第9章 植物转基因技术 植物基因转化技术 载体介导法, 如农杆菌介导转化法 DNA直接转移法 植物生物反应器

8.1 植物基因转化技术 转基因研究技术的中心环节即为DNA重组技术，其最终目的是将DNA片段转入为一个生物体，从而使该生物体具有表现某种性状。 转基因通过获取基因、重组基因和表达基因等过程来实现。 转基因打破了物种的界限，使不同种的生物的遗传物质在分子水平上重新组合在一起，并且完全可以按照人的意志或目的，实现对生物体的改造。

合成DNA让细菌“起死回生” 将“山羊支原体”的内部挖空，再向其中注入“蕈状支原体”的DNA（脱氧核糖核酸），最后新的支原体终于开始自我繁殖，成为世界首个“人造生命”。

Synthia ‘辛西娅’ 是一个人工合成的基因组，是第一个人工合成的细胞，也是第一种以计算机为父母的可以自我复制的生物。 Science, 2010

目的基因克隆的基本步骤 ①分离获得目的基因； ②在体外进行DNA重组，将外源DNA连接到能 自我复制又带有选择标记的载体上；

外源DNA 载体DNA 连接 重组分子 转化或转导 真核细胞 原核细胞 受体细胞 扩增或表达 表达

化学合成目的基因 外源DNA的获取 一、目前常用的方法 磷酸二酯法、 磷酸三酯法、 亚磷酸三酯法、 固相合成法 自动化合成法。 1976年H.G. Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。 一、目前常用的方法 磷酸二酯法、 磷酸三酯法、 亚磷酸三酯法、 固相合成法 自动化合成法。

预先设计合成的片断之间都有互补区域，不同片断之间的互补区域能形成有断点的完整双链。 二、 化学合成DNA片断的组装 化学合成的DNA片断一般在200bp以内。 1. 互补连接法 （1）互补配对 预先设计合成的片断之间都有互补区域，不同片断之间的互补区域能形成有断点的完整双链。 （2）5’端磷酸化 用T4多核苷酸激酶使各个片段的5’端带上磷酸。 （合成的DNA单链的5’端是-OH）

（3）连接酶连成完整双链 T4多核苷酸激酶 使5’-OH磷酸化 T4 DNA连接酶 完整的DNA双链

引物 2. 互补延伸连接法 预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作为另一个片断延长的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的双链。 5’ 3’ Klenow片段 5’ 3’ T4DNA连接酶 5’ 3’

三、 寡聚核苷酸化学合成的优点 1. 直接合成基因 （1）mRNA的含量很低，很难作cDNA （2）有些基因比较短，化学合成费用较低 2. 合成引物（20mer左右） 3. 合成探针序列 4. 定点突变合成 合成带有定点突变的基因片断。

5. 合成人工接头或衔接物 含有各种酶切位点人工接头（Adaptor）或衔接物（Linker）序列。 EcoRI Adaptor EcoRI Linker DNA合成仪

PCR扩增获得目的基因 使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待 扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序 列化学合成聚合反应必需的双引物。

1. 直接从基因组中扩增 （1）提取基因组DNA作模板 （2）根据目的基因序列设计引物 （3）PCR扩增 适合扩增原核生物基因。 真核生物基因组含有内含子！

原核细胞 提取基因组DNA 原核基因组部分 PCR扩增

2. 从mRNA中扩增: RT-PCR （1）提取基因组 total RNA （2）反转录合成总cDNA作模板 （3）根据目的基因序列设计引物 （4）PCR扩增 适合扩增真核生物基因。 原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾。

mRNA 目的基因 的引物1 反转录成目的基因cDNA第一链 目的 基因cDNA第二链 目的基因 的引物2 PCR

通过基因文库筛选目的基因 文库 载体 探针 测序分析 电泳后杂交放射自显影 用目的基因探针与文库中的重组载体进行Southern blot杂交。 文库 载体 探针 测序分析 电泳后杂交放射自显影

载体DNA vector 把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。

载体的功能 (1) 为外源基因提供进入受体细胞的转移能力。 (2) 为外源基因提供在受体细胞中复制能 力或整合能力。 (3) 为外源基因提供在受体细胞中扩增表 达必需的条件。

常用的载体有6类： 质粒（plasmid） 单链DNA噬菌体M13 噬菌体的衍生物 柯斯质粒（cosmid） 动物病毒（virus） 人造染色体载体

DNA片段的体外连接 DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与3’-OH连到一起。

重组体导入细菌细胞 （1）热休克法 10ng载体DNA 吸附DNA 摄入DNA On ice混合，静置10分钟 42ºC 1分钟 100L感受态菌 加入1mL LB培养基 10-100L转化液涂含抗菌素的平板 37℃摇1小时

（2）电转化法 冰浴15分钟，2°C离心集菌 冰冷的水重悬菌体 LB培养受体菌至OD600=0.5-0.6 2°C离心集菌 分装成 冰冷的10%甘油重悬菌体 2°C离心收集菌体 冰冷的10%甘油重悬菌体 2°C离心集菌 分装成 20-40L 电转仪调为2.5kV,25F On ice混合 转化 10ng质粒DNA 脉冲控制器200-400 加入1mLSOC培养液 10-100L转化液涂含抗菌素的平板 37°C中速震荡1小时

4. 平板培养基培养细菌 10-100L转化液 涂于含抗菌素的平板 37℃过夜

植物转基因技术 (1) 载体介导法, 如农杆菌介导转化法 根瘤 ① Ti质粒 存在于能引起植物形成冠瘿瘤的土壤农杆菌中，诱导冠瘿瘤形成，又称肿瘤诱导质粒（tumor inducing plasmid）。 根瘤

T-DNA（transferred-DNA） 转移DNA，编码冠瘿碱的合成，能随机整合到植物的染色体上。长度一般为12-24kb，是Ti质粒最重要的部分。 冠瘿碱（opine）的作用 冠瘿碱是在冠瘿瘤内合成并分泌出来的，是农杆菌的碳源和氮源。大部分其他土壤微生物都不能利用冠瘿碱。

决定土壤农杆菌对植物的感染和T-DNA的转移， 进入和整合。 毒性基因（vir） 决定土壤农杆菌对植物的感染和T-DNA的转移， 进入和整合。 冠瘿碱代谢基因 分别编码代谢冠瘿碱的酶。维持农杆菌生长。

② 农杆菌的感染和生存 第一步:植物受伤 植物受伤后能分泌酚类化合物（如乙酰丁香酮、羟基乙酰丁香酮），诱导Ti质粒上的毒性基因表达。 第二步 感染植物 农杆菌吸附于植物的表面伤口部位（常在茎的基部）。

第三步 毒性基因（vir）表达 virA、virG、virD、virB 第四步 T-DNA转移 T-DNA被vir基因产物切下来，并运送到植物细胞核里，整合到植物基因组中。 第五步 诱导冠瘿瘤 T-DNA上的产物催化产生过量的生长素和细胞分裂素，形成植物冠瘿瘤。 第六步 土壤农杆菌代谢冠瘿碱。

改造后的Ti质粒载体模式 left right M C S AMPr ori Vir select

消毒 土壤农杆菌浸泡 切取 叶盘 筛选培养基 愈伤组织 分化幼苗

优点: 多为单拷贝或寡拷贝整合，转基因遗传较 　稳定，减少了共抑制等基因沉默现象． 属于单细胞转化，不存在嵌合体现象； 成本较低，转化效率较高。

(2) DNA直接转移法 ①电击法 转化效率较低，且仅限于能由原生质体 再生出植株的植物。 纤维素酶和果胶酶 植物细胞 原生质体 DNA 1-2kV, 3-25F电击 混合入电击缓冲液 分化 愈伤组织 幼苗 转化效率较低，且仅限于能由原生质体　 　再生出植株的植物。

② 基因枪法（gene gun） 基因枪法最早是由美国康奈尔大学的Sanford最先提出的。它通过高速飞行的金属颗粒将包被其外的目的基因直接导入到受体细胞内，从而实现基因转化的方法。1992年，世界首例转基因小鼠就是通过该法获得的。

又称高速微粒轰击法（High-velocity microprojectiles) ② 基因枪法（gene gun） 又称高速微粒轰击法（High-velocity microprojectiles) DNA 1.2m钨弹头 特制手枪 吸附 装入 射击植物 但进去的DNA片段整合效率极低，不易获得再生植株，可能发生共抑制现象.

Pita pita Jia et al. Plant Cell

8.2 植物生物反应器 植物生物反应器是指通过基因工程途径，以常见的农作物作为“化学工厂”，通过大规模种植生产具有高经济附加值的医用蛋白、工农业用酶、特殊碳水化合物、生物可降解塑料、脂类及其它一些次生代谢产物等生物制剂的方法。

8.2 植物生物反应器 在植物生物反应器研究中，最受人们关注同时研究进展也最快的是生产各种疫苗用的抗原蛋白。 8.2 植物生物反应器 在植物生物反应器研究中，最受人们关注同时研究进展也最快的是生产各种疫苗用的抗原蛋白。 疫苗的形式也由菌体疫苗发展到亚单位疫苗（Subunit  vaccine），甚至还产生了DNA疫苗。

1992年，美国人C.J.Arntzen和H.S.Mason率先提出了用转基因植物生产疫苗的新思路。 此后，国内外多个实验室相继在烟草、马铃薯、番茄、苜蓿和莴苣中表达了乙肝表面抗原、大肠杆菌热敏毒素B亚基、霍乱毒素B亚基、诺瓦克病毒壳蛋白和狂犬病毒G蛋白等抗原，并利用在植物中表达的抗原进行了动物和人体的免疫实验，获得了大量有价值的研究数据，为今后利用转基因植物生产疫苗奠定了良好基础 。

植物来源的重组药用蛋白第一次临床应用研究是由星球生物技术有限公司（Planet  Biotechnology,  Inc）. 美国著名的孟山都公司（Monsanto）已经培育出一种转基因玉米，每公顷玉米可以产生3.7公斤达到药用蛋白标准的人类抗体。 植物来源的抗体在体外的稳定性和体内的生物活性与动物细胞培养来源的抗体是相同的，利用它将开发出一种低成本的治疗方法来防治某些由性传播的疾病。

  Large  Scale  Biology公司和斯坦福大学已经合作开发了一种肿瘤特异性疫苗，可用于阻止细胞的恶性生长，它们利用植物病毒作为瞬时表达系统。  另外一个引起全球关注的研究成果是，瑞士联邦技术研究所, 在2000年将水仙的八氢番茄红素合成酶和番茄红素环化酶基因导入水稻，研制出一种富含β胡萝卜素（维生素A前体）的水稻，品种名称T309，每克稻米含1.6mg胡萝卜素，由于稻米色泽金黄，故称为“金色大米”。

 我国植物生物反应器的研究始于上世纪90年代初期，虽然在构建高效植物表达载体和培育转基因植物等主要技术环节上与国外相差无几，但在研究的广度和深度上与发达国家相比却存在很大差距。 幸运的是，在制订“九五”，“十五”“863”计划时，选择了“利用转基因植物生产口服疫苗和生物可降解塑料”等研究课题予以资助。已取得较多的研究成果。

我国植物生物反应器的研究和利用还主要集中在药用蛋白的研究和应用方面。而利用转基因植物生产特殊饱和或不饱和脂肪酸、改性淀粉、环糊精或糖醇、次生代谢产物、工农业用酶制剂的研究仍然没有引起国家足够的重视，其实，这些生物制剂的市场潜力也是非常可观的。 如利用转基因玉米生产植酸酶，在加工成动物饲料添加剂后，可有效降低家畜排泄物中的磷含量，这对于降低水污染和保护生态环境方面很有意义。

 目前，利用重组DNA技术生产的大多数治疗用血液蛋白几乎都是在哺乳动物细胞表达系统中生产出来的。该系统的主要优点是所表达的重组蛋白能够进行正确的折叠及完成其他翻译后加工过程的机会比较高，然而，有许多因素仍然限制哺乳动物细胞表达系统的广泛应用，这些因素包括：         1）即使在最适的培养条件下，重组蛋白在哺乳动物细胞中的表达水平仍很低，通常为每天每升数十毫克；         2）重组蛋白最后必需从培养液中分离提纯出来，这会进一步导致产量损失和增加生产成本；

  3）哺乳动物细胞表达系统日常维护费用非常高，这也使产品的生产成本居高不下；     4）哺乳动物细胞对外力比较敏感，而振荡培养通常又是工业化大规模生产所不可缺少的，这就使扩大生产规模变得相当困难；       5）胎牛血清是哺乳动物细胞生长所不可缺少的，它的价格昂贵，而且不同批次之间成份相差很大，这些变化会导致细胞的生长情况不一致，进而影响到细胞发酵过程及下游的提纯加工过程；         6）哺乳动物细胞对一些环境因素如温度、pH值、含氧量和次生代谢产物的变化非常的敏感，因此需要对培养条件进行精确的监控；        7）利用哺乳动物细胞培养表达系统不能避免病原生物的污染。

 由于存在着上述限制因素，利用植物作为生物反应器生产具有临床应用价值的药用蛋白日益引起人们的关注。 尤其是当重组蛋白需求量比较大，利用植物表达系统很显然是一个不错的选择，它除了具备其它真核生物表达系统共有的那些优点外，还有一些是其它表达系统所不具备的。