RNA 在病原微生物检测中 的应用. 摘要  主要分子检测技术原理及差异  RNA 扩增技术用于病原体检测的优势  国内外病原体检测现状  RNA 扩增技术在临床中应用  小结.

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1 RNA 在病原微生物检测中 的应用

2 摘要  主要分子检测技术原理及差异  RNA 扩增技术用于病原体检测的优势  国内外病原体检测现状  RNA 扩增技术在临床中应用  小结

3 摘要  主要分子检测技术原理及差异  RNA 扩增技术用于病原体检测的优势  国内外病原体检测现状  RNA 扩增技术在临床中应用  小结

4 病原体检测方法分类  以看到 “ 整个病原体 ” 为基础的方法 镜检，培养  以直接或间接看到 “ 病原体组分－蛋白质 ” 为基础 的方法 免疫学 » 胶体金， Elisa, 化学发光， etc  以看到 “ 病原体组分－核酸 ” 为基础的方法 分子生物学

5 分子诊断概念和特点  概念：利用标本中的 核酸 作为检测对象，对感染 性疾病、肿瘤、遗传性疾病等进行诊断和预后判 断的方法。 特点： 特异性高、灵敏度高 诊断范围广、适应性强

6 什么是核酸？  链状分子  DNA ( 脱氧核糖核酸 ) 贮存遗传信息  RNA ( 核糖核酸 ) 传递遗传信息 遗传信息的传递途径 DNA RNA 蛋白质 转录逆转录

7 DNA vs. RNA （一）  DNA 是双螺旋结构， RNA 是单链结构  DNA 很稳定， RNA 很不稳定

8 DNA vs. RNA （二）  有些 RNA 在细胞中拷贝数很多 一个或几个拷贝 DNA 10 4 核糖体 RNA (rRNA) 16S rRNA 23S rRNA 使用 rRNA 为靶标，可以大大提高了取样效率和检测灵敏度。

9 常见的 RNA 检测技术  NASBA （国外）  TMA （国外）  SAT （国内）

10 SAT 技术原理 ① ② ③ ④ ①同一温度下，首先通过 M-MLV 反转录酶产生靶标核酸（ RNA ） 的一个双链 DNA 拷贝。 ②然后利用 T7 RNA 多聚酶从该 DNA 拷贝上产生多个（ 100 ～ 1000 个） RNA 拷贝； ③带有荧光标记的探针和这些 RNA 拷贝特异结合，产生荧光。 该荧光信号可由荧光检测仪器 实时捕获，直观反映扩增循环 情况； ④同时，每一个 RNA 拷贝再从反 转录开始进入下一个扩增循 环。

11 SAT 与 PCR 技术原理比较 RT RNA cDNA RT ~1000 copies T7 SAT DNA Taq PCR 30 分钟内 扩增 10 10 倍 RNA DNA

12 SAT 配套仪器 ( 全自动工作站 )  样本 --- 提取纯化 RNA--- 酶反应混合液（一体化）  全封闭  生物安全性好  快（ 48 个样本 /2.5 小时）

13 摘要  主要分子检测技术原理及差异  RNA 扩增技术用于病原体检测的优势  国内外病原体检测现状  RNA 扩增技术在临床中应用  小结

14 DNA 用于临床检验的不足  “ 死菌检测也阳性 ” ，与临床相关性差  基因型与表型不吻合 ( 耐药检测 )  不能区分 “ 潜伏感染 ”“ 活动性感性 ”  易交叉污染  反应易受抑制

15 SAT 检测靶标为 16SrRNA 灵敏度更高 RNA 在细胞中拷贝数很多，细菌中 16s rRNA 多达 10000-20000 个 一个或几个拷贝 DNA 10 4 16s rRNA

16 Jensen, 1994 - 16SrRNA 具有高度保守性 - 不同来源 MG 的 16SrRNA 区域， PCR 产物序列同源性 100% ， 准确区别不同病原体 SAT 检测靶标为 16SrRNA 检测特异性高

17 16SrRNA 长度适中，适合做探针，检 测更准确 其编码基因长度约为 1500bp, 包 含 50 个左右功能域

18 RNA 诊断（ TMA 、 SAT ）具有非常高的灵敏度 和准确度 Gen-probe: RNA 检测罗氏 :DNA 检测

19 与 DNA 相比， RNA 检测更利于疗效评估 及判愈  DNA 双链结构，较稳定，不易降解。治愈后仍有 “ 死菌 ” 残留，人体内完全代谢需 2-3 周时间 > 中指出，如用 PCR 方法进行判愈，需在疗程结束后 3-4 周。  RNA 单链结构，易降解，病原体死亡后 2-3 天后完全降 解 与临床相关性好， =“ 培养 ” ，有利于疗效评估和及时判愈  有些情况下，可以直接诊断 “ 活动性感染 ” 活动性感染：指示 RNA 转录活跃 潜伏感染：指示 RNA 不转录

20 能检测多种样本类型，比如尿液等，取样方便。 数据来源： M. Chernesky, D. Jang, K. Luinstra, et al. 2006. High Analytical Sensitivity and Low Rates of Inhibition May Contribute to Detection of Chlamydia trachomatis in Significantly More Women by the APTIMA COMBO 2 Assay. J. Clin. Microbiology 44 (2): 400- 405. 反应不易受抑制

21 SAT 诊断技术对于病原体检测中的优势 SAT 产品特点 SAT 的优势带给临床的益处 检测靶标： 16SrRNA 灵敏度高, 特异性更强 活菌检测 反映临床用药的疗效 结果准确度高 早期诊断检出率高 用药治疗后准确及时的判愈 扩增产物： RNA 产物易降解，减少实验室 污染风险 维护实验室质控水平 反应不易受抑制检测样本多样化（拭子、 尿液） 取样方便 提高了医生的工作效率 减轻了病人取样带来的痛苦 扩增方式： 42 ℃恒温降低实验室设备要求 缩短检测时间 自动化操作更易实现 报告更快速、更准确 避免了人工操作带来的误差

22 摘要  主要分子检测技术原理及差异  RNA 扩增技术用于病原体检测的优势  国内外病原体检测现状  RNA 扩增技术在临床中应用  小结

23  国内外 RNA 诊断产品监管机构认可情况 国外： FDA 或 CE 认证产品 （ TMA ） 国内： SFDA 认证 产品 （ SAT ） 沙眼衣原体（ CT ）核酸检测试剂盒（ RNA 恒温扩增） 淋病奈瑟菌（ NG ）核酸检测试剂盒（ RNA 恒温扩增） 解脲脲原体（ UU ）核酸检测试剂盒（ RNA 恒温扩增） 生殖支原体（ MG) 核酸检测试剂盒 （ RNA 恒温扩增） 结核分枝杆菌（ TB ）核酸检测试剂盒（ RNA 恒温扩增） 肠道病毒 71 型（ EV71 ）核酸检测试剂盒（ RNA 恒温扩增） 柯萨奇病毒 A16 型（ CA16 ）核酸检测试剂盒（ RNA 恒温扩增） 肠道病毒（ EV ）通用型核酸检测试剂盒（ RNA 恒温扩增） 肺炎支原体（ MP ）核酸检测试剂盒（ RNA 恒温扩增）...... 为什么我们必须熟悉和了解 RNA 检测技术？（一）

24 为什么我们必须熟悉和了解 RNA 检测技术？（二） 血液筛查市场 美国 中国 RNA 诊断 传统技术 其他传染病市场（优生优育： CT/NG 为例） RNA 诊断 传统技术 美国 中国 100% 进口！ 有部分国产  国内外 RNA 诊断产品应用情况

25  RNA 用于 CT/NG 的检测（ TMA ）是目前行业公认的 “ 金标准 ” 为什么我们必须熟悉和了解 RNA 检测技术？（三）  TMA （ APTIMA Combo 2 ） 被广泛的应用于 CT/NG 检测。  在美国， 85% 的顶级医院使用 TMA 进行 CT/NG 检测  没有竞争对手可以超过 TMA ，是目前市场上最好的 CT/NG 检测产品  新方法学 CT/NG 的产品临床试验都必须选择 TMA （ APTIMA Combo 2 ）做参比试剂 数据来源于 Internal training ， Gen-probe

26  RNA 用于 TB 的检测（ TMA ）进入多国诊疗指南  2009 ：美国 CDC 更新 NAAT 法在 TB 实验室诊断中应用的指南 —— 所有疑似 TB 的初诊病人，除了做涂片之外，都必须用 TMA 检测至少一份样本。 （ TMA 获得 FDA 认证可检测涂阴、涂阳标本， PCR 只获得 FDA 认证可检测涂阳标本 ） 为什么我们必须熟悉和了解 RNA 扩增技术？（四） Updated Guidelines for the Use of Nucleic Acid Ampflication Test in the Diagnosis of Tuberculosis (2009) United States

27 摘要  主要分子检测技术原理及差异  RNA 扩增技术用于病原体检测的优势  国内外病原体检测现状  SAT 扩增技术在生殖道支原体检测优势  结论

28 国内唯一上市 MG 诊断试剂  结果准确 检测靶标 —16SrRNA ，灵敏度高，特异性强  取样方便 女性：阴道拭子、宫颈拭子、尿液 男性：尿道拭子、尿液  疗效判愈 检测靶标为 RNA 只有 “ 活菌 ”RNA 才能被检测 治愈后 2-3 天， RNA 在体内完全降解  上市时间 —2014 年 4 月

29 SAT 检测 MG 阳性的患者与测序基本一致 对女性尿液和宫颈拭子同时检测进行 SAT 检测结果与测序结果分析如下 测序结果 合计 阳性阴性 尿液和宫颈拭子 SAT 结果 阳性 430 阴性 5249254 合计 48249297 阳性符合率 =43/ （ 43+5 ） *100%=89.58% 阴性符合率 = 297/ （ 297+0 ） *100%=100% 准确度 = （ 43+249 ） /297*100%=98.32%

30 SFDA 唯一批准可用于尿液检测的核酸 试剂 对女性同一患者的尿液样本和宫颈拭子样本同时检测与尿液和阴道拭 同时检测 SAT 检测结果对比分析如下 尿液和阴道拭子 MG-SAT 结果 合计 阳性阴性 尿液和宫颈拭 子 MG-SAT 结 果 阳性 39443 阴性 5249254 合计 44253297 女性同一患者样本一致性符合率 =(39+249)/297*100%=96.97%

31 SAT 检测利于用药监测与判愈 RNA 很快降解 用药监测和判愈 提高医院诊疗水平 降低患者诊治成本 检测方法可否监测原因 镜检法否不能判断是否活菌 培养法是尽管活菌才能培养，但灵敏不足 金标法否假阴性率偏高 PCR 否有效治疗后, 细菌 DNA 至少需要 3 周降解 SAT 是有效治疗后, 细菌

32 SAT—MG 检测给临床带来意义 特点获益 兼顾拭子及尿液样本检 测 1 扩大了患者类型（孕妇、未婚女性及未成年人） 2 减轻病人痛苦，保护隐私（男性患者） 3 降低了医生的工作量 4 无创式取样，减少取样带来的风险 靶标为 16SrRNA 灵敏度高、特异性强，保证了结果的准确性，提高了 医院的诊疗水平，避免了诊断错误带来的医疗纠纷 病原体死亡， RNA 很快 降解 : 与临床相关性好 1 可以区分 “ 死菌 ” 、 “ 活菌 ” 2 避免了结果假阳性的过度治疗，减少了抗生素滥用 3 降低了患者的治疗成本 4 为医生临床判愈提供指导 2.5 个小时出结果为医生快速诊断提供依据，方便医生及时治疗，减轻 病人痛苦

33 结论  取样方便、自动化操作、准确性高是病原体分子诊 断的发展趋势。  RNA 诊断技术，包括 SAT ，应用于病原微生物检测 具有明显的优势。  我们预期，在接下来的十年里， RNA 诊断技术将对 传染病的诊断带来革命性的变化。

34 谢谢！