第八章 胚胎工程 （Embryo Technology）

8.1 概述 加快优良家畜品种的繁殖是保证物质生活不断 提高的迫切需要。一个多世纪以来，人们就期望“借 腹怀胎”提高种畜的利用率。 8.1 概述 加快优良家畜品种的繁殖是保证物质生活不断 提高的迫切需要。一个多世纪以来，人们就期望“借 腹怀胎”提高种畜的利用率。 1890年（Walter Heape，英国）：兔胚胎移植 20世纪30年代：山羊、绵羊胚胎移植成功 体外受精和胚胎体外发育研究，最早于1913年 1982年（Brachet，美国）：第一胎试管牛。 自此，十几种哺乳动物的试管动物相继产生。

8.1 概述 1983年，剑桥大学的一位台湾学生首次完成猪胚胎移植，成功移植4个经试管受精的猪胚胎，获得4只小猪。 8.1 概述 1983年，剑桥大学的一位台湾学生首次完成猪胚胎移植，成功移植4个经试管受精的猪胚胎，获得4只小猪。 1987年，美国国家动物园移植了一只濒临灭绝的珍贵猫的受精卵，成功获得3窝小猫。 1978年，两位英国科学家为一位30岁的初产妇创造了世界第一个试管婴儿。 澳大利亚利用胚胎移植技术在近十年里使安哥拉山羊的数量由30万只增加到100万只。

8.1 概述 在体外受精和体外胚胎发育基础上，发展了胚胎工程：胚胎切割、胚胎移植、胚胎冷冻保存、性别控制、嵌合体制作、甚至细胞核移植和转基因操作等技术。所有技术都在胚胎发育过程中进行。也称发育工程。 本章介绍：体外受精、胚胎移植、试管动物、生殖细胞和胚胎的冷冻保存。

8.2 胚胎发育的基本过程和机理 8.2.1 基本过程 1、生殖细胞的发生： （1）卵细胞内的生殖质的决定作用 8.2 胚胎发育的基本过程和机理 8.2.1 基本过程 1、生殖细胞的发生： （1）卵细胞内的生殖质的决定作用 生殖决定质：果蝇的极质——极细胞，非洲爪蟾——植物极 （2）生殖细胞向生殖腺的迁移 （3）生殖细胞的分化 2、受精： （1）精子的成熟与获能 （2）卵子的成熟与排放 （3）顶体反应

8.2 胚胎发育的基本过程和机理 8.2.1 基本过程 （4）异种与多精受精的避免 8.2 胚胎发育的基本过程和机理 8.2.1 基本过程 （4）异种与多精受精的避免 （5）卵子的激活：Ca2+波、蛋白激酶II（依赖钙调蛋白）、cyclin降解（MPF活性下降）——减数分裂结束——核融合——重启细胞周期。 ３、卵裂： 卵裂方式、特点、意义。 ４、囊胚及其后期发育：

8.2 胚胎发育的基本过程和机理 8.2.2 机理： 细胞分裂：二相周期 细胞分化：基因差别表达——诱导——信号分子、位置效应、内外环境 　　　8.2 胚胎发育的基本过程和机理 8.2.2 机理： 细胞分裂：二相周期 细胞分化：基因差别表达——诱导——信号分子、位置效应、内外环境 模式形成：构建时空活动模式——发育形成有序结构：前后轴、背腹轴，外、内、中胚层。 形态发生：胚胎三维结构的变化。细胞形态、状态的改变，胞间信号传导，细胞运动、增殖和调亡。 生长：早期胚胎生长少；中后期胚胎生长：细胞数量和体积增加、胞外物质累积；器官和躯体不同部位生长差别形成躯体的外形。

8.3 胚胎移植 胚胎移植（embryo transfer）,也称受精卵移植：一头母畜（供体）发情排卵经配种后，在一定时间内从其生殖道（输卵管、子宫角）取出受精卵或胚胎，移植到另一头与供体同时发情排卵、但未经配种的母畜（称受体）的相应部位（输卵管、子宫角）。胚胎着床、生长发育，产下供体的后代。

8.3 胚胎移植 绵羊（1934年），山羊（1974年），猪（1951年），牛（1978年），马（1973年）。 8.3 胚胎移植 绵羊（1934年），山羊（1974年），猪（1951年），牛（1978年），马（1973年）。 1948年（M.J.Chang,张明觉）：超数排卵技术，从2只母兔获得88个受精卵，移植给7只受体兔，产下76只小兔。具划时代的意义。 我国从70年代开始胚胎移植的研究。家兔（1979年）、山羊（1974年）、牛（1978年）获得成功。牛的超数排卵、胚胎移植有较快的发展。也是“八五”、“九五”农业部的重点攻关项目。但与发达国家相比，我国的胚胎移植技术水平较低，尚处开发应用的过渡阶段。

8.3.1 胚胎移植的目的 人工受精、冷冻精液：最大限度利用优良种公畜，加快家畜优良品种的推广速度。 胚胎移植：提高母畜的繁殖潜力，扩大良种雌配子的利用。 家畜胚胎移植的目的： 发挥优良母蓄的繁殖潜力 促进家蓄改良的速度 作为胚胎操作的基础 保存遗传资源 胚胎低温冷冻技术在生产中的应用，可以不受时间、地点限制，把受精卵或胚胎进行长期保存和运输，胚胎移植将变得更实用。

8.3.1 胚胎移植的目的 1、发挥优良母畜的繁殖潜力 母牛的生殖细胞几万个，一生仅可繁殖10胎左右。 超排，平凡品质的“借腹怀胎”，繁殖增加几十倍。 2、促进家畜改良的速度 3、作为胚胎操作的基础 后代性别控制、受精卵切割、试管畜、转基因畜、 克隆畜——以胚胎移植作基础。

8.3.1 胚胎移植的目的 4、保存遗传资源 5、胚胎低温冷冻技术在生产中的应用，可以不受 时间、地点限制，把受精卵或胚胎进行长期保存和 运输，胚胎移植将变得更实用。

8.3.2 超数排卵 1、雌性哺乳动物卵母细胞与排卵 性成熟时的雌性生殖细胞：胚胎后期，卵巢中的卵原细胞和初级卵母细胞数很大。出生后，不再增加，随着年龄的增长而不断退化。性成熟时，大部分消失，但仍有很多卵原细胞和初级卵母细胞。如狗（万个）70、牛5——7.5、大鼠26。 排卵数/性周期：兔、猪：几——十几个；牛、羊：1个。 卵巢中有大量卵未得到利用。 利用激素——促进更多的卵泡生长、成熟、排卵——超数排卵。

8.3.2 超数排卵 2、各种激素的作用： 孕酮：(类固醇，黄体、胎盘分泌） 促黄体激素（LH）（肽类） 8.3.2 超数排卵 2、各种激素的作用： 孕酮：(类固醇，黄体、胎盘分泌） 促黄体激素（LH）（肽类） 雌二醇（E2）： (类固醇，睾丸、卵泡、黄体、胎盘分泌） 促卵泡激素（FSH）：卵泡生长成熟产生雌激素 促性腺激素释放激素（GnRH）：肽类 前列腺素（PG）（不饱和脂肪酸类）黄体消退、下一轮卵泡的发育排卵 孕马血清促性腺激素（PMSG） 胎盘绒毛膜促性腺素（HCG）

8.3.2 超数排卵 3、神经内分泌系统的相互作用： 环境条件——下丘脑——腺垂体——内分泌腺（包括性腺）——靶器官、组织、细胞。 8.3.2 超数排卵 3、神经内分泌系统的相互作用： 环境条件——下丘脑——腺垂体——内分泌腺（包括性腺）——靶器官、组织、细胞。 （正负控制、动态平衡）

8.3.2 超数排卵 4、超数排卵的方法： 使用FSH（半衰期短，每日皮下或肌肉注射1~2次）数天，促进较多的卵泡发育，再结合应用LH或相似激素——卵泡的最后成熟和排放。近年母牛超数排卵研究较多，不同激素组合如下。 （1）FSH+其他激素（PGF2a 、LH、GnRH）： 牛发情周期第16~20d，每天注射20、10、10、 10 mg FSH + 5mgLH，第5d100mgLH，平均排卵 21枚（4~55），回收用于胚胎移植的卵为53%。 花奶牛发情后9~13d，6.5~7.5mg（依体重而 定，2次/d），3d后注射氯前列腺素烯醇0.4mg和 0.2mg,收集胚胎6.42枚/头。

8.3.2 超数排卵 （2）PMSG + 其他激素（PG、雌二醇、HCG）： PMSG半衰期长，只需注射一次。 8.3.2 超数排卵 （2）PMSG + 其他激素（PG、雌二醇、HCG）： PMSG半衰期长，只需注射一次。 牛的性周期的8~12天（黄体期）注射PMSG，2d 后注射PG促黄体溶解，48h后则发情超数排卵。 PMSG(16~17d) + 雌二醇（19~20d）+ HCG（21d）——排卵33枚/头（14~104），回收率50%。 PMSG：对供体刺激小，费用低，使用方便。但半衰期长（118~123h）,使未排的大卵泡残留卵巢而分泌雌激素——影响回收胚胎的质量，延长卵巢恢复时间和重复超排间隙。大剂量的PMSG尤为严重。1500~3000 IU PMSG,效果较稳定。

8.3.2 超数排卵 影响超数排卵的因素 （1）供体的年龄：3~8岁产奶牛，超排效果好，大于10岁和未产奶牛（青年母牛，卵巢机能、生殖道和操作的困难等所致，改进激素使用方法可改善）明显下降。初情期的大鼠、小鼠、羊比成熟期后的超排效果好，受精率高。 （2）供体品种的差异：排卵率高的动物品种对超排的反应强于正常排卵率低的品种。 （3）激素处理的剂量：通常激素剂量越大，排卵数越多；过剂量激素可抑制排卵，或影响卵的质量，使受精率和可用胚胎的数量明显降低。 （4）卵巢状况：一个发情周期中，卵泡有几个“生长波

8.3.2 超数排卵 （4）卵巢状况：一个发情周期中，卵泡有几个“生长波”。第一波（排卵当天）有一个优势卵泡和几个较小卵泡生长，到发情中期会闭锁。紧接着开始第二个卵泡生长波（一个优势和几个次要卵泡发育） 通常，LH高峰时，第二个波的优势卵泡将排卵，其他卵泡闭锁。之后，发生第三、第四个生长波（第一、第二波的重复）。 不同品种的牛，在一定的卵泡生长波内，次要卵泡的生长差异很大，故超排的效果也不同。 了解（如超声波图谱监测）卵泡的生长波及数量，适时激素处理，阻止次要卵泡的闭锁，可获超排好效果。

部分哺乳动物发情周期的天数、发情持续的天数与排卵时间 动 物 发情周期 发情持续时间 排卵时间 马（春秋多次发情，有全年） 19~23d 4~7d 发情前一天至后一天 牛（全年多次发情） 21d 13~17h 发情结束后12~15h 猪（全年多次发情） 2~3d 发情开始后30~40h（有的18h） 绵羊（秋天多次发情） 16d 30~36h 发情开始后18~26h 山羊（秋天多次发情） 19d 39h 发情开始后9~19h 狗（秋春单次发情） 7~9d 发情开始后1~3d 狐（11~3月单次发情） 2~4d 发情开始后1~2d 兔（全年 多次夏几不发情） 交配后10.5h 水貂（2~3月多次发情） 8~9d 2d 交配后40~50h 猫（季节性多次发情） 4d 交配后24h 猫 15~21d 假如没有交配 小鼠 10h 发情开始后2~3h 大鼠 13~15h 发情开始后8~10h

8.3.3 发情的同步化 供体和受体必须同步发情（相同的生殖周期）才可进行胚胎移植，才可使一个供体超数排卵获得的胚胎在多个受体子宫内受孕。 8.3.3 发情的同步化 供体和受体必须同步发情（相同的生殖周期）才可进行胚胎移植，才可使一个供体超数排卵获得的胚胎在多个受体子宫内受孕。 供、受体母牛发情期密切同期，受孕率91.0%；－1d（供体早1d）或+1d分别为52.2%和56.6%。 也有报道：-1d（56.8%）高于同期（42.6%）或+1d（22.7%）的。可能：采集和转移胚胎减缓了胚胎发育的进程，晚发情受体的子宫更合适其着床发育。

8.3.3 发情的同步化 1、自然同步发情： 最理想、省事省力、无药物的副作用。 8.3.3 发情的同步化 1、自然同步发情： 最理想、省事省力、无药物的副作用。 但牛的发情周期21d，必须200~300头空怀母牛群才会每天有5%的发情母牛可作为受体。上千头的大型养牛场才可通过 自然同步发情得到足够的供体母牛。 2、人工药物调控同步发情： 黄体有调节发情周期的关键作用。施用激素——刺激或抑制黄体机能，诱导发情同步化——与 所移植胚胎的发育阶段相适应。

8.3.3 发情的同步化 2、人工药物调控同步发情： （1）孕酮激素类药物：在母畜血液中保持一定量造成人为的黄体期——抑制卵巢内卵泡的发育和成熟。当卵泡发育状态大致处于同一时期时，解除人工抑制，即可同步发情排卵。 给药方式：阴道海绵栓塞、注射、口服、皮下包埋等，连续给药一个发情周期的天数，撤药后母畜相继发情排卵。 但发情期延续7d,配种后受胎率也低。

8.3.3 发情的同步化 2、人工药物调控同步发情： （2）施用PGF2a或类似物促进黄体溶解——使孕酮水平下降——卵泡发育趋向一致——母畜同步发情排卵。PG对4~5日龄的黄体和自行退化前后的黄体不起作用。所以连续两次（间隔10~12 d）注射PG，48~72h后准时同步发情。 （3）结合上述两种方法，同步发情效果更好。连续12d每天注射孕酮50mg和苯甲酸雌二醇5mg,30h后注射GnRH100μg，25h后开始排卵。

8.3.4 胚胎的采集与检查 超排的母牛在发情的当日晚次日晨，人工受精两次，保证排出的卵受精。 受精卵的发育及在输卵管内移动速度基本同步。 8.3.4 胚胎的采集与检查 超排的母牛在发情的当日晚次日晨，人工受精两次，保证排出的卵受精。 受精卵的发育及在输卵管内移动速度基本同步。 输卵管——子宫双冲洗法，冲出输卵管和子宫角的受精卵或胚胎。 人工采集的胚胎：直接移植给 受体、冷冻保存用于以后移植。 采集回收胚胎：外科手术法、非手术回收法。

部分哺乳动物早期发育时间表 种类 2胞期 4胞期 16胞期 小鼠 21~23h 大鼠 * 由排卵时计算，+由受精时计算，其余由交配时计算 进入子宫 胚泡期 着 床 分娩（怀孕天数） 时期 状态 小鼠 21~23h 38~50h 60~70h 1.5d 桑葚胚 66~82h 4~5 19~21d 大鼠 1~2d 2~3d 4d 3d 4.5d 5~6d 22d 兔 21~25h 25~32h 40~47h 2.5~4d 胚泡 75~96h 7~8d 30~32d 马* 24h 30~36h 98~100h 8~9w 345d 牛 27~42h 50~83h 3~4d 8~16细胞 8~9d 30~35d 277~300d 绵羊 38~39h 42h 77~96h 16细胞 6~7d 17~18d 144~152d 猪 25~51h 4细胞 11d 112~115d 猫 40~50d 4~8d 13~14d 52~63d 貂 8d 32细胞 25d 42d 猴 20~49h 24~52h 4~6d 9~11d 164d 人+ 2d 5~8d 7~7.5d 8~13d 256±14d 270±14d * 由排卵时计算，+由受精时计算，其余由交配时计算

部分哺乳动物发情周期的天数、发情持续的天数与排卵时间 动 物 发情周期 发情持续时间 排卵时间 马（春秋多次发情，有全年） 19~23d 4~7d 发情前一天至后一天 牛（全年多次发情） 21d 13~17h 发情结束后12~15h 猪（全年多次发情） 2~3d 发情开始后30~40h（有的18h） 绵羊（秋天多次发情） 16d 30~36h 发情开始后18~26h 山羊（秋天多次发情） 19d 39h 发情开始后9~19h 狗（秋春单次发情） 7~9d 发情开始后1~3d 狐（11~3月单次发情） 2~4d 发情开始后1~2d 兔（全年 多次夏几不发情） 交配后10.5h 水貂（2~3月多次发情） 8~9d 2d 交配后40~50h 猫（季节性多次发情） 4d 交配后24h 猫 15~21d 假如没有交配 小鼠 10h 发情开始后2~3h 大鼠 13~15h 发情开始后8~10h

8.3.4 胚胎的采集与检查 1、外科手术回收法： 母畜全身麻醉，仰卧固定，在乳腺与脐间中线切口10~15cm，剖腹引出子宫角和输卵管，在近子宫体处夹住子宫角,从输卵管伞部插入玻璃导管,注射器针头插入子宫角内,冲卵液向输卵管的反方向冲洗,含胚胎或受精卵的冲卵液通过玻璃导管流出。 操作方便,冲卵液用量少,容易检卵,回收率较高。 需全身麻醉,剖腹后形成组织粘连和瘢痕,术前需空腹一天。

8.3.4 胚胎的采集与检查 2、非手术回收法：借助采卵器从阴道到子宫角采集胚胎。 8.3.4 胚胎的采集与检查 2、非手术回收法：借助采卵器从阴道到子宫角采集胚胎。 自1972年（Sugie）创造牛的非手术采卵法以来，经30余年逐渐完善。 采卵器：一气囊充气将子宫腔堵住，防止冲卵液流出，用一条导管向子宫角输入冲卵液，由原导管或另一条导管收集冲卵液及胚胎。 操作：将牛固定并清除直肠内的粪便，普鲁卡因等麻醉剂作荐尾间隙硬外膜麻醉，将采卵器经阴道、子宫颈插入子宫，借助另一只手从直肠把采卵器固定在正确位置，充一定空气膨胀气囊，由导管注入冲卵液（培养液即可）。

8.3.4 胚胎的采集与检查 提高回收率：将冲卵液分几次注入反复冲洗子宫，同时用伸在直肠中的手提起子宫角，使冲洗完全，并防止冲卵液流入输卵管内。同样方法冲洗另一侧子宫。 收集的冲卵液在37℃恒温箱中静置20min，解剖镜下检卵。 采卵率可达50%左右（依黄体数计算）。操作技术好的可达60~70%，基本达到手术的回收率。母畜受伤害较小，可重复多次采卵，方便简短。 但采卵率较不稳定，有时采卵率低；只能采得子宫内的胚胎，较早期（输卵管内）的胚胎不能用此法；体形较小的家畜不能用此法。

8.3.4 胚胎的采集与检查 3、胚胎的检查 回收胚胎不着床、不发育的原因： （1）受精卵（精子、卵子）质量（遗传缺陷，正常繁殖时也有）。 8.3.4 胚胎的采集与检查 3、胚胎的检查 回收胚胎不着床、不发育的原因： （1）受精卵（精子、卵子）质量（遗传缺陷，正常繁殖时也有）。 （2）药物诱导超排——多个卵泡同时成熟排卵，某些卵可能并未完全成熟即排出，因而不能受精或停止在早期阶段。 （3）采集时胚胎可能受伤。

8.3.4 胚胎的采集与检查 实体显微镜下检查胚胎。 正常胚胎的形态：外观饱满、透明带完整、卵间隙小、卵裂球大小一致、界限清楚、透亮、充实、细胞质均匀、无明显颗粒状物。 发育不正常的胚胎：外观 不饱满、透明带变形、卵间隙大、细胞质有些混浊、卵裂球不清楚透明、有些破碎的快状物。

8.3.4 胚胎的采集与检查 通常，胚胎的发育阶段应该是基本一致的。 超排的卵，排卵的时间和在输卵管内运动的速度会有差异，胚胎的发育阶段也有差异。只要胚胎形态正常，都可用来移植。

8.3.4 胚胎的采集与检查 胚胎形态、发育时期正常，移植后成活的可能性最大。但并非形态稍差的胚胎就一定不能作为移植胚胎用。 8.3.4 胚胎的采集与检查 胚胎形态、发育时期正常，移植后成活的可能性最大。但并非形态稍差的胚胎就一定不能作为移植胚胎用。 早期胚胎有较大的调整性，有些小的缺陷可在发育中弥补而继续发育。因而，卵裂球形态基本正常、其他形态有些问题的胚胎也可用来移植，往往也能使受体受孕。

8.3.5 移植胚胎 受体：同步发情，（尽可能）生殖道正常、发情周期有规律、繁殖史良好、无疾病的母牛（畜）和移植前后加强 同步管理、补充精细饲料营养。

8.3.5 移植胚胎 1、手术法移植胚胎：与胚胎采集法相似。全麻，切口，仔细拉出子宫和输卵管，在移植部位用钝形针头刺一小孔，吸有胚胎的细管插入穿刺孔，小心输入胚胎。重要原则：移植胚胎的部位应与正常胚胎发育时部位一致——采集于哪里则移植到哪里——输卵管采集的卵子则移植入输卵管，自子宫角采集的胚胎则移植到子宫角。 优点：移卵容易、损伤小、受体为非优良品种（损失小）、成功率比非手术法高。

8.3.5 移植胚胎 2、非手术法移植胚胎：借助移植器。现已解决了移植器通过子宫颈的困难和子宫肌肉运动排出胚胎的问题，成功率明显提高。 8.3.5 移植胚胎 2、非手术法移植胚胎：借助移植器。现已解决了移植器通过子宫颈的困难和子宫肌肉运动排出胚胎的问题，成功率明显提高。 只能移植5日龄以上的胚胎（？）；体格较小的动物不能用此法（？）。

8.4 试管动物 试管动物（in vitro animal）：又称体外受精动物（ in vitro fertilization animal ），在体外人工控制的环境条件下，精子和卵子完成受精，胚胎早期培养和移植，所获得的哺乳动物。 与胚胎移植所获动物不同：供体获得精子和卵子，经成熟培养，体外人工条件下受精，早期胚胎培养和胚胎移植于受体子宫内。

8.4 试管动物 体外受精技术的历史： 1878年（Schenk）兔和豚鼠——级体的排除和卵裂； 8.4 试管动物 体外受精技术的历史： 1878年（Schenk）兔和豚鼠——级体的排除和卵裂； 1959年（张觉明）兔——体外受精、胚胎移植、试管兔； 1982年（Brackett）手术法取卵母细胞——试管牛。 迄今已有近十种动物获得了试管动物。

8.4 试管动物 试管婴儿： 1978年7月26日诞生了第一例“试管婴儿”（英国，Edward和Steptoe,经20多年的努力）。 8.4 试管动物 试管婴儿： 1978年7月26日诞生了第一例“试管婴儿”（英国，Edward和Steptoe,经20多年的努力）。 此后，人类的体外受精和胚胎移植物技术得到进一步的发展和广泛的应用。 1985年4月，我国台湾省第一例试管婴儿。 1988年8月，我国北京医科大学试管婴儿。 试管婴儿技术的应用给一部分不育症患者带来了福音。

8.4 试管动物 试管动物的意义： 受精生物学、早期胚胎发育技术等理论 研究基础上发展建立了体外受精和胚胎发育技术——试管动物。 8.4 试管动物 试管动物的意义： 受精生物学、早期胚胎发育技术等理论 研究基础上发展建立了体外受精和胚胎发育技术——试管动物。 （1）理论意义 ：反过来促进了基础理论的认识。 体外受精，能在显微镜下观察受精的动态过程，人工控制条件，研究受精和早期发育的因果关系以及生理、生化变化。

8.4 试管动物 （2）实际意义： 获得充足的良种动物和濒危动物的胚胎； 工厂化批量生产满足胚胎移植的需要； 8.4 试管动物 （2）实际意义： 获得充足的良种动物和濒危动物的胚胎； 工厂化批量生产满足胚胎移植的需要； 建立动物优质基因库——贮存优良品种的生殖细胞，生产父母遗传背景清楚的良种胚胎； 为胚胎分割、胚胎嵌合、性别控制、核移植、基因导入等技术提供充足的实验材料。

8.4 试管动物 试管动物的主要技术环节： 精子的采集与体外获能处理； 卵子（超排处理）的回收、采集与成熟培养； 精子与卵子的体外受精 8.4 试管动物 试管动物的主要技术环节： 精子的采集与体外获能处理； 卵子（超排处理）的回收、采集与成熟培养； 精子与卵子的体外受精 受精卵（早期胚胎）的体外发育； 试管胚胎的移植。

8.3.2 试管动物的培育流程 采集受精卵 人工受精 雌性受体的选择 体内发育与后代 与胚胎移植 降生 分类、体外培养 或胚胎冷冻、保存 8.3.2 试管动物的培育流程 雌性供体的超排卵处理 采集受精卵 人工受精 良种雄性供体人工取精 雌性受体的选择 与胚胎移植 体内发育与后代 降生 分类、体外培养 或胚胎冷冻、保存

8.4 .1 精子的体外获能 近年来，精子获能机制逐渐解析，生殖道液体中诱发获能和顶体反应的因子逐渐明确，体外获能技术日趋成熟。 8.4 .1 精子的体外获能 近年来，精子获能机制逐渐解析，生殖道液体中诱发获能和顶体反应的因子逐渐明确，体外获能技术日趋成熟。 复杂的精子获能过程主要为两个阶段：脱除精子表面抗原物质和去能物质，增强膜的透性；膜蛋白变化——发生顶体反应。 体内获能：自交配母畜子宫内冲取精子用于体外受精。

8.4 .1 精子的体外获能 体外获能： 洗涤精子，离心去杂：杂质、死的活力低的精子、冻精保护液和稀释液； 8.4 .1 精子的体外获能 体外获能： 洗涤精子，离心去杂：杂质、死的活力低的精子、冻精保护液和稀释液； 获能处理：改变精子培养条件或添加诱导精子获能的有效成分的特定培养液完成体外获能。 主要使用高离子强度液、钙离子载体、肝素等，促进Ca2+进入顶体，刺激精子内部pH升高，诱发精子获能。

8.4 .1 精子的体外获能 1、高离子强度液：10ml培养液加37mgNaCl，培养5min，离心5min后洗净，再培养45min~1h。 8.4 .1 精子的体外获能 1、高离子强度液：10ml培养液加37mgNaCl，培养5min，离心5min后洗净，再培养45min~1h。 2、Ca2+ + I-A（钙离子载体， Ca2+ Ionophore A）： I-A与Ca2+ 形成复合物，携带Ca2+ 进入精子，诱发顶体反应。

8.4 .1 精子的体外获能 3、氨基葡聚糖（GAGs）：牛精子体内获能的活化物是输卵管中的GAGs， GAGs中硫酸化程度高的肝素作用最强。肝素与精子顶体帽结合——精子吸收Ca2+,去除精子膜甾体——诱发顶体反应，激活顶体酶。肝素促进精子的运动。 4、血清白蛋白（BSA）：雌性生殖道液的一种主要蛋白成分。获能中去除精子膜上的胆固醇；维持精子活力和超活化运动。

8.4 .1 精子的体外获能 5、精子培育温度：39~40℃范围内培育牛附睾精子，顶体反应高于38~39 ℃。40 ℃培养对精子生存不利，引起顶体变性 6、精子选择法——上浮（swim up）分离法：精液上加少量培养液，年轻的、有活力的精子会游到培养液的上部。

8.4.2 卵母细胞的获得与体外成熟 1、卵母细胞的获得 8.4.2 卵母细胞的获得与体外成熟 1、卵母细胞的获得 （1）屠宰的家畜卵巢中采集：取下卵巢，放入保温瓶的37 ℃生理盐水中，带回实验室。1~4 h(6~7h极限)，时间越长，卵的质量越差。选2~6 mm大小的卵泡，取出卵丘——卵母细胞复合体。 （2）超排——肋部切口——腹腔镜自卵巢取卵母细胞。（卵巢功能正常、输卵管有疾患的妇女可用此法）

8.4.2 卵母细胞的获得与体外成熟 （3）超排——输卵管冲取成熟卵母细胞。 8.4.2 卵母细胞的获得与体外成熟 （3）超排——输卵管冲取成熟卵母细胞。 （4）自活体卵巢中采集卵母细胞——阴道超声波监视穿刺法、内镜、腹腔镜。

8.4.2 卵母细胞的获得与体外成熟 2、卵母细胞的类型与选择： 8.4.2 卵母细胞的获得与体外成熟 2、卵母细胞的类型与选择： 卵丘——卵母细胞复合体（cumulus-oocyte complex, COC）：卵巢中采集的卵母细胞，外面有多层卵丘细胞。 可用于体外培养的：卵丘细胞紧密，胞质均匀，台盼蓝染色不着色，生发泡阶段（电镜观察）的卵母细胞。（核迁移到动物极质膜下，膨大，称生发泡） 退化的不可培养的：卵丘细胞少，脂滴空泡多，微绒毛少或缺如，核固缩，溶酶体增多，或空卵丘团（卵母细胞崩解）。

8.4.2 卵母细胞的获得与体外成熟 3、卵母细胞的成熟： 8.4.2 卵母细胞的获得与体外成熟 3、卵母细胞的成熟： （1）细胞核的成熟：FSH、LH作用下，培养卵母细胞内cAMP上升，此后在生发泡破裂期间，cAMP下降到最低，启动减数分裂。 （第一、二极体？动物极？成熟卵母细胞？）

8.4.2 卵母细胞的获得与体外成熟 （2）细胞质成熟：体外培养时，RNA和蛋白质合成——定位于卵母细胞质中——调控卵母细胞的成熟（激活MPF）、卵裂、早期胚胎发育。 （细胞质定域？卵子的极性？母源基因？灯刷染色体？）

8.4.2 卵母细胞的获得与体外成熟 卵丘细胞参与了卵母细胞的成熟： 8.4.2 卵母细胞的获得与体外成熟 卵丘细胞参与了卵母细胞的成熟： 体外培养时，有多层卵泡细胞包裹的卵母细胞能成熟，没有卵泡细胞的裸卵（牛、兔、羊、猪等）受精后精核虽能去致密，但受精卵不能进一步发育。 在体内或体外，COC在生发泡破裂前后卵内蛋白质图谱发生了变化。体外培养裸卵内没有蛋白质合成的变化

8.4.2 卵母细胞的获得与体外成熟 卵泡细胞对卵母细胞成熟到底起何作用？ 8.4.2 卵母细胞的获得与体外成熟 卵泡细胞对卵母细胞成熟到底起何作用？ （1）成熟分裂抑制因子（oocyte maturation inhibitor，OMI）（Naito，1988）： 卵泡细胞和卵泡液中，有分子量小于2000的多肽，可耐60℃高温，反复冷冻、解冻不破坏其活性。体内排卵前促性腺激素含量达高峰时，其活性失去。体外时，卵丘细胞扩散使间隙联结破坏，OMI从卵泡细胞进入卵母细胞的通道被切断，卵母细胞解除抑制恢复减数分裂。

8.4.2 卵母细胞的获得与体外成熟 （2）促进卵母细胞质成熟因子： 8.4.2 卵母细胞的获得与体外成熟 （2）促进卵母细胞质成熟因子： 卵泡细胞和卵泡液中含有。显著提高卵母细胞受精后原核形成率（激素不能代替）。 （卵泡液中含多种生长因子、类固醇激素、促性腺激素） 卵母细胞体外成熟离不开卵泡细胞——这一结论是一致的。

8.4.2 卵母细胞的获得与体外成熟 推测卵母细胞成熟的四个途径（Thibault,1989）: 8.4.2 卵母细胞的获得与体外成熟 推测卵母细胞成熟的四个途径（Thibault,1989）: 修饰卵丘细胞中抑制物（如OMI）的生物活性； 切断卵母细胞与卵泡细胞之间的联系； 抑制卵丘细胞合成/加工活性抑制物（如OMI）的能力； 改变卵丘细胞与卵之间的联系。

8.4.2 卵母细胞的获得与体外成熟 促进牛卵母细胞体外成熟和提高受精率：加犊牛血清（FCS）、发情牛血清（ECS）、牛血清白蛋白（BSA）。 提高卵母细胞成熟率：加LH、HCG、类固醇激素、PMSG。 加FSH：刺激卵丘细胞间质中的透明质酸分解，使卵丘细胞扩散，提高精子的穿卵率。 激素：部分或全部解除卵泡液中抑制因子的抑制作用。

8.4.2 卵母细胞的获得与体外成熟 影响卵细胞发育的生长因子和细胞因子： 表面生长因子（EGF）、 血小板生成因子（PDGF）、 8.4.2 卵母细胞的获得与体外成熟 影响卵细胞发育的生长因子和细胞因子： 表面生长因子（EGF）、 血小板生成因子（PDGF）、 转化生长因子（TGF-1、a、β）、 碱性成纤维生长因子（IGFⅠ、Ⅱ）、 白细胞介素（IL-1、IL-6）、 类胰岛素生长因子（IGF Ⅰ、Ⅱ ）、 纤维蛋白原激活因子（PA）等。

8.4.2 卵母细胞的获得与体外成熟 4、卵母细胞 体外成熟的方法： COC的初期质量：决定卵母细胞的成熟能力和以后受精能力的重要因素。 8.4.2 卵母细胞的获得与体外成熟 4、卵母细胞 体外成熟的方法： COC的初期质量：决定卵母细胞的成熟能力和以后受精能力的重要因素。 对COC的要求是：足够大的卵泡中收集COC，卵质均匀、透明带不变形、有多层致密而完整的卵丘细胞包裹。

8.4.2 卵母细胞的获得与体外成熟 卵母细胞体外培养的基础培养液： 8.4.2 卵母细胞的获得与体外成熟 卵母细胞体外培养的基础培养液： 通常用于动物细胞培养的培养液大多可。如BM0C-3、PBI、Ham′s-F10、 Ham′s-F12、TCM-199、Tyrod′s液等。 不同种动物卵母细胞体外成熟培养的成分有差异。

8.4.2 卵母细胞的获得与体外成熟 牛卵母细胞体外成熟培养： 8.4.2 卵母细胞的获得与体外成熟 牛卵母细胞体外成熟培养： TCM-199基础培养液，添加丙酮酸、硫酸氢钠、庆大霉素、成熟率达90%以上。 添加颗粒细胞、体细胞、输卵管单层细胞、输卵管细胞上清液可提高其成熟率，且影响受精卵和早期胚胎发育。 加排卵前后（LH高峰后）牛卵泡液的效果如同加激素。 多数时：加FCS与LH、FSH、E2结合使用。

8.4.2 卵母细胞的获得与体外成熟 猪卵母细胞体外成熟培养（成功较晚）： 8.4.2 卵母细胞的获得与体外成熟 猪卵母细胞体外成熟培养（成功较晚）： 加卵泡液、雌激素等，成熟与受精可达80%。但多精入卵率达60%，体外受精卵裂率仅20~30%之间。 加PMSG,提高成熟率。 加猪卵泡液（PFF）成熟率相差无几，但可提高受精后的桑葚胚率。 加FCS和PMSG明显提高受精率。

8.4.2 卵母细胞的获得与体外成熟 山羊：与牛不同。 8.4.2 卵母细胞的获得与体外成熟 山羊：与牛不同。 加HCG 1 IU/ml、E21μg/ml、BSA10mg/ml，成熟率达79.4%。 加雌激素明显提高成熟率。 加发情羊血清（EGS）好于牛血清。

8.4.2 卵母细胞的获得与体外成熟 卵母细胞体外培养的外界环境要求——温度、pH、渗透压、气相等。 8.4.2 卵母细胞的获得与体外成熟 卵母细胞体外培养的外界环境要求——温度、pH、渗透压、气相等。 温度：35~40℃均可，37~39 ℃时卵的发育最好，39 ℃时可达80%。39~39.5 ℃（稍高于体温），第二极体排出率高，胚胎发育好。 pH：pH7.7时，卵子发育率（至中期Ⅱ）显著高于pH7.1、7.4和7.8。

8.4.2 卵母细胞的获得与体外成熟 渗透压：330mOsm/kg最利于卵子发育（300m Osm/kg ~ 320mOsm/kg相比） 8.4.2 卵母细胞的获得与体外成熟 渗透压：330mOsm/kg最利于卵子发育（300m Osm/kg ~ 320mOsm/kg相比） 气相（与细胞培养相同）：5%CO2和95%的空气或5%CO2、5%O2和90%N2 。CO2——稳定pH、不纯对卵母细胞和胚胎有毒。 湿度（防止培养液水分蒸发）：95~100%。 三蒸水、高度无菌。

8.4.2 卵母细胞的获得与体外成熟 卵母细胞体外培养成熟的标志：一般是卵丘细胞扩张、第一极体排出。 8.4.2 卵母细胞的获得与体外成熟 卵母细胞体外培养成熟的标志：一般是卵丘细胞扩张、第一极体排出。 但减数分裂的完成仅仅是其成熟的一个方面，卵内细胞学的变化、蛋白质和RNA的合成与贮备是正常受精和卵裂的先决条件。 判断卵成熟的唯一无可非议的标准：卵受精后能否正常卵裂、发育和产仔。

8.4.3 体外受精 体外受精：成熟的卵母细胞、获能的精子、合适的体外环境，共培养，完成受精。 受精成功的标志：受精卵是否可发育至囊胚阶段。

8.4.3 体外受精 1、体外受精的基础培养液及其添加成分： TCM-199、TALP、Tyrodes、BO、BMOC-3等。 8.4.3 体外受精 1、体外受精的基础培养液及其添加成分： TCM-199、TALP、Tyrodes、BO、BMOC-3等。 犊牛血清10%，载体蛋白来源； 葡萄糖或/和丙酮酸，能量来源； 有时加氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素、血清或血清白蛋白（复合培养基）。 FSH、肾上腺素、亚牛磺酸、肝素，利于精子穿透。

8.4.3 体外受精 2、精子的密度与受精率： 猪，共培养48h：2×105 /ml：受精率40.8%； 1×106 /ml，45%； 5×106 /ml，30.5%。 3、体内正常受精时多精受精的阻断： 快速短暂不完全阻断——卵的静息膜电位迅速去极化；形成受精膜——卵质膜内的皮质颗粒破裂，发生胞吐作用。 4、多精受精——体外受精的难点——使卵裂和发育受阻——影响因素不十分清楚，可能与卵子和精子的完全成熟有关。

8.4.3 体外受精 （1）卵母细胞的成熟与多精受精的关系：卵母细胞成熟培养44h，多精受精率58%；培养48h ,为34%。 8.4.3 体外受精 （1）卵母细胞的成熟与多精受精的关系：卵母细胞成熟培养44h，多精受精率58%；培养48h ,为34%。 可考虑卵的成熟时间延长4~6h。 体外受精最显著的异常——皮质颗粒释放异常或没有释放——导致多精受精——大部分不能发育至囊胚期。皮质反应的失败是卵子未完全成熟的反映。

8.4.3 体外受精 （2）精子获能处理时间、精子密度、精——卵共培养时间、培养液的pH、离子强度等影响多精受精。 8.4.3 体外受精 （2）精子获能处理时间、精子密度、精——卵共培养时间、培养液的pH、离子强度等影响多精受精。 精子密度：猪体外获能精子2×106/ml时，受精率82%，其中85%是多精受精；精子密度降至2×105/ml时，多精受精率有所降低，但受精率、雄雌原核形成率也降低。

8.4.3 体外受精 共温育时间：超过6h，多精受精率增加（12h时，达71%）。 8.4.3 体外受精 共温育时间：超过6h，多精受精率增加（12h时，达71%）。 pH：高于或低于pH7.4，增加多精受精率。pH7.4多精受精率48%，pH7.8时79%（受精率无差异） Ca2+浓度：明显影响多精子受精。但高Ca2+（电镜观察）所诱发的皮质反应也不完全。

8.4.3 体外受精 体外受精的通常方法： 100μI培养液+20枚左右卵+获能的精子——覆盖液体石蜡，39℃，C02培养箱内培养6h左右取出受精卵，转入发育培养基培养。

8.4.3 体外受精 5、辅助技术——提高受精率、降低多精受精率： （1）透明带技术：人工方法破坏透明带，精子通过破损处进入卵子并受精。 8.4.3 体外受精 5、辅助技术——提高受精率、降低多精受精率： （1）透明带技术：人工方法破坏透明带，精子通过破损处进入卵子并受精。 机械法——锋利的微型玻璃针切开、切除部分透明带； 化学溶解法——透明质酸去除卵丘，酸性Tyrode氏液溶解局部透明带； 激光法——193nm的氟化氩激光束准确破坏透明带，对周围组织无损害和致热效应

8.4.3 体外受精 （2）透明带下受精技术：微注射器将3~5个精子直接注入透明带下的卵间隙。对少精、精子严重畸形的，可提高正常受精率。 8.4.3 体外受精 （2）透明带下受精技术：微注射器将3~5个精子直接注入透明带下的卵间隙。对少精、精子严重畸形的，可提高正常受精率。 卵浆内注射精子技术：单个精子，可避免多精受精。

8.4.4 受精卵的体外培养 试管动物的三个阶段的体外培养：精子、卵子；受精；受精卵早期发育。 8.4.4 受精卵的体外培养 试管动物的三个阶段的体外培养：精子、卵子；受精；受精卵早期发育。 1、正常体内受精卵的发育：受精处？发育和移动？ 胚胎外的卵泡细胞逐渐脱落，透明带保持，处于输卵管分泌物的营养环境中。不同动物进入子宫的胚胎发育阶段不同（多为4~16卵裂球期），胚胎嵌在子宫内膜的褶襞处（不马上着床），靠子宫腺分泌物——子宫乳营养。

8.4.4 受精卵的体外培养 至囊胚早期左右，自透明带中脱出，分化出内细胞团和滋胚层，称胚泡。 8.4.4 受精卵的体外培养 至囊胚早期左右，自透明带中脱出，分化出内细胞团和滋胚层，称胚泡。 滋胚层细胞与子宫内膜建立联系，固着在子宫壁上，称着床。

8.4.4 受精卵的体外培养 目前，还不能模拟子宫的内环境供胚胎的继续发育，胚胎移植的最晚期是胚泡期。 8.4.4 受精卵的体外培养 目前，还不能模拟子宫的内环境供胚胎的继续发育，胚胎移植的最晚期是胚泡期。 体外由受精卵培养至胚泡是 件不容易的事情。体外完全模拟输卵管和子宫环境是困难的。 体外胚胎发育阻滞：体外培养的哺乳动物早期胚胎有发育阻滞现象，各种动物出现在不同胚胎发育阶段。

8.4.4 受精卵的体外培养 胚胎体外培养阻滞期：相当于胚胎由输卵管——子宫角的时期；正好是母源基因——合子基因过渡期（卵母细胞贮存的遗传信息控制胚胎发育过渡到受精后胚胎基因的启动的阶段）。 胚胎体外培养阻滞：获得有活力的可移植可操作胚胎的成功率很低——克服胚胎体外阻滞是关键。

8.4.4 受精卵的体外培养 克服胚胎体外阻滞现象（满足早期胚胎发育所需物质）的方法：改进培养液成分和改善培养条件；与体细胞或体细胞条件液共培养。 1、改进培养液成分和培养条件： 胚胎体外培养的基础培养液仍然是常用的合成培养液，pH7.1~7.4，加10~20%小牛血清或BSA，加碳酸氢盐稳定pH。

8.4.4 受精卵的体外培养 （1）生长因子：添加生长因子明显促进受精卵体外发育。胚胎细胞有多种生长因子受体。体内发育时，输卵管和胚胎可分泌生长因子。 但各种生长因子的性质和作用有待进一步研究，目前未达到满意的程度。

8.4.4 受精卵的体外培养 （2）添加能量物质： 常用葡萄糖、丙酮酸、乳酸、氨基酸。 8.4.4 受精卵的体外培养 （2）添加能量物质： 常用葡萄糖、丙酮酸、乳酸、氨基酸。 不同种动物的胚胎、不同发育时期，这些能量物质的作用并不同（促进或抑制）。 谷氨酰胺可使仓鼠、牛胚胎通过阻滞期。 牛磺酸、亚牛磺酸促进猪胚胎发育。

8.4.4 受精卵的体外培养 （3）无机盐离子与渗透压： 渗透压的主要维持者，直接或间接参加胚胎的代谢过程。 8.4.4 受精卵的体外培养 （3）无机盐离子与渗透压： 渗透压的主要维持者，直接或间接参加胚胎的代谢过程。 Na+/K+比影响胚胎的发育。Ca2+和Mg2+是胚胎发育所必需的。渗透压通常在250~300mOsm之间。 （4）气相环境、血清种类、维生素等。 所有体外培养条件都是一些不完整的资料，可靠的规律有待今后的研究发现。

8.4.4 受精卵的体外培养 2、与体细胞或体细胞条件培养液共培养： （1）与体细胞共培养： 8.4.4 受精卵的体外培养 2、与体细胞或体细胞条件培养液共培养： （1）与体细胞共培养： 颗粒细胞：从卵巢中取出COC，放在平皿中挑选，会散落颗粒细胞，两次离心洗涤收集颗粒细胞，置于培养液中培养，贴壁形成单层。支持前三次卵裂。？

8.4.4 受精卵的体外培养 输卵管上皮细胞（OEC）：自屠宰场取输卵管，解剖刀刮其内腔获得OEC，培养液清洗3次，培养过夜，即可与受精卵共培养。或用胰蛋白酶、胶原酶消化输卵管上皮细胞组织获得OEC。为8胞期后的发育提供更多的支持，尤其是通过发育阻滞期。？ （体内的发育过程？）

8.4.4 受精卵的体外培养 OEC：鞭毛类细胞（作用？）和分泌细胞。 8.4.4 受精卵的体外培养 OEC：鞭毛类细胞（作用？）和分泌细胞。 分泌细胞：无鞭毛，分泌物形成输卵管腔内液，含有胚胎正常发育所需的信号分子或胚胎营养因子（embryotrophic factor, EF）。

8.4.4 受精卵的体外培养 已证实牛、羊输卵管上皮细胞，随生殖周期而周期性地合成并分泌两种蛋白质因子，能与早期胚胎（受精卵）透明带结合，并穿入透明带与各卵裂球结合。其低分子量的EF允许发育到5~8-胞期，高分子量的自8-胞期到囊胚。 其他体细胞：胚胎滋养层细胞、子宫内膜细胞、肾细胞、成纤维细胞。对胚胎发育有不同的支持作用。（但不如输卵管细胞有效）

8.4.4 受精卵的体外培养 （2）与体细胞条件培养液共培养：体细胞条件培养液有促进胚胎体外发育的作用。 8.4.4 受精卵的体外培养 （2）与体细胞条件培养液共培养：体细胞条件培养液有促进胚胎体外发育的作用。 猪胚胎（1-和2-细胞期）培养至4-细胞期：纯输卵管液（OVF）——40%；25%OVF和不加OVF的两组——83.3~100%。继续发育至6~7d时，各组差异不大。因此认为：纯输卵管液中有一或多种对早期胚胎发育有抑制作用或有毒成分。最早的几次卵裂，颗粒细胞的作用？

8.4.4 受精卵的体外培养 体细胞能支持体外培养胚胎克服发育阻滞。 其机理仍不很清楚。 8.4.4 受精卵的体外培养 体细胞能支持体外培养胚胎克服发育阻滞。 其机理仍不很清楚。 其可能原因：提供生长因子（已知和未知的）；能去除培养液或条件培养液中的抑制成分；同时提供生长因子和去除抑制成分（可能是通过阻滞期的真正原因）。 早期胚胎发育受阻现象虽得到了一定的克服，但不能象体内那样有效发育。 体外培养技术的日臻完善——还需精子获能、卵细胞成熟、受精卵发育等方面的进一步研究。

8.4.5 胚胎移植 方法？ 原则？ 最适宜时期：8-细胞以上的胚胎。 移植到子宫角前端，受胎率明显提高。 8.4.5 胚胎移植 方法？ 原则？ 最适宜时期：8-细胞以上的胚胎。 移植到子宫角前端，受胎率明显提高。 非手术法（输卵枪）移植晚期桑葚胚或早期囊胚。

8.5 生殖细胞与胚胎的冷冻保存 低温（非结冻）或超低温（结冻）降低或抑制精子新陈代谢，延长体外精子的寿命。 8.5.1 意义 8.5 生殖细胞与胚胎的冷冻保存 低温（非结冻）或超低温（结冻）降低或抑制精子新陈代谢，延长体外精子的寿命。 8.5.1 意义 冷冻保存哺乳动物精子、卵母细胞、早期胚胎技术的成熟，才可不受环境、地域、时间季节等的限制，进行人工受精、胚胎移植，生产试管动物，加速改良家畜品种、良种繁殖、提高质量和产量。

8.5 .2 精液冷冻保存技术 1、低温（非结冻状态）保存：常0~5℃进行。 8.5 .2 精液冷冻保存技术 1、低温（非结冻状态）保存：常0~5℃进行。 以前常用。保存时间不长。但因简便，在不长的时间内即进行人工受精时，仍采用。 10~13%甘油脱脂乳稀释牛精液，14d仍有较强的受精能力。 含咖啡因脱脂乳缓冲糖液保存精液，6~7 ℃时，维持生存最长519h。

8.5 .2 精液冷冻保存技术 2、超低温冷冻保存技术： 1951年（Pole）第一头冷冻精液受精小牛出生。 1962年，颗粒精液。 8.5 .2 精液冷冻保存技术 2、超低温冷冻保存技术： 1951年（Pole）第一头冷冻精液受精小牛出生。 1962年，颗粒精液。 1964年，塑料细管保存精液。 60年代开始，冷冻精液成为国际贸易的新商品。 我国黑龙江省畜牧所（1959年）用含卵黄、甘油的葡萄糖溶液成功保存马精液（-79 ℃ 干冰）。 必须克服冷冻——解冻对精子的形态、生理、生化、功能上的伤害。

8.5 .2 精液冷冻保存技术 （1）稀释液和低温保护剂的选择： 精清对精子的保护是有限的。应用专门溶液稀释精液，并添加低温保护剂。 8.5 .2 精液冷冻保存技术 （1）稀释液和低温保护剂的选择： 精清对精子的保护是有限的。应用专门溶液稀释精液，并添加低温保护剂。 稀释液基本要求：pH、缓冲能力、渗透压、低温保护性能。 稀释液成分：柠檬酸、卵黄、乳类、糖类（含两种以上）。 低温保护剂（减少对精子的物理伤害）：甘油、乙二醇（EG）、二甲基亚砜（DMSO）、1,2-丙二醇（PD）、牛血清白蛋白。

8.5 .2 精液冷冻保存技术 （2）冷冻方法 ①达“热平衡温度”：低于-60℃。精液接触冷冻面，进行热交换达到平衡。 8.5 .2 精液冷冻保存技术 （2）冷冻方法 ①达“热平衡温度”：低于-60℃。精液接触冷冻面，进行热交换达到平衡。 精液致死性冷冻伤害的危险温区：0~-60 ℃。应快速通过此区，热平衡温度应在此区之下，以保证存活率。 ②达到要求温度后浸入液氮：平衡短暂时间后，精液随冷冻面继续下降，达到要求温度后浸入液氮。

8.5 .2 精液冷冻保存技术 （3）冷冻保存形式： 安瓶型：一瓶一个剂量，使用前不需稀释，不需特别的授精器。 8.5 .2 精液冷冻保存技术 （3）冷冻保存形式： 安瓶型：一瓶一个剂量，使用前不需稀释，不需特别的授精器。 颗粒型：液氮面上一段距离放置冷冻版（控制温度），陆续滴加精液，冻结成颗粒。当精液数增多时，热平衡温度会上升，易进入精液危险区冷冻。冷冻版应热容量大，绝缘性好。 细管型：聚丙烯细管。不易污染，容积小，冷冻快（快速通过危险温区），受胎率高。现已发展为全自动化操作。

8.5 .2 精液冷冻保存技术 （4）冷冻保存温度： 液氮：-196 ℃，保存时间较长。 8.5 .2 精液冷冻保存技术 （4）冷冻保存温度： 液氮：-196 ℃，保存时间较长。 干冰：-79 ℃，可长期贮存，可放入广口保温瓶，便于运输到饲养场受精。 保存时间：理论上可无限保存。但时间过长，难免老化，精子活力下降。一般1~2年。可维持4~5年。

8.5 .2 精液冷冻保存技术 （5）解冻方法： ①解冻温度：室温（或0~5 ℃ ），或38~40 ℃。 ②原则： 8.5 .2 精液冷冻保存技术 （5）解冻方法： ①解冻温度：室温（或0~5 ℃ ），或38~40 ℃。 ②原则： 缓慢冷冻（发生失水）的精液——缓慢解冻（复水）。 快速冷冻，失水少，体积变化不大，细胞内形成冰晶小——快速解冻，防止重复结晶损害细胞结构 。 目前颗粒或细管冻精都是快速冷冻。 ③解冻液：柠檬酸钠溶液，消毒牛乳。

8.5.3 胚胎冷冻保存技术 胚胎细胞质比精子丰富，且不同种动物的卵子和胚胎体积、结构、所含成分不同，冷冻条件要求有差异，故其保存难度更大。 8.5.3 胚胎冷冻保存技术 胚胎细胞质比精子丰富，且不同种动物的卵子和胚胎体积、结构、所含成分不同，冷冻条件要求有差异，故其保存难度更大。 保存胚胎比精子更具优越性：不受地域限制可获得纯种胚胎——相当于活畜，纯种母畜。 经近30年研究，已有20余种动物胚胎获得长期保存。

8.5.3 胚胎冷冻保存技术 1、常规降温胚胎冷冻保存技术： （1）防冷冻剂： 8.5.3 胚胎冷冻保存技术 1、常规降温胚胎冷冻保存技术： （1）防冷冻剂： 小分子有机物 ，可渗入细胞，无害。如甘油、丙二醇、乙二醇、DMSO等。蔗糖不渗入细胞，但配合使用可提高效果。可单独也可配合使用。 保护作用的机理不清。 浓度：1.0~1.6mol/L。 胚胎直接浸入，细胞先失水而体积变小（因溶液高渗），5~8 min后复原（？）。

8.5.3 胚胎冷冻保存技术 （2）胚胎的降温、植冰和冷冻： 降温：从室温始，1℃/min速度降温至-7℃。 8.5.3 胚胎冷冻保存技术 （2）胚胎的降温、植冰和冷冻： 降温：从室温始，1℃/min速度降温至-7℃。 植冰：胚胎外冷冻保护剂先冻结，细胞慢慢冷却，并开始失水收缩，防止形成较大冰晶。植冰数min（不等）。 再降温冷冻保存：0.3 ℃/min降温至-30 ℃（达投入液氮前温度），直接投入液氮保存。 现有全自动计算机程序控制的自动冷冻装置。

8.5.3 胚胎冷冻保存技术 （3）胚胎的解冻： 缓慢冷冻的胚胎失水过度，则应缓慢解冻复水。反之亦然。 8.5.3 胚胎冷冻保存技术 （3）胚胎的解冻： 缓慢冷冻的胚胎失水过度，则应缓慢解冻复水。反之亦然。 自液氮中取出装有胚胎的细管，空气平衡6 s，温水浴解冻

8.5.3 胚胎冷冻保存技术 （4）防冻剂的脱除： 胚胎需脱除防冻剂，在培养液中恢复，培养，或移植。 8.5.3 胚胎冷冻保存技术 （4）防冻剂的脱除： 胚胎需脱除防冻剂，在培养液中恢复，培养，或移植。 ①一步法：细管内加0.25~1.5mol/L蔗糖，胚胎细胞内的甘油渗出细胞，不引起渗透压休克。 ②三步法：浓度由高到低逐渐完成（防冻剂添加是相反，浓度递增）？ 不除防冻剂也有较高的受胎率。 是否、如何脱除防冻剂？依防冻剂种类、毒性、胚胎种类而异。

8.5.3 胚胎冷冻保存技术 2、胚胎玻璃化冷冻 保存技术 （1）方法： 8.5.3 胚胎冷冻保存技术 2、胚胎玻璃化冷冻 保存技术 （1）方法： 高浓度的防冻剂渗入细胞，细胞内的水渗出。细胞被防冻剂充塞，冷冻时不形成冰晶而成为均质的玻璃化状态（高粘滞性的冷冻液体）。 （2）优点： 避免了冰晶对生物膜、细胞骨架的伤害； 简化了操作：分阶段降温、植冰； 不需昂贵的胚胎冷冻仪。

8.5.3 胚胎冷冻保存技术 （3）缺点： 高浓度的防冻剂有一定毒性，选择防冻剂及浓度有限制。 （4）玻璃化溶液： 20.5%DMSO 8.5.3 胚胎冷冻保存技术 （3）缺点： 高浓度的防冻剂有一定毒性，选择防冻剂及浓度有限制。 （4）玻璃化溶液： 20.5%DMSO 15.5%乙酰胺 10%丙二醇 6%乙二醇

8.5.4 卵母细胞的冷冻保存 比精子、胚胎的冷冻保存都困难。 未成熟卵母细胞（？）迄今未见成功的报道。 8.5.4 卵母细胞的冷冻保存 比精子、胚胎的冷冻保存都困难。 未成熟卵母细胞（？）迄今未见成功的报道。 成熟卵母细胞（？）：冷冻保存已成功：小鼠（1977年）；人（1986年）；牛（1992年）。

8.5.4 卵母细胞的冷冻保存 1、成熟卵母细胞：MⅡ期卵母细胞。 冷冻保存困难的原因？ 8.5.4 卵母细胞的冷冻保存 1、成熟卵母细胞：MⅡ期卵母细胞。 冷冻保存困难的原因？ 低温或冷冻保存时，纺锤体被破坏，染色单体分不开，形成单倍体。 防冻剂使皮质颗粒过早胞吐，透明带过早硬化，受精率低。 第二极体滞留，（？） 线粒体、微管、囊泡的损伤，受精率低。

8.5.4 卵母细胞的冷冻保存 2、未成熟卵母细胞：？ 不能继续成熟、受精、发育的原因？ 耐冻力差，对冷冻保护剂更敏感。 8.5.4 卵母细胞的冷冻保存 2、未成熟卵母细胞：？ 不能继续成熟、受精、发育的原因？ 耐冻力差，对冷冻保护剂更敏感。 亚细胞结构的损伤：细胞膜、微绒毛、各种细胞器、内含物。 COC卵丘细胞与透明带分离、脱离。

8.5.4 卵母细胞的冷冻保存 3、产生差异的原因？ 可能：卵母细胞越成熟，越接近死亡，代谢率下降，故较耐冻。

8.6 结语 1、胚胎移植 2、超数排卵 3、试管动物 4、胚胎和生殖细胞的冷冻保存 概念、技术方法、原理（基础理论）、理论与实践意义。