(Stem Cell Engineering) 第五章 干细胞工程 (Stem Cell Engineering)

5.1 概述 干细胞是具有自我更新、高度繁殖和多项分化潜 能的细胞群体，是动物有机体和各种组织器官的起 源细胞。 5.1 概述 干细胞是具有自我更新、高度繁殖和多项分化潜 能的细胞群体，是动物有机体和各种组织器官的起 源细胞。 干细胞的研究在生命科学基础理论研究和生产生 活实践等方面具有重要意义。是继人类基因组测序 之后最具活力、影响力和最有应用前景的生命科学 研究领域。

5.1.1 干细胞工程的概念 干细胞是指动物有机体在最初形成发育为完整个体的过程中，始终保留的部分未分化的原始细胞。具有分裂完成自我更新（复制）和分化形成新类型细胞的能力（特性）。 干细胞工程是干细胞生物学和工程学技术相结合发展起来的一种技术，或称为干细胞工程技术。

5.1.2 干细胞的分类与特点 干细胞分类图 根据发育阶段分类 ： 内细胞团（ICM） 胚胎干细胞（ESC） 原始生殖细胞（PGC） 干细胞 5.1.2 干细胞的分类与特点 根据发育阶段分类 ： 内细胞团（ICM） 胚胎干细胞（ESC） 原始生殖细胞（PGC） 干细胞 成体干细胞（ASC）：骨髓、大脑、皮肤、 胰腺、角膜、肝脏、心脏等组织源干细胞 干细胞分类图

5.1.2 干细胞的分类与特点 按分化潜能大小分类： 1. 全能干细胞（totipotent stem cell）：具形成完整 个体的分化潜能。如胚胎干细胞（ESC） 2. 多能干细胞（multipotent stem cell）：具分化出多种细胞组织的潜能，但失去了发育成完整个体的能力（发育潜能受到一定限制）。如骨髓多能造血干细胞（分化出12种血细胞）。 3. 定向干细胞（committed stem cell） ：或单能干细胞、专能干细胞、偏能干细胞。只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化。

5.1.2 干细胞的分类与特点 1. ES细胞（embryonic stem cell）： ES细胞：存在于早期胚胎的内细胞团的全能干细 5.1.2 干细胞的分类与特点 1.  ES细胞（embryonic stem cell）： ES细胞：存在于早期胚胎的内细胞团的全能干细 胞，是一种高度未分化的、与早期胚胎细胞的形态 特征相似、有很强分化能力的细胞系。可无限增殖 并分化成为全身200多种细胞类型，形成机体所有组 织器官。 目前，ES细胞的分离培养及定向诱导分化已成为 干细胞工程领域的热点和难点。是转基因动物、组 织工程、基因治疗、临床移植的细胞来源。

5.1.2 干细胞的分类与特点 2. AS细胞（adult stem cell）： 5.1.2 干细胞的分类与特点 2.  AS细胞（adult stem cell）： 来自成年个体组织的各种多能性干细胞，统称为AS细胞，如造血干细胞，骨髓间质干细胞、神经干细胞。AS细胞也有分化潜能。 AS细胞在细胞治疗方面具有巨大潜力，用于移植具有很多优点。

5.1.2 干细胞的分类与特点 3. EG细胞（embryonic germ cell） 5.1.2 干细胞的分类与特点 3. EG细胞（embryonic germ cell） 从早期胎儿生殖嵴原始生殖细胞(primodial germ cell)分离的多能性干细胞，称为EG细胞。 4. EC细胞(embryonic carcinoma cell) 从自发或诱发的胚胎癌（embryonic carcinoma） 或畸胎瘤(teratocarcinomo)中分离的多能性细胞,称 为EC细胞。 EC细胞起源于生殖细胞和早期胚胎细胞，属于 畸胎瘤干细胞。

5.2 胚胎干细胞的生物学特征 5.2.1 形态结构和核型： ES 细胞形态结构与早期胚胎细胞相似：细胞体积 5.2 胚胎干细胞的生物学特征 5.2.1 形态结构和核型： ES 细胞形态结构与早期胚胎细胞相似：细胞体积 小、核大、核质比高，一或多个核仁，多为常染色 质，细胞质少、结构简单。核型：XX和XY。 体外培养：排列紧密、呈集落状。碱性磷酸酶染色 呈棕红色（成纤维细胞淡黄色）；克隆细胞界限不 清、形态多样。细胞克隆与周围有明显界限。

5.2.2 ES细胞的分化 1、 ES细胞体外培养易分化 抑制其分化：置于饲养层细胞上共培养，维持 其自我更新的增殖状态。 解除分化抑制：有参与各种组织（包括生殖腺 等）的发育潜能，有发育成完整动物个体的能力 发育全能性的标志（鉴定其分化与否）：ES细 胞表面“时相专一性胚胎抗原”（stage-specific embryonic antigen, SSEA）、OCT4基因的表达。

5.2.2 ES细胞的分化 2、ES细胞全能性的体现： （1）形成畸胎瘤：ES细胞注入同源动物皮下→形 成畸胎瘤→三胚层细胞； 物中） →类胚体：似于畸胎瘤，多种系混杂，有三个 胚层组织； （3）直系分化：控制环境条件或基因表达，ES细 胞可直接分化成某一特定种系细胞； （4）嵌合体（chimera）：ES细胞注入同种的囊 胚腔，形成嵌合体。ESC参与各器官的发育。

5.2.3 ES细胞分化的调控 适当因子调控ES细胞的增殖和分化，使其向一 定方向分化发展。 1、内源性调控：外界信号→ES细胞自身的调 控因子反应→调空ESC 的分裂分化。 ESC不对称分裂的调控：细胞的结构蛋白（特 别是腺细胞骨架的成分）调控，将维持干细胞性状 的必须成分分配到子代干细胞中。 转录因子的调控：如哺乳动物早期胚胎表达的 OCT4是胚胎干细胞发生中必须的；白血病抑制因 子（LIF）促进小鼠（不对人）ESC的自我更新。

5.2.3 ES细胞分化的调控 2、外源性调控：其分化还受到周围组织及细 胞外基质等外源因素的影响。 （1）分泌因子：间质细胞分泌的因子维持干 细胞的增殖、分化、存活。如TGF 家族的GDNF (胶质细胞衍生的神经营养因子)决定神经元的存 活与分化以及精原细胞的再生、分化；Wnt（信 号通路）促进干细胞的分化。

5.2.3 ES细胞分化的调控 （2）膜蛋白：介导细胞间的相互接触、通讯作 用。如β-Catenin介导细胞黏附连接，穿膜蛋白 Notch及其配体Delta或jagged影响干细胞分化。 （3）整合素（Integrin）：介导干细胞与细 胞外基质黏附，为其非分化增殖提供了适当的微 环境。如β1整合素失去功能后，上皮干细胞脱 离微环境的制约，分化成角质细胞。

5.3 ES细胞系的建立和体外定向分化的诱导 动 物 桑葚胚 囊 胚 兔 3.5~4d 小 鼠 2.5d 3.5d 牛 6~7d 7~8d 5.3.1.1 ESC的分离培养方法 1、胚胎发育阶段的选择 成功分离ES细胞，首先要 确定胚胎中有足够数量的前 体细胞及其可在体外生长的 精确时期。通常从着床前的 胚泡(桑葚胚、囊胚)中分离 内细胞团（ICM）。不同的 动物，其发育速度不同。 采集不同动物胚胎的时期 动 物 桑葚胚 囊 胚 兔 3.5~4d 小 鼠 2.5d 3.5d 牛 6~7d 7~8d 人 猪 9~10d d: 受精后的天数

5.3 ES细胞系的建立和体外定向分化的诱导 2. ESC的分离： 早期胚胎的处理：通过延迟胚胎附植，采用免疫外科法、组 织培养法、机械剥离法分离ICM，或胚胎去透明带、离散卵裂 球或热休克处理，均可提高ICM和ES细胞的分离效率。 （1）延迟胚胎附植： 在胚胎附植前，摘除卵巢或皮下注射激素——改变母体生殖 激素水平——改变子宫内环境——延迟胚胎附植；并诱导囊胚 恰巧进入附植前的间歇期。延迟附植的囊胚：游离在子宫腔 内，细胞数逐渐增多，形成原始内胚层，但不进一步发育。

裸胚提高ES细胞克隆率：因透明带坚硬不易破裂的 动物，胚胎贴壁慢，影响ICM增殖。脱带有利于ICM 的增殖和ES细胞的分离。 2.  ESC的分离： （2）脱透明带处理：胰酶、透明质酸酶处理或机械 切割——除去透明带——裸胚——培养。 裸胚提高ES细胞克隆率：因透明带坚硬不易破裂的 动物，胚胎贴壁慢，影响ICM增殖。脱带有利于ICM 的增殖和ES细胞的分离。 或裸胚降低ES细胞克隆率：透明带薄易于破裂的胚 胎贴壁不受影响，脱带操作反而影响ICM增殖——降 低ESC的克隆率。

5.3 ES细胞系的建立和体外定向分化的诱导 2. ESC的分离： （3）去滋养层细胞：早期胚胎发育时的囊胚滋养层 细胞分泌——滋胚层蛋白-1和干扰素——抑制ICM增 殖、诱导分化——除去滋养层细胞，可提高ES细胞的 分离效率。方法：免疫外科法、组织培养法、机械剥 离法。 免疫外科法：抗体、补体结合毒性杀伤——除 去滋养层细胞，（抗体不透过囊胚腔）保留ICM。 抗体的制备：抗原（小鼠脾脏细胞悬液、胚胎和胎 盘匀浆）→多次注入兔静脉 →采全血制抗血清。 豚鼠血清有补体。

5.3 ES细胞系的建立和体外定向分化的诱导 2.  ESC的分离： 组织培养法： 小鼠受精2.5天后切除卵巢、给 外源激素，胚胎继续发育，但延缓附植（着床）。子 宫内取胚泡培养，滋养层细胞在培养皿底壁铺展、生 长；ICM细胞垂直向上生长、增殖，形成圆柱状结 构，在显微镜下挑出，消化培养。 显微外科法：小鼠受精后3~4天，子宫内冲取 胚泡，在显微操作仪下从胚泡中吸出ICM细胞培养。

5.3 ES细胞系的建立和体外定向分化的诱导 2.  ESC的分离： （4）离散卵裂球：胰酶消化加机械方法，将桑葚胚 离散成单个卵裂球，在饲养层上进行抑制分化培养。 小鼠桑葚胚（Eistetter,1989）卵裂球分离ES细胞的 效果好于直接培养桑葚胚和囊胚。 但Ito(1996)未能从牛桑葚胚卵裂球分离到ES细胞。 小鼠和牛桑葚胚卵裂球（中晚期）抑制分化培养，形 成亚囊胚，不能获得ES细胞。剥离牛胚胎滋养层细胞 ICM细胞更易分化。

5.3 ES细胞系的建立和体外定向分化的诱导 2.  ESC的分离： (5)热休克法：自输卵管冲取2细胞期或桑葚胚胚 胎，置于较高温度持续培养一段时间，阻滞胚胎分 化。如41℃持续60min，可增加ICM细胞的数量。经 热休克处理后，小鼠2细胞胚胎发育至囊胚率85%。

5.3.1.1 ES细胞的分离培养方法 3. ES细胞的分离培养： 目前，ES细胞的分离培养采取两种方法即饲养 层培养法和无饲养层 培养法。 维持其全能性。 作用成分：各种生长因子——促进增殖；抑制 因子——抑制其分化。

5.3.1.1 ES细胞的分离培养方法 3. ES细胞的分离培养： （1）有饲养层培养： 饲养层（feeder layer）细胞：有效维持ES细胞的 增殖和发育的多能性。SIM小鼠成纤维细胞耐硫代 鸟嘌呤和耐乌苯苷亚系STO或小鼠胎儿成纤维细胞 （MEF），经丝裂霉素C处理90~120min，或用放射 线照射后，不再增殖，但保持合成和分泌促有丝分 裂因子（成纤维细胞生长因子FGF）及分化抑制因 子（白血病抑制因子LIF）。在STO和MEF饲养层 培养液中，对ES细胞分化起主导作用的LIF有相当 高的含量。

5.3.1.1 ES细胞的分离培养方法 3. ES细胞的分离培养： （1）有饲养层培养：在ES细胞建系过程中，可 将胚胎、ICM和ES细胞一直培养在饲养层细胞上。 培养液：基础培养液DMEM添加血清和抗生素 室温或37度培养。 不足：使用饲养层不易获得纯的ES细胞；残留 的丝裂霉素C影响ES细胞的增殖；且常规饲养层细 胞不具耐药性——不能作为转染外源基因的ES细胞 筛选；MEF作饲养层工作量较大（需经常准备12.5~ 14.5天交配后小鼠制备MEF小鼠）。

5.3.1.1 ES细胞的分离培养方法 3. ES细胞的分离培养： （2）无饲养层培养：在基础培养液DMEM中添加 重组的白血病抑制因子（LIF），或利用各种分泌抑 制分化因子的细胞制成条件培养液（CM）。无需饲 养层细胞，条件培养液就能维持ES细胞的增殖和未分 化的二倍体状态。 目前，只有小鼠、兔和人ES细胞有无饲养层培养的 报道，而猪、牛、羊及其他灵长类动物尚未见报道。 收集已建系的STO、BRL、EC的培养液，制成细胞 团，用于ES细胞的培养，逐渐成新趋势。

5.3.1.1 ES细胞的分离培养方法 4. ES细胞的冻存与复苏： （1）冻存： 对数生长期的ES细胞→胰酶消化→单细胞， 计数→800~1000rpm离心5min，弃上清液→加含 10~15%DMSO的ES细胞培养液重悬细胞→调整 细胞浓度5×106 ~1×107 →迅速等份装入冷冻小 管→置于液氮气相中→24h后，入液氮中保存。

5.3.1.1 ES细胞的分离培养方法 4、ES细胞的冻存与复苏： （2）复苏： 自液氮取出冷冻管→投入37℃温水→75%乙醇 消毒，擦干外壁→内容物移入10ml离心管→缓慢 加入5ml细胞培养液→低速离心→吸去上清夜→ 以培养液重新制成悬液→移入培养皿，置于CO2 培养箱培养。

5.3.1.2 影响ES细胞分离培养的因素 1、动物的遗传背景： 不同小鼠的遗传背景不同，建成ES细胞系有 集落。

5.3.1.2 影响ES细胞分离培养的因素 2、培养液及其添加物： 基础培养液只能满足培养细胞生长的基本需 抑制细胞分化，要添加血清、核苷酸、2-ME、亚 硒酸钠、柠檬酸纳、丙酮酸纳、促生长因子和抑 制分化因子。 血清（应检验和筛选）：营养、促DNA合成 和附着生长；EC细胞可产生内源性因子（促增殖抑 制分化）；其他因子：

生长因子及其作用 名 称 缩 写 来 源 功 能 抑制因子 LIF 层细胞 维持增殖 抑制分化 干细胞 生长因子 SCF 促分裂 抑制凋亡 名 称 缩 写 来 源 功 能 白血病 抑制因子 LIF 饲养 层细胞 维持增殖 抑制分化 干细胞 生长因子 SCF 促分裂 抑制凋亡 表皮 EGF 广谱 胰岛素样 IGF 增强 细胞分裂

用于制备CM的部分细胞系 名 称 来 源 STO BRL 大鼠肝脏细胞 HBC5637 PSA-1 EC细胞 T3 PCIO-6R 名 称 来 源 STO 一种成系的小鼠成纤维细胞 BRL 大鼠肝脏细胞 HBC5637 人膀胱癌细胞系 PSA-1 EC细胞 T3 PCIO-6R LIF 转染的COS细胞 CM：conditioned medium,条件培养液

5.3.1.2 影响ES细胞分离培养的因素 3、饲养层种类及状态：最常用的是STO和MEF ES细胞体外分离建系初期只能靠STO、MEF 只能减缓饲养层依赖性EC细胞的分化。 BRL细胞（大鼠肝细胞）的DIA（分化抑制因 子）非常有效：可完全抑制EC和ES细胞的分化 STO饲养层细胞培养液提取的DIA能部分抑制 EC细胞的分化；鸡肝脏细胞或原代鸡胚成纤维细 胞饲养层也能产生DIA样细胞因子。

5.3.1.2 影响ES细胞分离培养的因素 3、饲养层种类及状态： LIF 能抑制白血病细胞株M1的克隆生长和促进分 化。研究发现，LIF与DIA是同一物质，LIF是多功能 细胞因子，具广泛的生物学功能。 LIF所在的家族成员众多，在体内外执行许多相近 或重叠的生物学功能：如促进骨髓白血病细胞系分 化、诱导肝脏细胞急性反应、抑制正常ES细胞分 化、刺激骨中钙释放等等。其相应受体复合物共用 一个或两个受体亚基gp130,通过gp130的酪氨酸磷酸 化实现信号传递。

LIF家族部分成员一览表 简 称 全 称 OSM 抑瘤素M CNDF 胆碱能神经分化因子 HSF 肝脏细胞刺激因子 HILDA 简 称 全 称 OSM 抑瘤素M CNDF 胆碱能神经分化因子 HSF 肝脏细胞刺激因子 HILDA 人DA（树突状）细胞白介素 MLPLI 黑色素源脂蛋白脂酶抑制因子 CAF 类破骨细胞活化因子 IL-6、IL-11 白细胞介素-6、白细胞介素-11

5.3.2 ES细胞的体外定向诱导分化 5.3.2.1 干细胞的分化潜能 1、ES细胞的分化潜能 ES细胞是全能干细胞，无论在体内或体外， 都具有高度分化潜能。 研究表明，特定的生长因子、细胞表面分子、 基质分子或其他类型细胞的分泌物，均可诱导ES 细胞分化为许多类型的细胞。

ES细胞的分化潜能 ES细胞注入→无胸腺小鼠→6周形成畸胎瘤 ——包括：内胚层、结缔组织、上皮组织、未分 化的干细胞。 （chimeric animal）中，组织来自受体胚胎和ES 细胞两方面，且ES细胞形成嵌合体的能力较高。 已获得嵌合体的动物：小鼠、牛、猪、羊、 兔和鱼。

5.3.2 ES细胞的体外定向诱导分化 5.3.2.1 干细胞的分化潜能 2、 EG细胞的分化潜能 EG细胞与ES细胞一样，具有发育的多能性，可 参与宿主生殖系嵌合。 目前报道，形成生殖系嵌合体的动物有小鼠和猪 （猪的未证实是否可遗传），尚未见其他动物的报 道。

5.3.2 ES细胞的体外定向诱导分化 5.3.2.1 干细胞的分化潜能 3. ES细胞与EG细胞的异同 （1）相同点： 各种动物的ES细胞直径12~15μm，EG细胞的 15~18 μm ；EG细胞与ES细胞均具有高核质比 率；表达较高水平的AKP活性和端粒酶活性；EG 和ES细胞都表达Oct-4转录产物（维持细胞多能 性的一个重要转录因子）；体外形成的类胚体都 进一步分化为多种类型细胞：造血、心肌、神经 和血管内皮细胞等。

5.3.2 ES细胞的体外定向诱导分化 5.3.2.1 干细胞的分化潜能 3. ES细胞与EG细胞的异同 （2）差异： 胰岛素样生长因子受体（1gf2r）甲基化状态不同； EG细胞：小鼠表达SSEA-1,而人类表达SSEA-3和高 分子糖蛋白；小鼠ES细胞表达SSEA-1 外，还表达起 源因子 （genesis）、生殖细胞核因子（germ cell nuclear factor）、生长分化因子3（GDF-3）；EG细 胞与宿主胚胎嵌合时畸胎瘤的形成率要高些。

5.3.2 ES细胞的体外定向诱导分化 5.3.2.2 分化诱导因素 1 、化学诱导物 （1） 视黄酸（RA）：强烈的分化诱导剂。RA沿 5.3.2.2 分化诱导因素 1 、化学诱导物 （1） 视黄酸（RA）：强烈的分化诱导剂。RA沿 胚轴形成浓度剃度，影响胚胎背腹部和四肢的形成， 对胚胎发育起激素样调节作用。 在体内 RA（与FGF,BMP,sonic hedgehog 和Wnt 家族的信号分共同）调节：胚轴形成，促进神经脊前 体细胞生存、扩增、分化，RA 促进神经视网膜发 育，调节有丝分裂后的神经元的神经递质的表现型， 促使视网膜前体细胞向感光细胞分化。

1、化学诱导物：RA在体外对ES细胞的诱导作用 与体内相似，也具有浓度和时间依赖效应。 5.3.2.2 分化诱导因素 1、化学诱导物：RA在体外对ES细胞的诱导作用 与体内相似，也具有浓度和时间依赖效应。 RA对ES细胞分化的阶段特异性作用 EB形成 RA浓度 神经 骨骼肌 脂肪 心肌 血管 期∕天 mol ∕L 细胞 平滑肌 0~2 10-7 + + + － － －－ 2~5 10-8 ﹥5 + 有诱导；+ + 强诱导；+ 无诱导；－ － 强抑制

5.3.2 ES细胞的体外定向诱导分化 5.3.2.2 分化诱导因素 1 、化学诱导物 5.3.2.2 分化诱导因素 1 、化学诱导物 （2）Vc,VK3 ,H2O2 ：促进悬浮培养ES细胞生成 心肌；Vc、β-磷酸甘油、地塞米松、25-羟基VD3 诱导其分化为成骨细胞和染、软骨细胞；胰岛素、 DMSO、三碘甲状腺氨酸（T3）诱导脂肪细胞。

5.3.2 ES细胞的体外定向诱导分化 5.3.2.2 分化诱导因素 2、细胞因子 细胞因子能显著改变ES细胞的发育途径。 5.3.2.2 分化诱导因素 2、细胞因子 细胞因子能显著改变ES细胞的发育途径。 （1）重组白细胞介素-6（rIL-6）诱导ES-D3细胞 分化为F4∕80+ 星形巨噬细胞和成纤维细胞； （2）rIL-6、rIL-3、rIL-7诱导ES细胞分化为Thy- 1+、Joro75+、B220+细胞； （3）BMP（骨形成蛋白，转化生长因子- β （TGF-β)超家族成员 ）：间充质细胞分化为成骨细 胞和软骨细胞，且无种属特异性。

5.3.2 ES细胞的体外定向诱导分化 5.3.2.2 分化诱导因素 2、细胞因子： 现已分离筛选出的BMP有：BMP-1、BMP-A、 5.3.2.2 分化诱导因素 2、细胞因子： 现已分离筛选出的BMP有：BMP-1、BMP-A、 BMP-B和BMP3~BMP-7。 BMP-7有成骨作用； BMP-4影响神经元和胶质细胞的分化、诱导ES细 胞分化为滋养层细胞，用其处理的细胞形成合胞 体，并表达绒毛膜促性腺激素； （4）SCF、TPO和胚胎条件培养液协同：诱导 ES细胞分化为造血干细胞和定向造血干细胞。

5.3.2 ES细胞的体外定向诱导分化 5.3.2.2 分化诱导因素 ： 3、转录因子： 5.3.2.2 分化诱导因素 ： 3、转录因子： （1）Oct-4：维持细胞多能性的一个重要转录因子，属于PUO家族成员。 Oct-4表达↑ 2倍，ESC→原始内胚层；不变，则 ESC维持未分化；下调， ESC→滋养层细胞。 （2）转录因子Gata-4和Gata-6：诱导ESC向胚外内 胚层分化。 （3）DMSO：诱导ES细胞EB形成心肌、平滑肌、 骨骼肌等多种类型肌细胞。 DMSO加调节因子MyoD 基因转染ESC，主要分化为骨骼肌，常融合成肌管， 具收缩功能。

5.3.2 ES细胞的体外定向诱导分化 5.3.2.3 诱导分化方法 1、单层ES细胞诱导分化（混合型诱导分化）： 5.3.2.3 诱导分化方法 1、单层ES细胞诱导分化（混合型诱导分化）： 0.1%明胶包埋的培养皿，接种ES细胞密度为2×104 ~ 5×104 ∕ml，撤除LIF，添加适当浓度的细胞分化诱 导剂，每两天更换含同种同浓度诱导剂的新鲜培养液， 1~2周出现细胞分化。 细胞分化种类：随诱导剂种类及其浓度、细胞的分化 潜能、培养条件等因素而异。

5.3.2 ES细胞的体外定向诱导分化 5.3.2.3 诱导分化方法 1、单层ES细胞诱导分化（混合型诱导分化）： 5.3.2.3 诱导分化方法 1、单层ES细胞诱导分化（混合型诱导分化）： 如DMEM培养液加RA，小鼠ES细胞可单层贴壁培养 2天，然后移入含血清的DMEM和无血清的DMEM∕F12 的培养液，加胰岛素、转铁蛋白、硒等。结果：DMEM （含血清）单层培养2天，加ITS，多数ES细胞分化为神 经细胞。

5.3.2 ES细胞的体外定向诱导分化 5.3.2.3 诱导分化方法 2、 EB（类胚体）培养和诱导分化： 5.3.2.3 诱导分化方法 2、 EB（类胚体）培养和诱导分化： （1）软琼脂培养：1%的软琼脂铺底的培养皿 中，接种ES（2×104 ~5×104∕ml）细胞，悬浮培 养生长。4~5天后，ESC增殖，黏附聚集成细胞 团，其外层分化为内胚层细胞，并形成Reichert膜 ——发暗，将内胚层细胞与中央未分化细胞分离 开。这种结构称简单类胚体（SEB）。

5.3.2 ES细胞的体外定向诱导分化 5.3.2.3 诱导分化方法 2、 EB培养和诱导分化： 5.3.2.3 诱导分化方法 2、 EB培养和诱导分化： （2）悬滴培养：ES细胞→0.25%胰蛋白酶消化→ 4×104∕ml密度的单细胞悬液→20μl接种在10㎝培 养皿盖内表面→成许多悬浮细胞小滴→皿内加适量 PBS →37℃，5%CO2培养箱培养→三天后，ESC形 成EB。 （3）诱导分化：收集EB，制为单细胞，入铺有 0.1%明胶的培养皿内，加诱导物诱导分化。EB诱 导分化的细胞较单一。

5.3.3 体外诱导分化细胞类型 体外，ES细胞可自主分化成很多类型的细胞，并已 用作：造血、心肌、上皮、脂肪细胞和血管平滑肌的 5.3.3 体外诱导分化细胞类型 体外，ES细胞可自主分化成很多类型的细胞，并已 用作：造血、心肌、上皮、脂肪细胞和血管平滑肌的 研究模型系统。 ES细胞体外诱导分化的主要细胞： （1）   造血系细胞 （2） 心肌细胞 （3）   神经细胞 （4） 脂肪细胞 （5）    胰岛细胞 （6） 内皮细胞 （7）   上皮细胞 （8）  肝脏细胞 （9）    成骨细胞 （10）软骨细胞 （11）树突状细胞 （12）黑素细胞 （13）角膜缘干细胞 （14）表皮样干细胞 等

5.3.3 体外诱导分化细胞类型 1、造血系细胞： ESC可分化为造血系的细胞，如定向造血干细胞、 5.3.3 体外诱导分化细胞类型 1、造血系细胞： ESC可分化为造血系的细胞，如定向造血干细胞、 红细胞、巨核细胞、巨噬细胞、T定向干细胞和T细 胞、B定向干细胞和B细胞等。未见ESC向造血系其他 细胞分化的报道，如幼红细胞、成巨核细胞、血小 板、嗜曙红祖细胞、嗜曙红细胞、嗜碱祖细胞、嗜碱 细胞、单核细胞、胸腺细胞等。

造血系细胞谱系结构图 骨髓干细胞 多能干细胞 （ESC） 红系祖细胞 成巨核细胞 嗜曙红祖细胞 嗜碱祖细胞 成单核祖细胞 幼红细胞 红细胞 血小板 嗜曙红细胞 嗜碱细胞 多能干细胞 （ESC） 嗜中性粒细胞 单核细胞 巨噬细胞 淋巴干细胞 B祖细胞 T祖细胞 NK祖细胞 B 细胞 TC细胞 胸腺细胞 TH细胞 NK细胞 造血系细胞谱系结构图

5.3.3 体外诱导分化细胞类型 体外，ESC→EB →分化为：心房、心室、窦房结和 浦肯野样心肌特化细胞，并可表达基因及其蛋白质、 5.3.3 体外诱导分化细胞类型 2、心肌细胞 体外，ESC→EB →分化为：心房、心室、窦房结和 浦肯野样心肌特化细胞，并可表达基因及其蛋白质、 受体和相关离子通道，与早期心肌发育极其相似。 ES-5细胞悬浮培养4天→在6~10 mol∕L RA 的BRL - CM中贴壁培养→诱导分化的细胞类型较多。15天左 右，出现有节律收缩的心肌样细胞团或区域。20天左 右，细胞内有明显的肌纤维束、肌小节和闰盘等。 电场可诱导ES 细胞源的EB阳极侧的超极化和阴极 侧的去极化。

5.3.3 体外诱导分化细胞类型 3、神经细胞： 悬浮培养4天的EB，加RA 继续培养4天，EB贴壁 培养，可高效重复地分化出神经细胞。 5.3.3 体外诱导分化细胞类型 3、神经细胞： 悬浮培养4天的EB，加RA 继续培养4天，EB贴壁 培养，可高效重复地分化出神经细胞。 RA诱导ES细胞分化的神经细胞植入Huntington病 大鼠模型体内，症状有所改善，且存活6周。 ES和EC细胞体外可诱导分化为放射状胶质 （radial glial）细胞——产生神经元和神经胶质细 胞，指导神经元迁移。

5.3.3 体外诱导分化细胞类型 4、脂肪细胞 ESC自动分化为脂肪细胞的数量不多。 5.3.3 体外诱导分化细胞类型 4、脂肪细胞 ESC自动分化为脂肪细胞的数量不多。 悬滴培养ESC，01.% DMSO 诱导，约50~70% 的EB分化为脂肪细胞。 RA是ESC分化为脂肪细胞的必要条件。EB形 成的7~20天，加RA、T3、胰岛素，50~70%生长 晕有脂肪细胞，缺乏RA处理的仅仅2~5% 。

5.3.3 体外诱导分化细胞类型 胰岛组成：郎罕细胞与合成肽类激素的细胞： a细胞（胰高血糖素）、β细胞（胰岛素）、δ 5.3.3 体外诱导分化细胞类型 5、胰岛细胞 胰岛组成：郎罕细胞与合成肽类激素的细胞： a细胞（胰高血糖素）、β细胞（胰岛素）、δ 细胞（抑生长素）和胰腺多肽细胞（PP）。在胚 胎发育过程中，由靠近脊索处结构发育而成，与 神经元有联系。 ESC加LIF培养2~3天→去LIF，悬培4天，形成 EB→无血清液筛选Nestin阳性细胞6~7天→加丝 裂原B27、bFGF的N2无血清液，培养胰腺内分泌 前体细胞6天→撤除B27、bFGF，加烟碱，诱导分 化分泌胰岛素的胰岛细胞。

5.3.3 体外诱导分化细胞类型 5、胰岛细胞 所诱导的分泌胰岛素的胰岛细胞成集落存在， 其周围为神经元细胞，除分泌胰岛素外，还分泌胰 5.3.3 体外诱导分化细胞类型 5、胰岛细胞 所诱导的分泌胰岛素的胰岛细胞成集落存在， 其周围为神经元细胞，除分泌胰岛素外，还分泌胰 高血糖素、抑生长素和胰腺多肽。

5.3.3 体外诱导分化细胞类型 6、内皮细胞 TGF-β1 在血管形成中起重要作用。过度表 5.3.3 体外诱导分化细胞类型 6、内皮细胞 TGF-β1 在血管形成中起重要作用。过度表 达TGF-β1 的ES细胞，加RA悬培，形成EB，再 贴壁培养，EB周围生长出呈辐射状的血管样结构 研究表明： TGF-β1 可能通过细胞外基质， 调节ESC 的分化与分化细胞的bFGF基因表达， 行使其形成血管功能。

5.3.3 体外诱导分化细胞类型 7、上皮细胞 加入10ng∕ml NGF，60%单层培养的猕猴ES 细胞分化为上皮样细胞。 5.3.3 体外诱导分化细胞类型 7、上皮细胞 加入10ng∕ml NGF，60%单层培养的猕猴ES 细胞分化为上皮样细胞。 在PA6基质层上培养猕猴ESC 3周，８％的ES 细胞克隆中有大量色素沉者的上皮细胞——多角 形紧密排列，明显不同与黑素细胞，细胞增殖速 度相当快。 SDIA（stromal cell-derived incucing actvity） 处理 ESC，极少出现上皮细胞的分化。

5.3.3 体外诱导分化细胞类型 ８、肝脏细胞 转染肝核因子（HNF-3β）的ESC培养在添 5.3.3 体外诱导分化细胞类型 　８、肝脏细胞 　　转染肝核因子（HNF-3β）的ESC培养在添 加１０％FBS和FGF2的a-MEM液的三维培养系统 中，ES 细胞分化为肝脏细胞——表达肝脏特异 功能特征，具较高的代谢活性，合成白蛋白、三 酰甘油、尿素、肝糖原。

5.3.3 体外诱导分化细胞类型 ９、成骨细胞 小鼠ESC悬培，形成EB，用a-MEM添加Vc、 5.3.3 体外诱导分化细胞类型 　９、成骨细胞 　 小鼠ESC悬培，形成EB，用a-MEM添加Vc、 β-磷酸甘油、塞地米松或RA，诱导分化，或与小 鼠胎儿成骨细胞共培养。 结果：Vc和塞地米松都可诱导骨结节的形成； 小鼠胎儿成骨细胞共培养将骨骼结节的形成提高了 5倍。RA 未显现协同诱导作用。 Vc、β-磷酸甘油、1a，25-羟基维生素D3可 诱导ESC分化为矿化的成骨细胞。

5.3.3 体外诱导分化细胞类型 10、表皮样干细胞 小鼠ESC与人羊膜共培养4~5天，ESC分化为表 5.3.3 体外诱导分化细胞类型 10、表皮样干细胞 小鼠ESC与人羊膜共培养4~5天，ESC分化为表 皮细胞样的单层细胞，细胞呈多边形，排列紧密， 多数细胞呈现β1整合素阳性，对照组大量细胞死 亡。说明与羊膜共培养可诱导ESC分化为表皮样干 细胞。

5.3.3 体外诱导分化细胞类型 11、结语 目前，ESC体外定向诱导分化的研究尚处于起 步阶段。虽然定向分化的细胞类型还相当有限， 5.3.3 体外诱导分化细胞类型 11、结语 目前，ESC体外定向诱导分化的研究尚处于起 步阶段。虽然定向分化的细胞类型还相当有限， 但这些研究成果已在生物学基础研究和临床医学 领域显示出越来越重要的作用。

ES细胞的定向分化及应用示意图 药物或毒理试验 发育或基因调控研究 培养的ES细胞 定向分化 骨 髓 神经细胞 心肌细胞 胰岛细胞 糖尿病 骨 髓 神经细胞 心肌细胞 胰岛细胞 糖尿病 心肌梗死 白血病 帕金森 综合症 ES细胞的定向分化及应用示意图

5.4 胚胎干细胞的鉴定 ES细胞是早期胚胎细胞经体外抑制分化培养 建立的多能（全能）性细胞系，对其识别和鉴定 5.4 胚胎干细胞的鉴定 ES细胞是早期胚胎细胞经体外抑制分化培养 建立的多能（全能）性细胞系，对其识别和鉴定 是进行分离培养和进一步应用操作的前提。ES细 胞的生物学特征是进行鉴定的理论基础。

5.4.1 形态及生长特征 ES细胞呈集落状生长，集落边缘清楚，折光性 强。集落表面光滑，结构非常紧密，隆起生长， 细胞之间界限不清楚。 5.4.1 形态及生长特征 ES细胞呈集落状生长，集落边缘清楚，折光性 强。集落表面光滑，结构非常紧密，隆起生长， 细胞之间界限不清楚。 无饲养层培养时，细胞集落的形态更加清楚典 型。若饲养条件不适宜，ES细胞集落变得扁平， 边缘不清楚，表面粗糙，可见有较大分化的内胚 层样细胞结构。消化成单细胞后，可见细胞体积 小而圆，核大，胞质小，有一个或几个核仁。

5.4.1 形态及生长特征 ES细胞直径（μm）：小鼠，12~14；兔，9~ 12；牛，11~19；猪，12~15。 5.4.1 形态及生长特征 ES细胞直径（μm）：小鼠，12~14；兔，9~ 12；牛，11~19；猪，12~15。 体外经多代培养的ES细胞呈紧密碟状集落，其 中主要是类似于ICM的未分化细胞，集落周围存 在上皮样细胞和多角形细胞。

5.4.2 碱性磷酸酶活性 未分化的ES细胞除具有典型的克隆形态外，表面 标记碱性磷酸酶（AKP）也呈阳性，发生分化时则 呈阴性。 5.4.2 碱性磷酸酶活性 未分化的ES细胞除具有典型的克隆形态外，表面 标记碱性磷酸酶（AKP）也呈阳性，发生分化时则 呈阴性。 在碱性条件（pH9.0~9.6）下，磷酸酶能使孵育 液中的磷酸萘酚钠水解，产生a-萘酚，然后再与偶氮 盐耦联，生成不溶性耐晒染料而呈现颜色。偶氮盐 品种不同，未分化ESC克隆呈现的颜色不同。 BCIP∕NBT染色显示AKP，未分化的ESC克隆显 蓝紫色；Gomori a-萘基磷酸法、改良Gomori钙钻 法，呈深黑色。

5.4.3 ESC的分子标志物 未分化的多（全）能ESC表达早期胚胎细胞的 阶段特异性胚胎抗原（stage-specific embryonic antigen,SSEA）。在ESC、PGC（和胚胎的原始 外胚层细胞）表面都可检测到SSEA-1。 灵长类ESC：SSEA-3、SSEA-4和高分子糖蛋 白（TRA-1-60、TRA-1-81）。 已分化的原始生殖细胞源人ESC：SSEA-3、 SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA-1（前二 者水平下降）。

5.4.3 ESC的分子标志物 小鼠ESC：SSEA-1、起源因子（genesis）、生殖 细胞核因子（GCNF）、生长因子（GDF-3）以及 能快速降低分化的因子（L17、Rex1、GBX2、Oct4 和UTF2以及Pem等）。不表达SSEA-3、SSEA-4。 大鼠ESC：SSEA-1、IL-6 牛ESC： SSEA-1 、SSEA-3、SSEA-4。 人类ESC：显示与小鼠ESC不同的表面抗原，分 化为胚外细胞或体细胞后抗原表达有明显变化。

5.4.4 染色体数目和核型分析 在体外培养的条件下，稳定细胞系的细胞染色体 数目和核型保持与来源动物品系一致。染色体数目 5.4.4 染色体数目和核型分析 在体外培养的条件下，稳定细胞系的细胞染色体 数目和核型保持与来源动物品系一致。染色体数目 和核型正常对ES细胞非常重要，染色体畸型、缺失 或核型异常，将影响ES细胞发育的多能性。如小鼠 ESC的染色体为20对，共40条。 方法：对数生长期的ESC→秋水仙素（0.1~ 0.4 μg∕L） →1~4h →胰蛋白酶消化→离心分离、收 集ESC、固定、染色、镜检、核型分析。 正常ESC染色体核型正常率应在80%以上。

5.4.5 体外分化能力 在有饲养细胞、条件培养液或分化抑制因子存在 的条件下，体外培养的ES细胞可以保持其未分化的 5.4.5 体外分化能力 在有饲养细胞、条件培养液或分化抑制因子存在 的条件下，体外培养的ES细胞可以保持其未分化的 二倍体状态和发育的多能性。去除分化抑制物或降 低分化抑制因子水平，单层培养的ES细胞会自主分 化成多种类型的细胞，而悬浮培养4~5天，ES细胞 可以形成简单类胚体（SEB）。SEB继续悬浮培养 8~10天，可形成外壁为外胚层样细胞而中间充满液 体的囊状类胚胎（CEB）。

5.4.5 体外分化能力 将EB附着贴壁生长，则可以形成复杂的分化细胞 群，若添加适当分化诱导剂，还可以形成特定的组 5.4.5 体外分化能力 将EB附着贴壁生长，则可以形成复杂的分化细胞 群，若添加适当分化诱导剂，还可以形成特定的组 织细胞类型。ES细胞悬浮培养所形成的EB，贴壁培 养6周，可形成巨细胞、神经元样细胞、内胚层细胞 和软骨细胞以及许多高度结构化的细管。 兔ESC体外可分化为神经、肌肉、上皮等细胞。 小鼠ESC可形成有功能的肠道样结构。

5.4.6 体内分化能力 将ESC接种于同品系小鼠、SCID小鼠或裸鼠等 免疫缺陷小鼠的腹股沟、腋窝皮下、腹腔内：形 成内、中、外胚层组成的畸胎瘤。 ES-CE2注入同源小鼠皮下，2周出现0.5㎝畸胎 瘤，3周形成上皮、肌肉、血、软骨等多种分化 细胞。 未分化的ESC 移植到BALB∕c裸鼠眼球内，14 天分化发育成视网膜样结构，其细胞在体外仍保 持神经元和视网膜细胞的特性。

5.4.6 体内分化能力 在体内，诱导信号和转录因子（与运动神经元 形成相关）可诱导ESC分化为脊髓祖细胞，进而 形成运动神经元，且可居住于脊髓，延伸轴触与 肌肉形成神经突触。 ESC注入裸鼠脾脏，形成畸胎瘤，其中有排列 成窦状结构的典型肝脏细胞，并表达肝脏细胞特 化基因。

5.4.7 嵌合体形成能力 合，并将胚胎移植到同期化的子宫内，可得到嵌 合体动物。嵌合体的判断：葡萄糖磷酸异构酶 5.4.7 嵌合体形成能力 通过注射法和聚合法，使ESC与受体胚胎嵌 合，并将胚胎移植到同期化的子宫内，可得到嵌 合体动物。嵌合体的判断：葡萄糖磷酸异构酶 （GPI） 同功酶分析和毛色观察。 嵌合规律：毛色为嵌合，内脏也不嵌合；嵌 合体小鼠全部显示ESC来源的特征，其内脏也未 必全由 ESC构成；组织器官中ESC嵌合与毛色嵌 合呈正比。故通过毛色的嵌合情况即可判断是否 是嵌合体与嵌合程度。 通过囊胚注射法（Bradley,1984）获得首例 嵌合体小鼠。

5.4.8 结语 干细胞是具有自我更新和多向分化潜能的细胞。 干细胞及相关生物技术的应用，必将导致一次医学 革命，产生全新的治疗技术。 5.4.8 结语 干细胞是具有自我更新和多向分化潜能的细胞。 干细胞及相关生物技术的应用，必将导致一次医学 革命，产生全新的治疗技术。 ESC比AS具有更 广泛的分化潜能和可塑性。近 年来，已获得多种动物的 ESC或类ESC。 分离培养ESC要求既要快速无限增殖又要呈未分 化（一对矛盾）：饲养层细胞结合添加促生长和抑 制分化因子或无饲养层细胞仅添加促生长和抑 制分化因子。

5.4.8 结语 人类ESC 建系取得了很大进展（美、以、澳、 印、瑞典、新、韩和我国），但有待进一步验证是 否完全具有ESC的特征。 5.4.8 结语 人类ESC 建系取得了很大进展（美、以、澳、 印、瑞典、新、韩和我国），但有待进一步验证是 否完全具有ESC的特征。 ESC体外定向分化技术是干细胞研究和应用的关 键技术，也是生命科学领域的世界性难题之一。目 前已成功将小鼠和人类ESC诱导分化出造血干细胞 神经细胞、胰岛细胞、心肌细胞等，但有待验证是 否在体内具有体细胞的功能，距临床应用还有很大 距离。