为评价测度，首先必须选择参考序列，然后计算相对于最优参考序列的关联度rs，和相对于最差参考序列的关联度rt 。 rs越大，表明评价单元序列与最优参考序列的关联愈甚，评价单元愈佳； rt意义正好相反，rt愈小，评价单元愈佳。理想的最佳评价单元应该是其与最优参考序列的关联程度最大，同时与最差参考序列的关联最小。

4．主成分分析法 将色谱数据矩阵的奇异值分解为两个正交矩阵（U,V）和对角矩阵（S）的乘积，即得3个数值的乘积，取其中2个数值作为投影图的纵横坐标，另一数值即为落在投影图上的投影点。根据投影点位置的不同，可以判别图谱中主成分变化的规律，即总量较低的样本在主成分投影图中处于最左端，随着在主成分投影图中的样本点从左往右移动时，整个色谱指纹图谱中总峰面积也在不断提高。 主成分分析法解决了指纹图谱提取物的总体含量在相似度评价中如何体现的问题。

（三）指纹图谱相似度评价 1．相似度计算方法与原理 （1）欧氏距离 （2）相关系数 （3）夹角余弦 （4）指数相似系数 （5）相似性比

2．相似度评价软件 计算相似度大多是借助国家药典委员会推荐的“中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件”来计算，即“中药指纹图谱鉴别分析系统（The Fingerprint Analysis System of Chinese Medicine）”与“计算机辅助相似性评价系统（Computer Aided Similarity Evaluation）”。这两个相似度计算软件均采用了模糊信息分析法，相似度计算方法为夹角余弦法，即把每个色谱指纹图谱都可以看作一组对应保留时间下的峰面积或谱图数据点的数值，可将这组数值看作多维空间中的向量，使两个指纹图谱间相似性的问题转化为多维空间的两个向量的相似性问题，利用cosө值来定量表征指纹图谱间的相似性。如果cosө越接近1，则说明两个向量越相似。

第五节 中药指纹图谱研究实例 ※ 丹参葡萄糖注射液HPLC指纹图谱的建立 原儿茶醛

1. 参照物溶液的制备 由于丹参葡萄糖注射液中原儿茶醛和丹参素为主要成分，在HPLC分析中，二组分的峰面积在图谱中所占比例较大且较稳定，故选原儿茶醛为参照物。准确称取原儿茶醛2mg，用流动相定容至5ml备用。

厂家生产或市售丹参葡萄糖注射液，冰箱中4℃保存，备用。 2. 供试品的制备 厂家生产或市售丹参葡萄糖注射液，冰箱中4℃保存，备用。 3. 实验方法与条件的选择 （1）仪器与试剂 TSP高效液相色谱仪（美国热电集团TSP公司 ）； Anastar色谱工作站； Zorbox C18 （4.6mm×250mm）色谱柱； DAD检测器。

① 流动相的选择： ② 检测波长的选择： （2）测定条件 通过设定三组10种流动相系统试验，以0.1%冰醋酸-甲醇（95︰5）系统最佳，各色谱峰分离较好，保留时间适中。 ② 检测波长的选择： 分别在210nm、254nm、280nm、325nm处进行预试，结果显示325nm波长处只检出1个色谱峰，210nm处只出现丹参素和原儿茶醛2个色谱峰，280nm处检出了3个色谱峰，只有254nm波长处检出的色谱峰最多，且各峰之间的分离度也较好，因此确定254nm为检测波长。

分别取各批次注射液供试品10 μl进样，按上述条件记录各色谱峰的保留时间和峰面积（每批供试品重复2次）。 ③ 其他条件： 柱温为室温，流速为 1mL/min。 （3）测定方法 分别取各批次注射液供试品10 μl进样，按上述条件记录各色谱峰的保留时间和峰面积（每批供试品重复2次）。

4. 标准指纹图谱及技术参数 （1）指纹图谱及其共有峰 根据10个批次供试品HPLC图谱的相关参数，供试品所有成分的色谱峰在35分钟之内全部流出，比较各批次样品的色谱图发现，其中有9个色谱峰是各批次样品所共有的，因此确定它们为共有峰（依次用数字标记）。

（2）共有峰的相对保留时间、峰面积比和占总峰面 积之比 对6批供试品的HPLC数据进行处理，得指纹图谱各共有峰的峰面积及峰面积比（相对峰面积 RA）、保留时间和相对保留时间（RRT）、各共有峰占总峰面积的比例及差值（RSD%），见下表。结果表明，各批供试品的重现性较好。

共有峰相对保留时间及面积比

共有峰占总峰面积的比例及其差值

经6批次实验结果统计，非共有峰面积占总峰面积小于10%，见下表。 （3）非共有峰面积 经6批次实验结果统计，非共有峰面积占总峰面积小于10%，见下表。 共有峰及非共有峰占总峰面积的百分比

玉屏风散水提醇沉浸膏的指纹图谱研究(P154) （4）指纹图谱相关性考察 分别对中药材、中间体和注射剂进行了HPLC分析，结果表明，注射剂中各共有指纹峰在药材和中间体中都有对应的色谱峰，而且中间体与注射剂的指纹图谱非常接近，药材通过适当的方法提取纯化后的HPLC图谱中的色谱峰要比注射剂中的多。 书上例: 玉屏风散水提醇沉浸膏的指纹图谱研究(P154)

III II I 诃 子 小诃子 大诃子 绒毛诃子

人参须根 人参主根

不同产地高良姜的气相指纹图谱