干细胞与组织再生

再生(regeneration)指生物体受损后的组织或器官的重新形成已失去部分的过程。 组织修复/组织再生

自然界中生物的再生现象 将水螅切断后，断面能够识别头部或者尾部的位置，如果切掉的是头，头部将在该位置再生；如果切掉的是尾，尾巴将在该位置再生。 蝾螈的四肢、壁虎的尾巴都具有自然再生的能力 人体组织也有再生现象。 　　

再生机制的研究 了解一个新生的水螅细胞为何会生成一个整体 了解同是两栖动物的蝾螈、青蛙和蝌蚪的再生能力为什么不同 了解人类为什么不能再生肢体 是否可以利用生物技术帮助人类把受到损伤的肢体、器官或者组织再生，形成新的有功能的部分。

细胞的再生 物种的再生能力与组织和器官的分化程度相反。 肌体的再生和细胞的修复均由干细胞来补充。 胚胎干细胞是目前已知分化功能最为强大的干细胞。 组织干细胞保持着自我更新和分化的潜能，维持组织器官的稳态平衡。

干细胞 stem cell 干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，能够产生至少一种类型的、高度分化的子代细胞。 它的主要功能是控制和维持细胞的再生。

按分化潜能可将干细胞分为 全能干细胞(totipotent stem cell) ，任何一个细胞都可以发育成一个完整个体，如受精卵－桑葚胚 多能 干细胞(pluripotent stem cell) ，可以分化为来自内、中、外三个胚层的各种细胞，如胚胎干细胞 专能干细胞(multipotent stem cell )，如上皮组织基底层的干细胞、肌肉中的干细胞、造血干细胞…… 单能干细胞（unipotent stem cell ），如表皮干细胞

按发生学来源，分为胚胎干细胞和成体干细胞 人类胚胎干细胞

成体干细胞(somatic)：出现在已特化的组织中的未分化的细胞，能够自我更新，并且能分化产生该组织的各种特化类型的组织细胞。 An adult stem cell collected from human bone marrow

干细胞具有未分化或低分化特性，多向分化潜能。 干细胞具有“无限”的自我更新能力。 可连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止状态。 干细胞的生物学特征 干细胞具有未分化或低分化特性，多向分化潜能。 干细胞具有“无限”的自我更新能力。  可连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止状态。 胚胎干细胞和某些组织干细胞的增殖能力非常旺盛，尤其是胚胎干细胞的分裂十分活跃。 干细胞经过分化进程逐渐变为具有特殊功能的终末分化细胞，与此同时干细胞的多向分化潜能也逐渐丧失。 干细胞（尤其是组织干细胞）的重要作用是作为成体组织细胞的储备库，它们在某些特定条件下可以进一步分化为成熟细胞或终末分化细胞（terminally differentiated cell），执行特定组织细胞的功能 12

干细胞的形态及生化特征 形态：体积小、核大、细胞器不发达…… 生化：干细胞的共同标志，如端粒酶活性 不同干细胞的特有标志，如人造血干细胞表现为CD34和 CD133 ；上皮干细胞有高表达的β1整合素，可介导干细胞与细胞外基质粘附从而抑制其分化的发生；神经干细胞 Nestin、CD133和CD24等

本质特征：具有增殖和自我更新能力以及在适当条件下表现出一定的分化潜能。

增殖方式独特 分裂的周期性慢，绝大多数干细胞处于G0期。 进入分化程序时先经过一个短暂的增殖期，形成过渡放大细胞（transit amplifying cell）

意义：缓慢增殖有利于对外界信号做出反应，减少发生基因突变的危险，而快速分裂的过渡放大细胞使干细胞仅进行较少次数的分裂即可产生较多数量的分化细胞。

增殖有自稳定性 通过自我更新（self-renewing）和维持自身数量实现自稳定性（self-maintenance）。 在自我更新中，分裂的形式分为对称分裂和不对称分裂。

对称分裂symmetry division：干细胞分裂产生同类型细胞，如两个子细胞都是干细胞或都是分化细胞 不对称分裂asymmetry division：干细胞分裂产生不同类型细胞，如两个子细胞中一个是干细胞另一个是分化细胞

干细胞有可塑性 在适当条件下，可实现细胞的转分化和去分化。 转分化（transdifferentiation） ：一种组织类型的干细胞，在适当条件下分化成另一组织类型的细胞。 去分化（dedifferentiation）：干细胞向其前体细胞的逆向转化。

1999年Goodell分离出小鼠的肌肉干细胞，体外培养5天后，与少量的骨髓间质细胞一起移植入接受致死量辐射的小鼠中，结果发现肌肉干细胞会分化为各种血细胞系。

该现象的调控机制目前还不清楚。大多数观点认为干细胞的分化与微环境密切相关。可能的机制是，干细胞进入新的微环境后，对分化信号的反应受到周围正在进行分化的细胞的影响，从而对新的微环境中的调节信号做出反应。

干细胞微环境 一系列的干细胞与细胞外所有物质共同构成的细胞生长的微环境，又称为干细胞巢（stem cell niche）。 是干细胞维持自我更新和分化潜能的重要场所。 25

干细胞微环境包括多种组成成分 信号分子:以自分泌或旁分泌的形式影响干细胞的增殖与分化。 细胞黏附分子:确保干细胞定居于微环境中，并接受信号分子的调节。 细胞外基质:对干细胞正常功能的维持提供了重要信号，并且可以直接调节干细胞的分化方向。 空间效应:空间结构对保持适宜的干细胞数目和干细胞的定向分化发挥了重要作用。

果蝇卵巢干细胞微环境 生殖干细胞GSC位于卵巢原卵区的顶部，并被三种不同的基质细胞群所包绕：端丝、帽细胞以及内鞘细胞。这三种基质细胞以及基膜共同构成微环境，其中帽细胞通过紧密连接固定GSC，与其他基质细胞产生的细胞信号分子共同调控GSC的生长和分化。 27

干细胞需要特殊的微环境才能执行正常的生理功能 如果将造血干细胞从其正常生存的微环境中分离，它们即丧失了自我更新的能力。 微环境还能调控干细胞的分化发育方向，在不同信号途径构成的微环境中，干细胞能向不同的谱系细胞分化。

黄禹锡造假事件

胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC) 在人胚胎发育早期—囊胚中含有未分化的细胞。 囊胚含有约140个细胞，外表是一层扁平细胞，称滋养层，可发育成胚胎的支持组织如胎盘等。中心的腔称囊胚腔，腔内一侧的细胞群，称内细胞群（inner cell mass, ICM） 。

内细胞群在形成内、中、外三个胚层时开始分化。每个胚层将分别分化形成人体的各种组织和器官。 当内细胞群在培养皿中培养时，我们称之为胚胎干细胞。

ESC特点 可在体外无限培养增殖 长期保持原始状态 可分化衍生出各类组织细胞

ESC的获得 Thomson的工作:从人类胚胎的囊胚期内细胞群中直接分离多能干细胞。学者们从体外受精临床实验室得到胚胎，这些胚胎是不育症临床治疗后不需要的，用于繁殖，而非研究目的。从捐献者夫妇处获得知情同意书后，Dr.Thomson分离了内细胞群,将这些细胞进行培养，产生一个多能性干细胞系。

Gearhart的工作：从终止妊娠的胎儿组织中分离出多能性干细胞。捐献者自行决定了终止妊娠，从他们那儿获得了知情同意书后，Dr Gearhart的工作：从终止妊娠的胎儿组织中分离出多能性干细胞。捐献者自行决定了终止妊娠，从他们那儿获得了知情同意书后，Dr. Gearheart从原本要发育成睾丸或卵巢的胎儿部位取得细胞。尽管Dr. Thomson 实验室和Dr. Gearheart实验室使用的细胞系来源不同，但发育成熟的细胞看起来非常相似。 胚胎生殖细胞(embryonic germ cell, EG cell ) ：来自于早期胚胎（5-10周）胎儿生殖嵴的原生殖细胞，也属于多能干细胞。

体细胞核转移 将一个正常的动物卵细胞去除细胞核（含染色体的细胞结构）。存留在卵细胞内的物质含营养成分和对胚胎发育非常重要的能量物质。而后，在非常精细调控的实验室条件下，将单个体细胞—除卵细胞或精子细胞之外的任一种细胞—与除去核卵细胞放在一起，使两者相融合。融合细胞以及其子细胞具有发育成一个完整个体的潜能，因此是全能性的。

胚胎干细胞的主要特征 形态：体积小、核大、紧密堆积，无明显细胞界限 生化：胚胎阶段特异性抗原（stage-specific embryonic antigen，SSEA） 端粒酶活性高 分化能力强，可在体外长期培养

将ESC注射到裸鼠皮下，小鼠可产生畸胎瘤。分化的胚胎组织包括胃上皮组织(内胚层),骨和软骨组织、平滑肌和横纹肌(中胚层)，神经表皮、神经节和复层鳞状上皮(外胚层)等。

LIF是目前唯一明确的保持小鼠干细胞特性的重要细胞因子 LIF-STAT信号通路图

为什么进行胚胎干细胞研究 干细胞技术的市场前景 优点明显 研究干细胞增殖和分化机制的最终目的是应用干细胞治疗疾病。理论上讲，干细胞可以用于各种疾病的治疗，但其最适合的疾病主要是组织坏死性疾病如缺血引起的心肌坏死，退行性病变如帕金森综合征，自体免疫性疾病如胰岛素依赖型糖尿病等。 优点明显 应用干细胞治疗疾病较传统方法具有很多优点： 低毒性（或无毒性），一次给药有效； 不需要完全了解疾病发病的确切机理； 还可能应用自身干细胞移植，避免产生免疫排斥反应。

存在的问题 ESC的分离培养首先需要解决的问题是阻止引起分化的基因的激活与表达，以实现分化抑制，保证细胞的全能性。ESC在体外需在饲养层(feeder layer)细胞上培养才能维持其未分化状态，一旦脱离饲养层就自发地进行分化。 选择合适培养基，添加LIF（小鼠ES细胞 ）

如何定向诱导干细胞分化？细胞分化是多种细胞因子相互作用引起细胞一系列复杂的生理生化反应的过程，因而要诱导产生某种特异类型的组织，需要了解各种因子在何时何地开始作用，以及何时何地停止作用。

由胚胎干细胞在体外发育成一完整的器官尤其是像心、肝、肾、肺等大型精细复杂的器官这一目标还需要技术上的突破。因为器官的形成是一个非常复杂的三维过程。即便是一发育完整器官，要离体培养并维持其正常的生理功能目前还无法做到，器官的体外保存和维持仍是器官移植中的难题。

如何克服移植排斥反应 对胚胎干细胞及其衍生细胞的移植的安全性尚需做全面、客观、深入的评价。 人胚胎干细胞的来源是否合乎法律及道德，应用过程中所产生的伦理及法律问题如何处理。

有一种观点认为胚胎干细胞研究是没有必要的，因为成体干细胞完全可以取代胚胎干细胞。 研究表明人体脂肪、胎盘等组织中的干细胞，具有惊人的可塑性，和胚胎干细胞一样，可以分化成各种各样的组织细胞，可以通过诱导使成体干细胞进行特化发育，然后将其移植回病人体内，这样既可以避免发生排斥现象，也可以避免使用来源于人体胚胎或人体胎儿的干细胞。

成体干细胞的不足之处： 人们尚未从人体的全部组织中分离出成体干细胞，例如人们尚未发现人类的成体心脏干细胞。 成体干细胞含量极微，很难分离和纯化，且数量随年龄增长而降低。 在一些遗传缺陷疾病中，遗传错误很可能也会出现于病人的干细胞中，这样的干细胞不适于移植。 成人身上获得的干细胞可能没有年轻人的干细胞那样的增殖能力。 由于日常生活中人是暴露在各种环境之下的，日光和毒素等都有可能造成基因突变，成体干细胞可能包含更多的DNA异常等等。

成体干细胞 造血干细胞 间充质干细胞 神经干细胞 表皮干细胞 肝干细胞

iPS细胞（induced pluripotent stem cells） 2006年Yamanaka发现，胚胎干细胞中存在一系列特异性表达的蛋白质，而当胚胎干细胞分化时，这些蛋白表达减少。提出如果在小鼠体细胞内表达这些蛋白，或许能使体细胞转变为具有干细胞全能性质的细胞。

经过研究发现可使用病毒载体将Oct4，Sox2，c-Myc和Klf4等转录因子导入到小鼠皮肤成纤维细胞，形成具有干细胞形态的细胞群落。这些细胞群落具有SSEA，也通过畸胎瘤形成等其他干细胞指标检测，充分证明了它们具有多能性。

这一发现分别被《自然》和《科学》杂志评为2007年第一和第二大科学进展。 2008年4月，美国科学家将实验鼠皮肤细胞改造成iPS细胞，然后成功使其分化成心肌细胞、血管平滑肌细胞及造血细胞。 2009年2月，日本科学家宣布成功利用人类皮肤细胞制成的iPS细胞培育出血小板，而且声称从技术上说用iPS细胞培育人类红细胞和白细胞都是可能的。

iPS细胞与胚胎干细胞相比有很多优点： iPS细胞则由体细胞诱导产生，不存在来源的问题。 iPS细胞取自病人组织，产生的是病人特异的干细胞，避免了免疫排斥反应。 iPS细胞缺点： c-myc是原癌基因，此基因的失控会导致癌症的发生。 iPS小鼠存在明显的健康问题，死亡率很高。 慢病毒载体的使用也会导致基因组的整合，诱发致癌危险。 iPS在研究和应用上都面临着很多的挑战，解决这些问题将促进iPS细胞在临床治疗中的研究及应用。

The end