辨別子代為同型合子或異型合子 Homozygote / heterozygote PCR 指導教授：傅士峯老師 助教：呂學宇、張凱雅 值日組： G10 植物生理學實驗 10 2016.05.25.

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1 辨別子代為同型合子或異型合子 Homozygote / heterozygote PCR 指導教授：傅士峯老師 助教：呂學宇、張凱雅 值日組： G10 植物生理學實驗 10 2016.05.25

2 實驗目的 利用 real-time PCR 的 HRM 分析，辨別耐熱型 青花菜雜交後第一子代 (F1) 屬於同型合子或 異型合子，並且判斷基因較似於母方還是 父方 2016.05.25

3 雜交理論 (Hybrid vigor) 美國遺傳學者 East & Shull 提出  East-Shull 理論 定義： 雜交子代所表現出的各種性狀均優於雜交 親代 AAaaAa

4 雜交理論 (Hybrid vigor) 雜交優勢表現在：  雜交子代的營養體大、生長速度快 ‚ 繁殖率優於親代 a. 農作物結果多，產量高 b. 家畜生產量多，存活率高 ƒ 適應環境能力高  有較強的抗逆力和競爭力  有利於農業生產的需要 雜交優勢出現在 F1

5 實驗原理 - real time PCR 即時偵測聚合酶連鎖反應  PCR 原理： 微量 DNA 當模板，設計 primer 找出目標基因後， 放大擴增 real time PCR 原理： (1) 目標基因片段≒ 150 b.p. (2) 每一個 cycle 偵測螢光訊號  Tm (melting temperature )  Ct (Cycle threshold) ‚ 敏感的非專一性螢光染劑 SYBR Green 2016.05.25 PCR Denaturation Annealing Extention Sybr Green

6 實驗原理 - real time PCR 即時偵測聚合酶連鎖反應 2016.05.25 Denaturation Annealing/Extention PCR cycle Denaturation Annealing Extention Tm Ct

7 實驗原理 -HRM 分析 高解析度溶解曲線標誌分析 (High Resolution Melt ) 2016.05.25

8 預期結果 溫度 父本 母本 F1

9 實驗器材 器材數量 PCR tube 3 管 離心管架 1 個 廢液杯 1 個1 個 100  l tip 1 盒1 盒 1 盒1 盒 Syber Green mix 1 管1 管 DNA (a, b, c) 3 管3 管 器材數量 10  l tip 1 盒1 盒 1 盒1 盒

10 實驗步驟 12345678910111213 6141819202124252627B35B6010 ♀ a ♂ b F1 c sample

11 實驗步驟  加 18  l 混合液於 PCR tube 後，再加 1  l DNA ll Syber Green 10 Primer F’ 1 Primer R’ 1 ddH 2 O 6 Total 18 DNA ： ♀ (a) 註：在蓋子寫上 組別和 DNA 1  l DNA + 19  l (18  l mix + 1  l DNA) DNA ： F1 (c)DNA ： ♂ (b) ll Syber Green 10 Primer F’ 1 Primer R’ 1 ddH 2 O 6 Total 18 19  l (18  l mix + 1  l DNA) 1  l DNA + ll Syber Green 10 Primer F’ 1 Primer R’ 1 ddH 2 O 6 Total 18 1  l DNA + 19  l (18  l mix + 1  l DNA)

12 實驗步驟 ‚ 混合均勻後，將 3 管 PCR tube 放到台前 ƒ 放入 real-time PCR 機器 „ 結果圖上傳至 「網路教學平台」 Real-time PCR condition 95 ℃ 10 min 95 ℃ 10 S 50 ℃ 10 S 72 ℃ 20 S HRM 70 - 85 ℃ 0.5 ℃ 40 cycles 註：在蓋子寫上 組別和 DNA

13 實驗結果  標示組別、父本、母本、子代 ‚ 判斷子代屬於同型合子或異型合子？為什麼？ ƒ 判斷子代較相似於父本還是母本？為什麼？ G1 6 ♀ a 6 ♂ a 6F1 a

14 問題與討論  片段越長 Tm 應該越高或越低 ? 為什麼 ? ‚ 孟德爾遺傳定律 A a 中 A 代表 1 個核甘酸差 異嗎 ? 為什麼 ?

15 報告繳交 報告格式： 實驗目的、原理、結果、問題討論、 補充資料（自行整理）、心得 繳交期限：下週 (6/1) 課程結束前

16 實驗原理 - 雜交理論 其雜交後代所表現出的各種性狀均優於雜交雙親， 比如抗逆性強、早熟高產、品質優良等，就稱之為 雜交優勢。雜交產生優勢是生物界普遍存在的現象 雜交優勢表現在三個方面：一是雜交後代的營養體 大小、生長速度和有機物質積累強度均顯著超過雙 親。這類優勢有利於農業生產的需要，但對生物自 身的適應性和進化來說並不一定有利。二是雜交後 代的繁殖器官優於雙親，例如農作物結籽多，產量 高；家畜產仔多，成活率高等。三是表現為進化上 的優越性，如雜交種的生活力強，適應性廣，有較 強的抗逆力和競爭力。上述三種優良性狀。一般說 來，雜交優勢都表現在雜交第一代，從第二代起雜 交優勢就明顯下降。因此，在農業生產上主要是利 用雜交第一代的增產優勢。 2016.05.25 雜交種子之生產是一種利用具有兩種遺傳特 徵之族系進行 交配﹐以進行商品化之生產。玉米是典型例子。 種子雜交是在開花期間﹐避免同株發生授粉﹐ 僅容許待交配 的品系花粉進行授粉。這兩種植物母本之特 性甚不相同﹐但經雜 交後之種子特性則具有兩母本之優良特性。 雜交種子通常生長較 均勻﹐其品質及產量均較原母本為高。 但雜交種子必須每年培育﹐雜交種子成長後﹐ 所產生下一代 種子則不具原雜交種子之特性﹐非但成長不 均﹐有些則恢後母本 的特性。故僅雜交的一代種子可以作為生產 之用。

17 現代農業生產上最早應用雜交優勢的是玉 米、水稻和小麥， 世人把雜交水稻、雜交玉米和矮稈小麥的 培育、傳播和獲取高產，稱之為 20 世紀的 “ 綠色革命 ” 現今世界農業生產上應用的多數新品種都 源於雜交育種；雜交優勢利用是選育高產 優質新品種的最有效最成熟的方法之一， 它在未來選育新品種工作中仍將起重要作 用