College of Life Science CRISPR-Cas9基因编辑技术在鱼鳞病治疗中的应用探索 冯榕妮 张欣蕊 College of Life Science

目录 Contents PART 03 PART 01 PART 02 Discussion Introduction Materials and methods

实验摘要 实验创新 第一部分 Introduction

摘要：鱼鳞病的病因可归纳为几大因素：遗传，精神神经，化学，内分泌，感染因素或外环境因素等等，可见 此病的发病因素是多方面的。表皮松解性鱼鳞病(EHK)是一种显性的基因KRT1或KRT10突变导致的皮肤脆性疾病。 目前还没有明确的针对这些基因缺陷的修复疗法。本实验主要是探究利用基因编辑技术剔除掉该基因，从而达到 治愈的目的。基因编辑技术是一种可以在基因组水平上对DNA序列进行改造的遗传操作技术。也称为基因打靶。 技术的原理是构建一个人工内切酶，在预定的基因组位置切断DNA,切断的DNA在被细胞内的DNA修复系统修复 过程中会产生突变，从而达到定点改造基因组的目的。特异性靶向KRT1或KRT10基因组保守区域的CRISPR- Cas9基因编辑系统。 关键字：基因编辑技术 鱼鳞病 KRT1/KRT10 CRISPR-Cas9基因编辑技术

点 实验创新 创新 基因组编辑三大技术：CRISPR、TALEN和ZFN。 任何对基因进行特异性修饰的工具都是由两个部分组成:1DNA特异性识别结合域2核酸内切酶活性区域 ZFN =DNA识别域+核酸内切酶 TALEN =DNA识别域+核酸内切酶 CAS9 =DNA识别域+核酸内切酶 本实验采用CRISPR-Cas9基因编辑技术进行基因组编辑

ZFN =DNA识别域+非特异性核酸内切酶 由一系列 Cys2-His2锌指蛋白(zinc-fingers)串联组成(一般 3~4 个)，每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。 核酸内切酶： 非特异性核酸内切酶Fokl，形成二聚体时切割双链DNA。

TALEN =DNA识别域+非特异性核酸内切酶

TALEN =DNA识别域+非特异性核酸内切酶

TALEN =DNA识别域+非特异性核酸内切酶

TALEN的技术特点 任意敲除，无基因序列、细胞、物种限制，永久失活 成功率高，在保证转染效率的前提下，有效性可达95%以上 打靶效率高，可完全替代RNAi技术脱靶率低，尚未发现明显脱靶效应 周期短，只需按照常规构建质粒方法构建Talen质粒 TALEN =DNA识别域+非特异性核酸内切酶

CRISPR-Cas9=DNA识别域+核酸内切酶 DNA识别域:向导RNA 核酸内切酶: Cas9核酸内切酶 引导RNA由两部分组成: CRISPR RNA (crRNA)和反式作用CRISPR RNA ( transacting CRISPR RNA,tracrRNA) crRNA-端与双链核苷酸互补结合，另一端与tracrRNA互补结合，形成向导RNA。

Cas9蛋白与向导RNA结合、组装的动作是这套位点特异性的基因组修饰过程里的限速步骤。 CRISPR-Cas系统靶向要求: PAM序列 PAM序列只有3个碱基: NG G。 靶序列后面必须为N G G才能被向导R N A识别。 在人类基因组中平均每8个碱基就可以出现一个NGG PAM序列为 5'-NGG一3' 靶序列后面必须为NGG才能被向导R N A识别。

最近有研究发现，crRNA 和tracrRNA可以被“改装”成一个向导RNA (single-guide RNA, sgRNA)。这个sgRNA足以帮助Cas9内切酶对DNA进行定点切割。而且可以将sgRNA和Cas9装在同-一个表达质粒中表达。 CRISPR-Cas 系统优势 ZNF成本高昂，效率低。 Cas9的效率是TAL EN的5倍。 sgRNA全长不超过100bp，构建更容易 而且从实际应用的角度来说，CRISPRs比TALENs更容易操作，因为每一对TALENs都需要重新合成，而用于CRISPR的gRNA只需要替换20个核苷酸就行。 这种RNA介导的Cas9酶切作用能够在多种类型的细胞和生物体内正常地行使功能，在完整基因组上的特定位点完成切割反应。

选题背景 EHK是一种遗传性皮肤病，发病率为1:20万。这种疾病由于显示隐性，表现为基底上表皮细胞的细胞骨架脆弱KRT1或KRT10突变。目前的治疗依赖于症状管理和伤口护理，仅提供临时解决方案。 虽然罕见，但已经有几个EI隐性病例被描述。相关突变的共同邻近性导致了一个隐性EI“热点”，位于KRT10外显子6 。这些突变的杂合子表现为表型正常的表皮结构和分化，尽管KRT10表达减少了50%。这提倡将KRT10作为基因干扰EI治疗的靶点。 细胞发生位置:17q21.2，是17号染色体21.2位置的长(q)臂 分子位置:17号染色体上的碱基对40,818,117至40,822,621

研究方案 可行性预测思路： 特异性靶向KRT1或KRT10基因组保守区域的CRISPR-Cas9基因编辑系统, 不仅能够有效抑制病毒复制, 相比其他基因编辑工具, 设计也更加简单灵活, 成为了一个十分具有吸引力的治疗选择. 本实验将探究现有CRISPR-Cas9系统在抗鱼鳞病中的研究, 并探讨其可能面临的问题与潜在的解决方案。 具体实验流程： 1、设计识别靶位点的一对DNA Oligos 2、构建可表达sgRNA的质粒 3、sgRNA活性检测 4、利用Cas9质粒建立knock-out细胞系

理论分析 实验方案 实验步骤 第二部分 材料方法 Materials and methods 实验难点

理论分析 3、sgRNA活性检测 4、利用Cas9质粒建立knock-out细胞系 脱靶分析显示在预测的位点没有Cas9活性 1、设计识别靶位点的一对DNA Oligos 脱靶分析显示在预测的位点没有Cas9活性 KRT10敲除 经纠正的EI单细胞克隆显示了疾病表型的逆转 2、构建可表达sgRNA的质粒

实验方案 小鼠异种移植 T7EI化验 蛋白分离和Western blot分析 热应力单层膜的免疫荧光分析 基因分型与单细胞克隆分析 细胞培养、转染、克隆扩增和分化细胞系的核型分析流仪结果 小鼠异种移植 T7EI化验 蛋白分离和Western blot分析 热应力单层膜的免疫荧光分析 基因分型与单细胞克隆分析

实验步骤 从一名携带KRT10外显子1杂合突变(c.481_486delTTGGAC)的男性患者和一名健康角质形成细胞(NKc11)的人类永生EI角质形成细胞(EH31)在低传代时被接收，进行培养。通过对一名携带KRT10杂合突变(c.1333G> a)的EI女性患者(IX)的皮肤活检获得原发性角质形成细胞。这些细胞在CNT-PR培养基中培养，不添加任何补充剂或抗生素。对每个样本进行KRT10测序，以验证各自的突变。使用MycoAlert PLUS支原体检测试剂盒进行分枝杆菌检测。 将人角质形成细胞与Cas9质粒转染，并进行永世化和初级角质形成细胞克隆扩增。分析前培养原代单细胞克隆14-21天。为了鉴别，样品在没有补充或抗生素的CNT-PR培养基中培养5-7天。在融合前一天，培养基与CNT-PRD培养基(CELLnTEC)交换。融合时加入1.2 mM Ca2+维持7天。 然后依次进行细胞系的核型分析、流仪结果、T7EI化验、基因分型与单细胞克隆分析、小鼠异种移植、蛋白分离和Western blot分析、RNA分析、热应力单层膜的免疫荧光分析、异种移植的分析等。

脱靶分析显示在预测的位点没有TALEN活性 实验难点 krt10特异性Cas9的选择与设计 脱靶分析显示在预测的位点没有TALEN活性 筛选正确修饰的角质形成细胞克隆

基因编辑可以有效地引入移码突变使其失活突变基因，这可以用来对抗显性遗传疾病的影响EI。为EI患者开发一种治疗方法 第三部分 Discussion

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