尼妥珠单抗不同给药时间对人肺腺癌A549、Calu-6细胞放射增敏作用的研究 第一作者：刘晓斌 指导教师：袁智勇 天津医科大学附属肿瘤医院 放疗科/肺癌诊治中心

研究背景 ★肺癌发病率高 ，非小细胞肺癌占80%， 总5年存活率低。 ★放疗疗效仍不理想 。 ★放射增敏剂可以提高放疗疗效。分子 靶向药物：低毒、高效，表皮生长因 子受体（EGFR）成为治疗肺癌靶点。 在恶性肿瘤的发病中，目前肺癌的发病在世界上位居首位，超过80%是非小细胞肺癌（NSCLC）。 约30%-40%的局部晚期NSCLC患者需要采取放射治疗。 尽管随着各种肿瘤放疗新技术的发展，NSCLC的放疗疗效有了一定程度的提高，但总的疗效并不理想，5年生存率仅10%左右。 放疗增敏剂也有好多类，一些分子靶向治疗药物以其“低毒高效”的特点引起了大家的关注。在某些相应的肿瘤治疗中取得了惊人的疗效，比如美罗华用于CD20阳性淋巴瘤患者、赫赛汀用于HER-2过表达的乳腺癌患者以及特罗凯及易瑞沙成为某些肺癌患者的福音等。 分子靶向治疗所展现 出的与传统放化学治疗的协同作用使肿瘤综合治疗的科学性更趋完美。 已有文献表明，EGFR抑制剂可以增加放疗敏感性。

存在问题 ？EGFR抑制剂联合放疗的最佳给药时 间尚不明确。 ？ EGFR抑制剂联合放疗治疗相同类型 肿瘤时，疗效差别较大，具体原因不明， 尚缺乏预测放射增敏疗效的相关指标。 EGFR抑制剂联合放疗的最佳给药时间目前研究甚少，多数为放疗同时或者接近放疗时给药。同时，EGFR自身的多样性以及肿瘤细胞受体表达水平的异质性决定了不同肿瘤以及不同个体对EGFR抑制剂敏感程度的差异性，而目前EGFR抑制剂应用的针对性不强，临床应用同样的治疗方案治疗相同类型的肿瘤，疗效上往往存在较大的差异，这是亟待解决的问题。 EGFR抑制剂能将细胞阻滞在G1期，按照细胞周期的运动规律，可能在照射前24～48h给药疗效最佳，此时细胞多数进入照射敏感的G2/M期，从而使射线在最大程度上杀灭肿瘤细胞 。

研究对象和目的 ★对象 ◆细胞系：人肺腺癌A549、Calu-6细胞系 ◆主要试剂：尼妥珠单抗 ◆主要仪器：医科达直线加速器 ★目的 ●明确尼妥珠单抗联合放疗的最佳给药时间。 ●两种细胞采用相同实验方案，观察结果是否相同，并探讨产生差异的原因。 本课题采用体外培养的A549 、Calu-6细胞株作为研究对象，选择药物为EGFR抑制剂尼妥珠单抗。研究目的：⒈明确尼妥珠单抗放射增敏作用的最佳给药时间。⒉两种细胞采用相同实验方案，观察结果是否不同，并探讨产生差异的原因。

Western blot检测A549、Calu-6EGFR表达 实验设计 Western blot检测A549、Calu-6EGFR表达 流式细胞术 细胞周期 细胞凋亡 MTT实验计算 A549、Calu-6各自的IC20 /IC50值 Western blot 原因 凋亡指标 Bax BCL-2 24h前加药 关卡蛋白 P21 同时加药 细胞克隆 形成实验 SER 放疗 放射损伤 实验方法：体外培养的人肺腺癌A549 、Calu-6细胞为研究对象，选择处于对数生长期的两种细胞，各自分为6个实验组：空白对照组（O组）、单用尼妥珠单抗组（N组）、单独照射组（R组）、照射前24小时加药组（N→R组）、照射同时加药组（NR组）、照射后24小时加药组（R→N组）。噻唑蓝（MTT）比色法分别检测尼妥珠单抗对两种细胞的抑制作用，计算各自的IC50和IC20值，选择IC20值作为后续实验浓度。克隆形成实验检测尼妥珠单抗不同给药时间对人肺腺癌A549 、Calu-6细胞的放射增敏作用并绘制细胞存活曲线。流式细胞仪（FCM）检测两种细胞系的细胞周期和细胞凋亡指数的变化。Western blot 分别检测各个实验组EGFR，phospho-DNA-PK， Bcl-2，Bax，P21，Akt和pAkt等蛋白的表达。 p-DNA-PK 24h后加药 下游通路 Akt pAkt

实验结果 WESTERN BIOT检测两种细胞EGFR表达 A:A549或者Calu-6细胞 B:阳性对照 C:阴性对照 MTT检测尼妥珠单抗对两种细胞的增殖抑制作用 两种细胞均存在EGFR表达，其中A549细胞表达水平较高。灰度值：A549 VS Calu-6 ：0.9025±0.086 VS 0.7263±0.045 （p＜0.05 ） 细胞系 IC20 IC50 A549 1.15±0.18 24.78±1.16 Calu-6 2.45±0.32 51.15±1.58 24hIC20

克隆形成曲线 A549 Calu-6

克隆形成结果 细胞及分组 D0 Dq N SER A549 R组 2.47 1.56 1.88 --- N→R组 1.22 0.34 1.32 2.02 NR组 1.65 0.68 1.51 1.50 R→N组 1.96 0.95 1.62 1.26 Calu-6 2.75 2.05 2.11 1.46 0.42 1.33 2.52 1.81 1.09 2.83 2.79 2.68 0.97 尼妥珠单抗无论采用何种加药时间均增强了A549细胞的放射增敏效应，但以放疗前加药增敏效应最为明显。Calu-6细胞仅在放疗前加入尼妥珠单抗产生了较明显的放疗增敏效应。

A549细胞周期图 O N R O N R N→R NR R→N N→R NR R→N N→R NR R→N N→R NR R→N

A549细胞周期结果 组别 A549 G0/G1（%） S（%） G2/M（%） O组 55.85±2.32 18.73±0.03 25.42±2.35 N组 81.28±2.09* 8.32±0.76 10.22±1.54 R组 43.40±3.36 15.55±2.28 41.05±1.84 N→R组 23.28±1.82 6.73±0.53 68.32±1.92* NR组 32.77±2.81 13.13±0.69 53.77±2.88 R→N组 35.20±1.01 13.51±0.80 51.28±1.69 A549各组细胞所占细胞周期比例 ：N组均导致G1/G0期细胞比例达到最高，R组使G2/M期细胞比例增加； 与R组相比，N→R组、NR组、R→N组均使G2/M期细胞比例增加，其中N→R组G2/M期细胞比例最高。 *表示与相同时相其它实验组比较P值均<0.05

Calu-6细胞周期图 O N R N→R NR R→N

Calu-6细胞周期结果 组别 Calu-6 G0/G1（%） S（%） G2/M（%） O组 62.07±1.98 21.06±1.42 16.87±0.75 N组 63.80±2.99 19.33±1.89 16.86±1.22 R组 46.93±1.91 15.07±2.08 38.00±0.65 N→R组 41.30±1.03 11.84±1.88 46.87±1.07* NR组 45.81±3.12 12.29±1.70 41.90±1.68 R→N组 46.00±2.23 14.47±1.51 39.53±0.91 Calu-6 各组细胞所占细胞周期比例 ： N组G1/G0期细胞阻滞不明显， N→R组G2/M期细胞比例最高。 *表示与相同时相其它实验组比较P值均<0.05

A549细胞各组凋亡图 O N R N→R NR R→N N→R NR R→N 细胞凋亡流式细胞仪检测图分4个象限，左上象限为第一象限（anexin阴性，PI阳性）代表细胞在处理过程中的机械性损伤；右上象限为第二象限（annexin阳性，PI阳性），代表细胞坏死；左下象限为第三象限（annexin阴性，PI阴性），代表正常细胞；右下象限为第四象限（annexin阳性，PI阴性），代表细胞凋亡。

Calu-6细胞各组凋亡图 O N R N→R NR R→N 细胞凋亡流式细胞仪检测图分4个象限，左上象限为第一象限（anexin阴性，PI阳性）代表细胞在处理过程中的机械性损伤；右上象限为第二象限（annexin阳性，PI阳性），代表细胞坏死；左下象限为第三象限（annexin阴性，PI阴性），代表正常细胞；右下象限为第四象限（annexin阳性，PI阴性），代表细胞凋亡。

A549、 Calu-6细胞凋亡结果 组别 A549 （%） Calu-6 （%） O组 1.30±0.43 1.62±0.68 N组 10.85±0.35 5.17±0.40 R组 17.49±0.84 18.63±0.43 N→R组 57.78±1.08* 36.06±1.40* NR组 40.46±0.81 20.59±1.27 R→N组 37.51±1.24 19.42±0.69 尼妥珠单抗作用于两种细胞系均可以提高放射线诱导的调亡，但N→R组调亡率达到最高。 *表示与相同细胞系其它实验组比较P值均<0.05

WESTERN BLOT Western blots检测结果： 尼妥珠单抗联合6Gy辐射后48小时，两种细胞系均表现为：Bax蛋白表达增加，Bcl-2蛋白表达减少，在放疗前24小时加药组Bax达最高值，Bcl-2达最低值。 G2/M期关卡的P21蛋白表达在放疗前加药达到最高水平。phospho-DNA-PK以对照组的基础表达最低，放疗后增加，放疗联合尼妥珠单抗后减低，放疗前加药减至最低。上述改变表明两种不同的细胞系，尼妥珠单抗放疗协同效应最佳顺序均为放疗前24h给药。

各组Akt、pAkt灰度值 组别 A549 Calu-6 Akt pAkt O组 0.81612±0.00071 0.53735±0.00028 0.88267±0.00131 0.58383±0.00090 N组 0.81563±0.00008 0.53576±0.00103 0.88212±0.00091 0.58156±0.00045 R组 0.81541±0.00042 0.54701±0.00052 0.88424±0.00221 0.58818±0.00054 N→R组 0.81581±0.00045 0.49458±0.00058* 0.87998±0.00048 0.57863±0.00095* NR组 0.81613±0.00034 0.52547±0.00061 0.88197±0.00123 0.58624±0.00130 R→N组 0.81668±0.00061 0.53632±0.00027 0.88196±0.00172 0.58611±0.00118 1、Calu-6细胞Akt、pAkt表达均高于A549细胞。 2、两种细胞不同处理组间Akt表达水平不存在差异。尼妥珠单抗能抑制A549细胞pAkt的表达，但对Calu-6细胞系无效，单纯照射后两种细胞pAkt蛋白的表达略提高，比较单纯照射组，尼妥珠单抗联合照射组放疗前加药组两种细胞均减至最低。 *与各个实验组比较，p＜0.05

小结㈠ ◆相同的结果 两种细胞N→R组的SER最高。 两种细胞N→R组的G2/M期比例和凋亡率最高 。 两种细胞N→R组的Bax、 P21达最高值，Bcl-2 、phospho-DNA-PK达最低值。各组Akt表达无差异。 pAkt表达在N→R组表达减至最低 。 ☆上述改变表明两种不同的细胞系，尼妥珠单抗放疗协同效应最佳顺序均为放疗前24h给药。

小结㈡ ◆不同的结果 尼妥珠单抗对A549细胞的抑制作用更强。 尼妥珠单抗无论何时给药均对A549细胞产生放射增敏作用，而Calu-6细胞仅见于放疗前给药。 Calu-6细胞N组的G0/G1期阻滞不明显， NR组、R → N 组未见G2/M期比例和凋亡率升高。 A549细胞EGFR表达较高，而Calu-6细胞Akt、 pAkt表达较高。

讨论 ⒈A549、Calu-6细胞实验结果不同的潜在原因： ⑴ EGFR单抗的放射增敏作用与肿瘤细胞表面的EGFR表达水平密切关系。 ⑵Akt、 pAkt可能是抗EGFR疗法中的耐药因子。 ⒉推测Calu-6细胞系若要进一步增强放射增敏效应，是否应加大药量或是延长作用时间。 ⒊尼妥珠单抗对A549、Calu-6细胞系的最佳给药时间均为放疗前，不同细胞的最佳给药量需进一步明确。 ⒋尼妥珠单抗不同作用时间对放射增敏作用的影响机制尚有待于更深入的研究。 Y Akashi等[1]人的研究试图解释这一问题，他们应用Nimotuzumab 联合放疗作用于5种EGFR表达水平不同的NSCLC细胞系及其裸鼠荷瘤模型，结果显示EGFR高度和中度表达的肿瘤细胞无论在体内还是体外均表现出明显的放射增敏作用，其中EGFR高度表达的肿瘤细胞表现最明显，而EGFR低度表达的细胞，Nimotuzumab的放射增敏作用不明显。该研究结果提示，Nimotuzumab的放射增敏作用依赖于细胞表面的EGFR表达水平，EGFR表达水平越高，放射增敏作用越明显。 Perez等[2]的研究显示：耐厄洛替尼的细胞株Akt和pAkt表达水平明显升高。 Nathan等[3]发现PI3 K信号通路抑制剂PX 866能增加NSCLC患者对EGFR抑制剂如Gefitinib的反应性。 研究表明Gefitinib抑制高度(SK BR 3)、中度(MDA MB 361)和低度(MDA MB 468)3种乳腺癌细胞系EGFR的活化，但高度、中度敏感性的两组P42/p44 MAPK和AKT活化明显减少[4]。PI3K抑制剂LY294002或MEK抑制剂PD98059能显著地抑制MDA MB 468细胞系的生长。同这一发现相一致的是：PD98059和Gefitinib对MDA MB 468细胞具有协同作用，而对另两种细胞系具有累加作用。同单药相比，这两者的联合也使得MDA MB 468细胞系的凋亡增加。 [1] Y Akashi, I Okamoto, T lwasa, et a1．Enhancement of the antitumor activity of ionising radiation by nimotuzumab, a humanised monoclonal antibody to the epidermal growth factor receptor, in non-small cell lung cancer cell lines of differing epidermal growth factor receptor status [J]．British Journal of Cancer (2008) 98, 749-755. [2] Perez-soler R, Ling Y, Lia M. Molecular mechanisms of resistance to the HER/EGFR tyrosine kinase inhibitor erlotinib HCL in human cancer cell lines[J]. Proc Am Soc Clin Oncol,2003:22,190 [3] Nathan TI, Gillian PM, Margareta IB. The phosphatidylinositol3kinase inhibitor PX 866 overcomes resistance to the epidermal growth factor receptor inhibitor gefitinib in A549 human non-small cell lung cancer xenografts［J］. Mol Cancer Ther, 2005,4(9):1349-1357. [4] Normanno N, De LA, Maiello MR, et al. The MEK/MAPK pathway is involved in the resistance of breast cancer cells to the EGFR tyrosine kinase inhibitor gefitinb［J］. J Cell Physiol, 2006,207(2):420-427.

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