第十二章 动物克隆技术

精卵结合 胚 胎 细胞分化 个 体

基本概念 克隆（clone）: 遗传上完全相同的分子、细胞或来自同一祖先的生物个体的无性繁殖群体，也指通过克隆方式生产克隆群体的过程或手段。 克隆 分子克隆 细胞克隆 个体克隆

基本概念 动物克隆：由一个动物经无性繁殖（asexual reproduction）或孤雌生殖而产生的多个后代，克隆的所有成员在遗传组成上都是完全相同的。 细胞核移植技术（nuclear transfer）：动物克隆的核心技术

主要内容 12.1 动物克隆的研究历史 12.2 动物克隆的意义 12.3 动物克隆的原理及技术路线 12.4 动物克隆的方法 12.5 动物克隆的影响因素 12.6 动物克隆技术的应用及发展前景

12.1 动物克隆的研究历史 1938年：德国胚胎学家Spemann首次提出克隆的设想。 1952年：Briggs和Kings获得豹蛙胚胎克隆后代。 1975年：Bromhall最早在家兔上证实哺乳动物的胚胎细胞核移植是可行的。 1997年：英国罗斯林研究所宣布克隆羊培育成功。他们用取自一只6岁成年羊的乳腺细胞培育成功一只克隆羊。 Wilmut I et al. Nature, 1997, 385: 810-813

克隆蛙产生过程

克隆羊产生过程

中国克隆动物研究大事记 60年代，生物学家童第周对金鱼、鲫鱼进行细胞核移植。 1990年5月，西北农业大学畜牧所克隆一只山羊。 1992年，江苏农科院克隆一只兔子。 1993年，中科院发育生物学研究所与扬州大学农学院合作，克隆一只山羊。 1995年7月，华南师大与广西农大合作，克隆一头奶牛、黄牛杂种牛。 1995年10月，西北农大克隆6头猪。 1996年12月，湖南医大克隆6只老鼠。中国农科院畜牧所克隆一头公牛犊。(以上为胚胎细胞克隆研究) 1997年3月，陈大元率先提出了克隆大熊猫的设想。 1999年，中科院动物研究所成功培育出了大熊猫的早期胚胎。 2000年6月，西北农林科技大学培育出世界上第一例成年体细胞克隆山羊。

12.2 动物克隆的意义 体细胞与胚胎干细胞的关系 胚胎干细胞 体细胞

12.2 动物克隆的意义 对传统动物繁殖模式的挑战； 对社会伦理的挑战； 保存物种、延续生命、提高人口素质？

12.3 动物克隆的原理及技术路线 12.3.1 动物克隆的原理 胚胎分割的原理 胚胎细胞核移植的原理 体细胞核移植的原理

(1) 胚胎分割的原理 大多数哺乳动物的胚胎发育是调整发育。 随着胚胎发育的进行，其调整能力逐渐减弱，细胞的组织发育方向慢慢得到固定，直至调整能力完全丧失。

(2) 胚胎细胞核移植的原理 早期胚胎细胞具有全能性，它包含个体的全套遗传信息。

(3) 体细胞核移植的原理 细胞全能性是细胞核基因在不断变化和胞质环境的作用下有次序、有系统地表达的结果，在分化的细胞内存在有可逆性修饰的遗传物质。 已分化的体细胞在特定条件下，经过去分化也具有全能性，其前提条件是这种细胞在体外进行诱导进入休眠状态。

12.3 动物克隆的原理及技术路线 12.3.2 动物克隆的技术路线

12.4 动物克隆的方法 核供体细胞的获得 (1) 胚胎细胞核移植的操作程序 受体细胞的选择及去核 核卵重组 细胞融合与激活 重构胚的培养与移植

切开卵母细胞透明带 挤出卵母细胞细胞核 1 2 电融合仪融合 3 4 5 培养 注入供体 细胞核

(1) 胚胎细胞核移植的操作方法 ① 核供体细胞的获得 选择： 核供体细胞必须具有供体动物完整的基因组，二倍体 能在细胞质的作用下，产生细胞分化过程的倒转 来源： 胚胎细胞，胚胎干细胞，体细胞等

(1) 胚胎细胞核移植的操作方法 ② 受体细胞的选择及去核 选择： 成熟的卵母细胞，受精卵，2细胞胚胎 来源： 一是用激素进行超排，冲出MII卵母细胞； 二是从屠宰场收集卵巢，吸出滤泡中的卵丘-卵母细胞复合体（COC），体外成熟培养。 去核： 盲吸法，半卵法，离心去核法，切割去核法，化学诱导去核，显微手术法

(1) 胚胎细胞核移植的操作方法 ③ 核卵重组 带下移植 胞质内注射 ④ 细胞融合与激活 细胞融合：仙苔病毒法，电融合法 激活：原理是通过电刺激、钙离子载体等方法，使卵母细胞从MII期中解放出来，并转到“受精”的状态。

(1) 胚胎细胞核移植的操作方法 ⑤重构胚的培养与移植 重组胚移入中间受体或体外培养，观察其发育率 重组胚移植的受体母体要选择皮毛颜色与供体品种不同、繁殖性能强、体格稍大的品种、同期发情处理……

(2) 体细胞核移植的操作方法 核供体细胞的获得 G0期的诱导 受体细胞的选择及去核 核卵重组 细胞融合与激活 重构胚的培养与移植

Creating Dolly！                                         1997年2月22日，英国“Nature”刊登了爱丁堡罗斯林研究所维尔穆特的研究成果，即“多莉”羊的克隆成功，从此震惊了世界。

(3) 克 隆 动 物 的 鉴 定 对于体细胞核移植的后代，既要从形态、性别上鉴定供体细胞与克隆后代的亲缘关系，又要分子生物学水平鉴定 DNA 指 纹 ：指每个个体所特有的基因多态性 鉴定方法：RAPD 微卫星 RFLP DOLLY的鉴定：微卫星

12.5 动物克隆的影响因素 影响核移植的主要因素 供体细胞核的选择 胚细胞的分离和注入 卵母细胞去核效果 受体胞质的成熟程度及其激活能力 核质相互作用与细胞周期同步化 重组胚的培养及发育 重组胚的妊娠率

12.6 动物克隆技术的应用及发展前景 12.6.1 核移植的应用 ① 在科研基础领域方面的应用：促进胞质关系的研究；促进人类了解生物生长发育的机理。 ② 在医学领域的应用价值：细胞治疗；异种器官移植；生产治疗性蛋白；培育各种疾病动物模型。 ③ 在畜牧业方面的应用：大量繁殖优良个体，提高畜产品产量和质量；克隆技术是培育畜禽优良品种的捷径；性别控制 ④保护、挽救濒危物种

(1) 细 胞 治 疗 面临的问题 解决方法 细胞来源 尸源性 异种细胞 免疫排斥 免疫抑制剂 基因敲除 免疫隔离 核移植 消除免疫排斥 (1) 细 胞 治 疗 面临的问题 解决方法 细胞来源 尸源性 异种细胞 免疫排斥 免疫抑制剂 基因敲除 免疫隔离 核移植 消除免疫排斥 胚胎干细胞 提供细胞来源

猪的器官大小、结构和功能上与人体器官相近 (2) 异 种 器 官 移 植 可移植器官短缺 猪的器官大小、结构和功能上与人体器官相近 急性免疫排斥反应 基因敲除半乳糖基转移酶 核移植 器官移植

（3） 生 产 药 用 蛋 白 目 的 基 因 基 因 打 靶 转基因细胞系 核 移 植 动 物 乳 腺 乳液提取目的产物

（4） 培 育 各 种 疾 病 动 物 模 型 应用核移植技术可以培育基因完全一致的实验动物模型 ，为遗传学，病理学研究提供良好的实验材料。 （4） 培 育 各 种 疾 病 动 物 模 型 应用核移植技术可以培育基因完全一致的实验动物模型 ，为遗传学，病理学研究提供良好的实验材料。 动物种类 疾病模型数 猪 65 猫 123 狗 203

研 究 实 例 1997 年底,英国Roslin 研究所和PPL 公司通过克隆转基因体细胞，获得了6只整合neo 或neo 和F2IX 基因绵羊,这标志着核移植介导的转基因技术成功问世。 2000 年,英国PPL公司将人AAT 基因定点整合到胎儿成纤维细胞的α1 原胶原( Procollagen) 基因座位,而后用转基因细胞进行核移植,生产出世界首例基因打靶绵羊,其乳中AAT 蛋白含量达到了650 mg/ L ,远高显微注射法18 mg/ L 的水平。

研 究 实 例 2004 年，台湾培育带有治疗血友病的“第八凝血因子”的体细胞克隆羊。2005 年，这只克隆羊产下一只同样带有第八凝血因子的公羊。

（5） 保 护 濒 危 物 种 去核卵 母细胞 细胞核 核移植 重构胚

克隆技术研究未来预测 2007 年，生产出的牛羊在奶中分泌贵重药品 - 乳腺反应器投入生产。动物乳房开始替代部分传统的制药工厂。建分厂只须进行克隆。 2008 年，克隆应用于器官移植。 2009 年，小鼠实现全程体外培养 - 人造子宫在日本做成。 2010 年，受体卵母细胞实现人为制造。适合常见动物克隆的卵母细胞实现商品化， 2022 年，无卵克隆（又称植物式克隆），克隆动物像植物般地从单个体细胞生长出来。 2037 年，实现核重建。克隆动物实现数字化批量生产。

克隆技术研究未来预测 2055 年，生物技术使得人的生育与性爱分离。生育由变成社会产业，完全实行机械化生产，作为社会的后备力量。 2061 年，机器人智能化。人类分为传统人、克隆人和机器人三大群体。传统人感到地位在剧烈下降。 2078 年，机器人当选某发达国家总统。 2098 年，发现外星人。 2099 年，时间概念模糊化。 2100 年，传统人举行全球游行，抗议机器人和克隆人对传统人的歧视。

12.6.2 克隆人

(1) 克隆人制备过程 将普通的男性细胞或者是主体细胞和一枚女性卵子结合起来，储存于女性卵子中的遗传信息将事先被消除。通过细胞分裂形成的胚胎应只带有这名男性的全部遗传信息，最后将胚胎移植到女性子宫中，获得男性克隆后代。 当然，如果一对夫妇愿意的话，也可以克隆女性。

克隆人技术过程

克隆的人类胚胎

但他们强调：不会制造用于生育目的胚胎，他们的研究是为了帮助病人。威斯特将这一成果称为走向医学新时代的“蹒跚第一步”，是治疗性克隆研究中的重大突破，将帮助研究人员找到治疗帕金森综合征、糖尿病和早老性痴呆等疾病的方法。

(2) 有关克隆动物与人存在的问题

① 技术尚不成熟 得到的克隆动物具有极大的偶然性和随机性。迄今为止，克隆试验的成功率始终很低。例如，在培育多莉的过程中，科学家共克隆出277个绵羊胚胎，最终成功使母羊受孕并生产的只有多莉一个。 目前，多莉羊的制备还不能重复，更不能肯定克隆多莉羊的方法也适用于其它动物或其它不同组织器官的细胞。

277次乳腺细胞核移植实验； 获得29个发育为8细胞的“胚”； 13头代孕母亲； 1996年7月5日，羊羔6LL3，被命名为“多莉”。

② 遗传、疾病问题 克隆动物夭折率高，不少克隆动物天生患有疾病或体形过大。 克隆动物没有遗传物质的交流和互补，将会加剧一些遗传疾病的发生。

多莉的生命历程 多利于1996年7月5日出生， 1998年4月与威尔士山羊戴维产下邦尼，证明了克隆动物也能生育。2003.2.14日苏格兰向外界宣布：多莉因早衰并患有肺炎，被迫实施了安乐死。由于早衰问题，人们怀疑“多莉是穿着羔羊服装的老羊” 。

克隆有缺陷 克隆鼠突然“发福”

③ 社会、伦理学问题 一个例子——人+动物 中山医科大学陈系古教授等于2001年1月以来，先后使用“核移植”技术，将人类皮肤细胞核移植到家兔卵母细胞中，经过2000多次实验，成功克隆出100多个人类胚胎，其中部分发育到“桑葚胚”阶段。这是国际上首次用该技术克隆出人类胚胎。 但有些学者就对在家兔卵母细胞中克隆出人类胚胎的提出质疑，认为这是违背人类伦理的“科学”实验。

(4) 听一听：关于克隆人的争论

赞同的 迄今为止，公开宣称要进行克隆人的只有3家： 一个是意大利妇科专家安蒂诺利。 一个就是在美国开公司的法国女科学家布利吉特·布瓦瑟利耶。 一个是美国专家扎沃斯。

意大利医生 安蒂诺里—— 克隆人的带头人

冒死也要克隆人的科学家布瓦瑟利耶

反对的

“多利羊”之父反对克隆人 被誉为“多利羊”之父的英国科学家威尔穆特1月4日称，“多利羊”感染了早期关节炎，哺育动物的克隆安全问题再度受到质疑。威尔穆特呼吁，反对任何克隆人的计划。 “我认为，已经有足够的证据表明，克隆人的行动是完全不负责任的。”他说，克隆技术目前还存在很多不确定因素，他们在对动物进行实验时经常遇到大量畸形或异常情况，因此克隆技术目前不适合用于人类。

“多利羊”之父反对克隆人 任何克隆动物都有基因上的缺陷。 克隆羊和克隆牛都有体形过度庞大的问题。该缺陷在克隆鼠身上也存在。克隆牛、羊、猪都存在发育不良、免疫系统 缺陷和心肺功能不健全的问题。

“试管婴儿之父”反对克隆人 与安蒂诺里以朋友相称的“试管婴儿之父”罗伯特·爱德华向“克隆人”叫停。 从1978年第一个试管婴儿诞生以来，全球已有近100万试管婴儿出世。爱德华教授认为，试管婴儿技 术与人类现存的生育伦理没有冲突，而且还给不孕者带来福音。 克隆人则是一种无性繁殖技术，违背了人类的生育伦理，因而应受到指责。

(5) 正确引导下克隆技术的意义

几个极有前景的例子

① 我成了零件 克隆一个小小胚胎，不让它继续长大，然后根据需要让其中的某一部分长成心脏、肌肉甚至是毛发，能像零件似的被使用。 将来人类身体各个部分都能得到保修，还不用担心扰乱日常的生活和伦理，它不过是个早期的胚胎，就像一个零配件的生产机器。

② 珍稀动物的克隆繁殖 中国克隆大熊猫技术的三个关键问题，包括异种核质相容、囊胚着床和克隆个体三个阶段，前两个阶段的实验现已成功。克隆大熊猫的关键问题则是第三步，即大熊猫的胚胎能否在家猫或其他寄母的子宫中形成个体，研究小组争取在今年年底取得突破性进展。

③ 猪器官也能移植人体内？英国克隆专家称有可能 英国PPL实验室的克隆专家们称，已经培育出４头克隆猪，它们的基因经过改造后，器官容易被人体接纳。