第二节 淋巴细胞的检测技术 一.淋巴细胞的分离 (一)外周血单个核细胞(淋巴细胞 > 90%)的分离 密度梯度离心法 (一)外周血单个核细胞(淋巴细胞 > 90%)的分离 密度梯度离心法 (2000rpm,15min) (密度为1.077)
(二)淋巴细胞亚群的分离及鉴定 1.E花环分离法: 人T细胞(表达CD2,即E受体)+绵羊红细胞(SRBC) 形成E花环 密度梯度离心,花环细胞沉降于管底 裂解SRBC 获纯化T细胞
T细胞亚群分离-花环试验
2.尼龙纤维分离法: 单个核细胞 通过尼龙纤维柱 B细胞和单核细胞(粘附特性) T细胞(非粘附性) 3.免疫荧光法: 单个核细胞 + 抗CD3(或CD4,CD8)McAb +荧光素标记第二抗体 荧光显微镜下鉴定CD3+T细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞
4.流式细胞术(flow cytometry, FCM): 荧光素标记抗体+待检细胞单列经过FACS分离(荧光素不同)的细胞 * FACS:荧光激活细胞分类仪(fluorescent activated cell sorter)
流式细胞仪
5.磁珠分离术: (1)直接法: 免疫磁珠(磁性微粒结合抗体) + 细胞 通过磁场 分离磁珠结合细胞 +解离剂 获纯化细胞 (2)间接法: 免疫磁珠(磁性微粒结合第二抗体) + 细 胞 + 抗体 通过磁场 分离磁珠结合细胞 +解离剂 获纯化细胞
① T细胞 + PHA 培养,淋巴母细胞转化 染色 计数转化细胞百分率 二. 淋巴细胞的功能测定技术 (一)体外法 1.淋巴细胞增殖试验 (1)T细胞增殖试验(T淋巴细胞转化试验) ① T细胞 + PHA 培养,淋巴母细胞转化 染色 计数转化细胞百分率 ② T细胞 + PHA 培养,淋巴母细胞转化 + 3H-TdR 测定cpm值 ③ T细胞 + PHA 培养,淋巴母细胞 + MTT 测定OD值
(2)B细胞增殖试验 B细胞 + LPS 淋巴母细胞 + 3H-TdR 测定cpm值
放射性核素标记靶细胞(K562细胞) + 效应细胞 培养 靶细胞破坏,释放放射性核素 测cpm 值 2.细胞毒试验 (1) NK细胞的细胞毒活性测定 ① 放射性核素释放法 放射性核素标记靶细胞(K562细胞) + 效应细胞 培养 靶细胞破坏,释放放射性核素 测cpm 值 NK细胞毒活性(%)= 100% 实验孔cpm值-自然释放孔cpm值 最大释放孔cpm值-自然释放孔cpm值
靶细胞(YAC-1细胞) + 效应细胞(小鼠脾胞) LDH释放 + LDH底物(氧化型辅酶I、吩嗪二甲酯硫酸 盐和硝基氯化四氮唑蓝) 形成甲基化合物(色) 测定OD570值 NK细胞毒活性(%)= 100% 实验孔OD值-自然释放孔OD值 最大释放孔OD值-自然释放孔OD值
(2) 细胞毒性T细胞(CTL)杀伤功能测定 靶细胞(51Cr-EB病毒转化的B细胞) + 淋巴细 胞 + 抗CD3 mAb 培养 取上清液(含 51Cr)γ计数器测cpm值 细胞毒效应(%)= 100% 实验孔cpm值-自然释放孔cpm值 最大释放孔cpm值-自然释放孔cpm值
3. 酶联免疫斑点法 抗原包被 B细胞 抗体产生并附着 第 二抗体(酶标记) 底物 显色 抗体(抗细胞因子)包被 + T细胞 产生细 胞因子并与抗体结合 + 第二抗体(酶标记) 底 物 显色
(二)体内法 抗原定量注入皮内,48~72小时后观察结果。 结果判定: 阳性:注射局部出现红肿、硬结,直径>0.5cm 弱阳性:硬结直径<0.5cm 阴性:无变化 实际意义: 阳性 —— 细胞免疫功能正常者 弱阳性或阴性 —— 多为细胞免疫功能低下者 * 常用的抗原为结核菌素(OT) 、PHA
皮内注射法
划痕法