前 言 WNT 通路拮抗剂 SFRPs 家族甲 基化状态与贲门癌关系的研究 食管鳞癌 TGF-β 受体Ⅰ、Ⅱ基因启动 子区甲基化状态研究 河北医科大学第四医院 河北省肿瘤研究所 董稚明 冀医四院.

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1 前 言 WNT 通路拮抗剂 SFRPs 家族甲 基化状态与贲门癌关系的研究 食管鳞癌 TGF-β 受体Ⅰ、Ⅱ基因启动 子区甲基化状态研究 河北医科大学第四医院 河北省肿瘤研究所 董稚明 冀医四院

2 我国是世界上食管癌发病 率和死亡率最高的国家 缺乏有效的早期诊断指标，就 诊病人失去了最佳治疗时机 95% 以上食管癌为食管鳞状 细胞癌（ ESCC) 冀医四院

3 并非所有暴露 个体均患病 环境因素与遗传因素共同作用 食管癌 遗传因素和表观遗传因素 亚硝胺类化合物 吸烟、饮酒 营养缺乏 霉菌感染 冀医四院

4 传统的多途径多步骤的基因突变引起肿瘤的观点日 益受到挑战，目前众多的研究者认为，肿瘤最早的 发生可能源于干细胞阶段的表观遗传学改变，表观 遗传学的改变可能发生的更早些。 RNA 干扰 DNA 甲基化 组蛋白修饰 染色体重塑 冀医四院

5 DNA 甲基化是在 DNA 甲基转移酶的作用下, 以 S- 腺苷甲硫氨 酸为甲基供体, 将甲基基团转移到胞嘧啶第 5 位碳原子上, 从而 转变成 5- 甲基胞嘧啶（ 5-mC ）。 基因启动子区域的 CpG 岛正常状态下不发生甲基化，一旦由 于某种原因而发生甲基化就会导致基因转录沉寂，使重要基 因如抑癌基因、修复基因等丧失功能，有可能导致肿瘤发生。 冀医四院

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7 头颈部鳞癌、胃癌及胰腺癌细胞株中 TβR Ⅰ基因甲基化 与其表达降低有关。 对非小细胞肺癌、前列腺癌的研究显示， TβR Ⅱ基因 的表达缺失与其甲基化之间存在高度相关性。 小细胞肺癌中 TβR Ⅰ和Ⅱ表达缺失与基因甲基化无关。 冀医四院

8 研究目的 本研究应用甲基化特异性 PCR 反应 (MSP) 和 RT-PCR 技 术检测食管鳞状细胞癌组织中 TGF-β 受体Ⅰ、Ⅱ基因 (TβR Ⅰ、 Ⅱ ) 启动子区甲基化状态和 mRNA 表达水平，并结合临床 资料探讨其与临床病理资料的关系，为确定 TβR Ⅰ、Ⅱ甲 基化与 ESCC 发生发展之间的关系提供理论依据。 冀医四院

9 65 例贲 门癌组 织、 59 例相应 癌旁组 织 性别：男性 51 例，女性 14 例 TNM 分期：Ⅰ、Ⅱ期 37 例，Ⅲ、Ⅳ期 28 例 病理分级：高、中分化组 55 例，低分化组 10 例 年龄：范围在 26-74 岁，中位年龄 57.4 岁 冀医四院

10 基因 CpG 状 态 引物序列（ 5’—3’ ） 退火 温度 ( ℃ ) 产物大小 (bp) TβR Ⅰ U CAACCCTCCAAAACTAACAACTAAACAA 60 147 TGTTGGTTTTTGGTTATGTTTTATGTTTTTT M ACCCTCCGAAACTAACGACTAAACGA 52 142 CGGTTTTTGGTTACGTTTTACGTTTTT TβR Ⅱ U TTGAAAGTTGGTTAAAGTTTTTGGA 55 123 AAACAAAACCTCTCTCCACCCA M GAAAGTCGGTTAAAGTTTTCGGA ACAAAACCTCTCTCCGCCCG 53119 冀医四院 TβR Ⅰ和 TβR Ⅱ基因 MSP 引物

11 Methylation analysis of TβR Ⅰ and TβR Ⅱ in tumor tissue (T) and corresponding normal tissues (N). u: indicates the presence of unmethylated genes; m: indicates the presence of methylated genes. Cases 1: tumor-specific methylation; Case 2: the tumor is fully methylated, whereas the corresponding normal tissue has a very faint band demonstrating methylation; Case 3: both of tumor and corresponding normal tissue unmethylated. case 1 case 2 case 3 冀医四院 TβR Ⅰ TβR Ⅱ case 1 case 2 case 3

12 Unmethylated Methylated 原始序列： GGGGAGCGTGGGGCGTGGCCAGAAACCGG 非甲基化序列： AAAAAACATAAAACATAACCAAAAACCAA 甲基化序列： AAAAAACGTAAAACGTAACCAAAAACCGA 冀医四院 Unmethylated TβR Ⅰ Methylated TβR Ⅱ 原始序列： TCGGGCGGAGAGAGGTCCTGC 非甲基化序列： TTGGGTGGAGAGAGGTTTTGT 甲基化序列： TCGGGCGGAGAGAGGTTTTGT

13 Frequency of TβR Ⅰ, Ⅱ gene methylation in ESCC and adjacent non-cancerous tissues Gene Methylation ratio χ 2 P tumor tissueadjacent non- cancerous tissue TβR Ⅰ 52.3% （ 34/65 ） 40.7%(24/59) 1.6800.195 TβR Ⅱ 70.8%(46/65)47.5%(28/59) 6.9840.008 冀医四院

14 The relationship between TβR Ⅰ, Ⅱ gene methylation and clinical data in ESCC Group TβR Ⅰ TβR Ⅱ NMUχ2χ2 PMUχ2χ2 P ESCC6534314619 Age ＜ 60 371720289 ≥60281711 1.3930.2381810 1.0000.317 Gender Male5126253516 Female1486 0.1670.683113 0.1540.694 Clinical stage Ⅰ+ⅡⅠ+Ⅱ 3721162710 Ⅲ+ⅣⅢ+Ⅳ 281315 0.6820.409199 0.2020.653 Differential degree Well - moderately5530254015 Poorly1046 0.2530.61564 0.1900.663 冀医四院

15 Frequency of TβR Ⅰ, Ⅱ gene methylation in common in ESCC and adjacent non-cancerous tissue Group TβR Ⅰ and Ⅱ gene Simultaneous methylation Non-simultaneous methylation χ2χ2 P tumor tissue 31(47.7%)34 3.8210.051 Non-cancerous tissue 18(30.5%)41 冀医四院

16 The relationship between TβR Ⅰ, Ⅱ gene methylation in common and clinical dates in ESCC Group TβR Ⅰ and Ⅱ gene Simultaneous methylation Non-simultaneous methylation χ2χ2 P Differential degree Well -moderately2827 0.7630.382 Poorly37 Clinical stage Ⅰ+ⅡⅠ+Ⅱ 1918 0.4610.497 Ⅲ+ⅣⅢ+Ⅳ 1216 冀医四院

17 目前认为 DNA 甲基化主要在转录水平 抑制基因的表达， TGF-β 受体Ⅰ、Ⅱ基因 的甲基化对其 mRNA 的表达是否有影 响呢？ 冀医四院

18 基因 引物序列（ 5’ － 3’ ）退火温度 ( ℃ ) 产物大小 (bp) TβR Ⅰ GGAGAAGAAGTTGCTGTTAAG 57 419 ATGGTATCTGTGGCTGAATC TβR Ⅱ CAACATCAACCACAACACAGAG 54 248 CCGTCTTCCGCTCCTCAG GAPDH GGGAAACTGTGGCGTGAT 60 342 GTGGTCGTTGAGGGCAAT TβR Ⅰ和 TβR Ⅱ基因 RT-PCR 引物 冀医四院

19 RT-PCR analysis of TβR Ⅰ ma:100bp DNA marker; 1,3,5,6: positive mRNA expression; 2,4: negative mRNA expression 冀医四院 RT-PCR analysis of TβR Ⅱ ma:100bp DNA marker; 1,3,5,6: positive mRNA expression; 2,4: negative mRNA expression

20 The expression of TβR Ⅰ, Ⅱ mRNA in ESCC tumor and adjacent non-cancerous tissues GeneTumor tissue adjacent non- cancerous tissue tP TβR Ⅰ 0.77±0.170.99±0.31-3.3930.001 TβR Ⅱ 0.89±0.301.10±0.29-2.3580.022 冀医四院

21 Gene ESCC tP MethylatedUnmethylated TβR Ⅰ 0.74±0.180.81±0.15-1.2870.206 TβR Ⅱ 0.86±0.330.95±0.20-0.9220.362 The relationship between methylation and mRNA expression of TβR Ⅰ and Ⅱ 冀医四院

22 本研究结果显示食管鳞癌组织中 TβR Ⅱ的甲基 化率高于癌旁组织，其 mRNA 的表达量也明 显低于癌旁组织，但是发生甲基化的癌组织 与未发生甲基化的癌组织相比，其 mRNA 表 达虽然降低，但却无统计学差异。 冀医四院

23 部分肿瘤组织可能由于基因启动子区甲基化 程度不足以抑制转录而导致了发生甲基化的 组织其 mRNA 表达仍可为阳性。 1 除了甲基化外，可能还有其他使该基因表达 下调的遗传学和表观遗传学改变，如基因突 变、组蛋白乙酰化等。 2

24 结 论 结 论结 论 TβR Ⅰ基因 mRNA 表达异常可能与食管鳞癌的发生有关, 但 其甲基化可能在食管鳞癌的发生发展中不起主要作用。 TβR Ⅱ基因的甲基化和蛋白表达异常可能与食管鳞癌的 发生有关，但其甲基化有可能不是导致其蛋白表达异 常的主要原因。 冀医四院

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