1 Mammalian expression vector speaker : Yen-chin Liu 劉 燕 琹.

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1 1 Mammalian expression vector speaker : Yen-chin Liu 劉 燕 琹

2 2 Mammalian expression vector ( 哺乳類動物細胞表現載體 ) 定義： 當 DNA 接入此種載體，經送入哺乳類動物細胞內， 而使此段 DNA 序列能夠表現出蛋白質 條件： 含有複製起始點 Ori → 能在寄主細胞內自行複製 有限制酶 (restriction enzyme) 切點 → 用於 DNA 切接 含有耐抗生素基因 → 以利篩選 安全無毒性 → 對寄主細胞無害

3 3 promoterRBSATG MCSTAA 含有起動子 (promoter) → 為 RNA polymerase 結合的地方， 是 DNA 轉錄為 RNA 之起始部位 含有核醣體結合區 (ribosome binding site, RBS) → mRNA 與 ribosome 結合後，由 mRNA 的 5 ´ →3 ´ 端逐一合成蛋白質 含有轉譯起始部位 ATG ；終止部位 TAA 、 TAG or TGA 含有多重選殖位 (multiple cloning sites, MCS) → 插入欲表 現基因 expression vector gene

4 4 在哺乳動物細胞上發展轉殖的目的： 為了 knockout 基因表現，將細胞內某一基因失去作用， 以瞭解某一基因在細胞內的功能 利用動物生產重要蛋白質，伴隨乳汁分泌出來，通常是 醫藥上的蛋白質 基因治療 (gene therapy) ，將健康的基因取代患者的遺 傳致病基因，使其遺傳病消失

5 5 依據外源基因 ( exogenous gene) 進入哺乳動物細胞的方式 分類： ( 一 ) Calcium phosphate-mediated transfection DNA 溶液 ( plasmid DNA ) 與 0.125 M CaCl 2 及 1.5 mM Na 2 HPO 4 混合形成 CaPO 4 / DNA 沈澱，用以感染哺乳動物細胞

6 6 ( 二 ) DEAE dextran-mediated transfection DNA 溶於分子量為 500 kD 的 diethylaminoethyl dextran 培養液 中， DNA 負電荷與 DEAE-dextran 結合被細胞吞入，因此容易 送入寄主細胞內 ( 三 ) Electroporation 將 plasmid DNA 混合於細胞懸浮液並置於一容器中，容器接 上 (+) 及 ( - ) 電以 2 ~ 4 kV 電壓在 4 ℃溫度之下通電 10 min ，約有 60 ~ 90 % 細胞經此通電處理可以存活，高電壓通電可以使 細胞膜有孔洞，因而 DNA 進入細胞內

7 7 ( 四 ) Liposome-mediated transfection 磷脂質溶於有機溶劑中經揮發形成一薄層，加入 DNA 溶液 並經超音波震盪可做成各種大小的脂球體 ( liposome ) ，內部 是 DNA 溶液而其外是磷脂雙層膜，此 liposome 攜帶 DNA 能經 由與細胞膜的融合，而將 DNA 送入哺乳動物細胞內 Liposome

8 8 以上方法均是以化學及物理方式，將帶有轉殖基因的 載體轉染哺乳動物細胞 優點： 能控制毒性 ( controlled toxicity ) DNA 大小沒有限制 ( unlimited DNA size ) 缺點： 獲得穩定的轉染細胞則需幾週至幾個月的時間 插入寄主染色體機率低 ( very low integration ) 基因傳遞效率低 ( very low transfected efficient )

9 9 ( 五 ) Viral vector-mediated transfection 利用 virus 可以感染哺乳動物細胞且快速的特性，將病毒 DNA 適當的剪接去除有害的片段，將外來 DNA 接入病毒 DNA 內，經感染而送入細胞內 http://www.nettally.com/prusty/gene.htm capsid

10 10 Viral vector 猿猴病毒 40 ( simian virus, SV40 ) 腺病毒 ( adenovirus ) 牛乳狀突病毒 ( bovine papilloma virus, BPV ) 反轉錄病毒 ( retrovirus )

11 11 猿猴病毒 40 ( simian virus, SV40 ) 又名猿猴空泡病毒 40 ( simian vacuolating virus 40) 源自恆河猴腎臟細胞內，但不影響本身細胞病變 直徑 45 nm 、 20 面體立體對稱 含 5243 個鹼基對組成的環狀雙股 DNA 為多瘤病毒 ( polyoma virus ) ，可誘發 多個部位或器官產生肉瘤或癌症 感染對象為倉鼠、大鼠、猴、人類等 第一個選殖病毒載體用於感染哺乳類動物

12 12 SV40 病毒基因體 ( SV40 genome ) 分為早基因及晚基因區域 早基因在病毒感染 寄主早期便能表現， 早基因產物為大 T 抗原 ( large T antigen ) 是促使病 毒 DNA 在容許性 細胞 ( permissive cell ) 中複製的因子。 晚基因僅於病毒 的 DNA 開始複製 後才表現。晚基 因會製造病毒的 被囊體 ( capsid ) 蛋白質，或稱病 毒的外殼。

13 13 SV40 病毒選殖載體實例 以 HindIII 與 BamHI 切割載體，插入兔子球蛋白基因 (β-globin gene ) 。原本在 HindIII 與 BamHI 切位間之片段 因此被移除，換上兔子之基因，此 viral vector 稱為 SVGT-5 。 重組的 SV40 病毒顆粒再去 感染猿猴腎細胞，使兔子 的 β-globin 得到高效表現。 SVGT-5 HindIII BamHI Late genes Early genes

14 14 腺病毒 ( adenovirus, Ad ) 大小為 36 kb 的線型雙股 DNA 病毒 直徑約 80 nm 、 20 面體立體對稱 可插入較大的外源 DNA 片段，還 可以在寄 主细胞中大量表現 能感染不分裂或具分裂能力的細胞 可以感染不同種類的細胞 感染對象為倉鼠、大鼠、人類等 serotype 有 Ad5 及 Ad2 ，安全性高，少致癌性 http://www.medgadget.com/archives/img http://www.brackeler.com/products/fid/2862

15 15 adenvirus genome adenovirus transfect host cell ‧‧‧ GCTAATCG ‧‧‧ 5´5´ 3´3´ protein 5.5 kD 約 100bp 的 ITR ( inverted terminal repeats) ← E1 →← E2 →← E3→ ← E4 → ITR

16 16 adenovirus 病毒選殖載體實例 Recombinant Human Adenovirus Type 5 Injection  商品名：安柯瑞  在刪除了 E1B 和 E3 區基因片段之後，能夠特異性地在腫瘤 細胞中複製、包裝及釋放，最終導致癌細胞裂解  在正常組織細胞中不能有效複製，因而無損傷作用  透過免疫系統，殺滅 癌細胞  用於治療鼻咽癌 http://big5.cancerotc.com.cn/news/20070522145625125.htm

17 17 牛乳狀突病毒 ( bovine papilloma virus, BPV ) 大小為 7.9kb 的雙股環狀 DNA 病毒 直徑約 55 nm 、 20 面體立體對稱 造成牛的皮膚病，卻可在老鼠細胞內形成多個病毒，而不 殺死老鼠細胞 帶有 exogenous gene 的 BVP DNA ，可獨立存在，不與老鼠 細胞的染色體合併 可插入較大的外源 DNA 片段，且載體基因不大，容易操作 感染對象為小鼠

18 18 BVP 病毒基因體 ( BVP genome )  分為早基因 ( E 區 ) 及晚基因 ( L 區 ) 區域。早基因，即長度為 5.5kb 的 BamHI-Hind III 片段，佔基因组總長的 69 % ，故叫做 BPV-69T  BPV 病毒 DNA 上如果插有 pBR322 質體的序列，則能往返大 腸菌及老鼠細胞間，作為能夠傳遞外來基因於這兩種生物 細胞的載體，也稱往返載體 ( shuttle vector ) Late genes Early genes Late genes Early genes http://sky.scnu.edu.cn/life/class/genetics/gene%20engineering/chaper8/5.htm BVP-pBR322

19 19 BVP 病毒選殖載體實例 若 HindIII 與 BamHI 切割載體，插入人 β-globin gene 到 BVP-pBR322 重組結構上。形成既能在 E. coli 及 mammalian cell 中複製的穿梭載體 BVP-BV1 。  刺激轉化效率提高約 500 倍  在每個細胞中的 copy number 可 保持在 10~30 份之間  轉化到 E. coli 後，可迅速回收 載體 DNA Human βglobin gene BVP-BV1

20 20 反轉錄病毒 ( retrovirus ) 線型正性單股 RNA( + ssRNA ) 病毒 內含兩條 8~11kb 的 + ssRNA 構成 直徑約 25 nm 、 20 面體立體對稱 可反轉錄為 (-)DNA ，再產生雙股 DNA dsDNA 會插入整合 ( integrated ) 到寄主細胞的染色體中 鳥類的脾壞死病毒 ( SNV ) 人類免疫缺失病毒 ( HIV ) 莫洛尼氏小鼠白血病病毒 ( Moloney murine leukemia virus, Mo-MLV )

21 21 retrovirus structure  ( a ) 反轉錄酶、 pol 基因產物  ( b ) 2 個 RNA 分子  ( c ) 脂質雙層膜  ( d ) 病毒外殼蛋白質 ( gag 基因產物 )  ( e ) 病毒外膜醣蛋白 ( env 基因產物 ) ( a ) ( b ) ( c ) ( d ) ( e ) lhttp://sky.scnu.edu.cn/life/class/genetics/gene%20engineering/pictures/chap%208/8-19.jpg

22 22 retrovirus transfection http://www.supermt.com.tw/edu/about%20biotech/viruse.pdf ( + ) ( — ) ( + )

23 23 retrovirus 病毒基因體 ( retrovirus genome )  5 ´ 端有 Cap ； 3 ´ 端有 poly (A)  gene order ： 5 ´ - gag – pol – env -3 ´  R region ： a short ( 18-250nt ) is terminally redundant  U5 ： a unique, non-coding region of 75-250nt  Primer Binding Site ： used to begin reverse transcription  Leader ： a relatively long ( 90-500nt ) non-translated region  Polypurine Tract ： responsible for initiating  U3 ： a unique non-coding region 5´3´

24 24 retrovirus 病毒選殖載體實例 http://adm.ncyu.edu.tw/~apmicro/academic/2005%20microbial%205.pdf A. 輔助型反轉病毒 RNA B. 反轉病毒 RNA 表現載體 包裝細胞株 釋放包裏外源基因 的病毒包裝載體 細胞受器 標的細胞 病毒 RNA 分子 反轉錄反應 病毒 DNA 分子 ( + ) 標的外源基因組 表達產物

25 25 Vectors used in gene therapy clinical trials

26 26 常見病毒基因轉殖載體的優、缺點

27 27 Thanks for your attention